附子中脂類(lèi)生物堿的電噴霧三重四極桿質(zhì)譜研究

葛京城，許慶軒，閆 靜,陳 鍵，何滟滪

(1. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2. 黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院，黑龍江 哈爾濱 150081)

2011-07-15；

2011-11-12

葛京城(1984～)，男(漢)，黑龍江雙鴨山人，碩士研究生，藥物分析專(zhuān)業(yè)。E-mail:hljflt@126.com

閆 靜(1962～)，女(漢)，黑龍江哈爾濱人，教授，從事藥物質(zhì)譜研究。E-mail:yanjing_002@163.com

附子中脂類(lèi)生物堿的電噴霧三重四極桿質(zhì)譜研究

葛京城1，許慶軒2，閆 靜1,陳 鍵1，何滟滪1

(1. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2. 黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院，黑龍江 哈爾濱 150081)

附子是常用的中藥藥物，其中含有的脂類(lèi)生物堿是附子中重要的活性成分。為了對(duì)附子中脂類(lèi)生物堿的復(fù)雜體系進(jìn)行快速分析，以附子中脂類(lèi)生物堿為研究對(duì)象，建立一種穩(wěn)定、高效、可靠的分析方法，本研究利用電噴霧三重四極桿質(zhì)譜的多種掃描功能(全掃描、子離子掃描、母離子掃描、中性丟失掃描)分析附子中脂類(lèi)生物堿。脂類(lèi)生物堿間的差別分兩種，其一是由于生物堿骨架不同導(dǎo)致的差別；其二是由于C8位所連接的脂肪酸的不同導(dǎo)致的差別。根據(jù)這兩種差別，分析出附子中含量最多的4類(lèi)生物堿骨架以及3類(lèi)C8位取代脂肪酸，共12種脂類(lèi)生物堿。三重四極桿質(zhì)譜的母離子掃描及中性碎片丟失掃描功能用于分析附子中脂類(lèi)生物堿，掃描速度快、效率高、一次掃描同時(shí)確定多種結(jié)構(gòu)，所得結(jié)果穩(wěn)定、可靠。

附子；脂類(lèi)生物堿；電噴霧質(zhì)譜；母離子掃描；中性丟失

制附子為毛茛科植物烏頭(Aconitum carmichaeliDebx)子根的炮制品，具有回陽(yáng)救逆、補(bǔ)火助陽(yáng)、散寒止痛等功效，用于亡陽(yáng)虛脫、肢冷脈微、心陽(yáng)不足等癥的治療[1]。制附子中含有3種類(lèi)型的生物堿，包括雙酯型生物堿、單酯型生物堿以及脂類(lèi)生物堿，其中雙酯型生物堿毒性最大。附子經(jīng)過(guò)炮制，雙酯型生物堿轉(zhuǎn)化為毒性較小的單酯型生物堿，脂類(lèi)生物堿的毒性介于雙酯型生物堿和單酯型生物堿之間[2-3]。Kitaagawa等[4]首先在川烏中發(fā)現(xiàn)了一類(lèi)雙酯型生物堿的C8位乙酰基被亞油酸等長(zhǎng)鏈脂肪?；〈纬傻难苌?，命名為脂類(lèi)生物堿(lipo-alkaloids)。王勇等[5]利用電噴霧質(zhì)譜技術(shù)分析附子及其復(fù)方四逆湯中脂類(lèi)生物堿的變化，證明了附子在復(fù)方配伍的過(guò)程中，脂類(lèi)生物堿發(fā)生酯交換反應(yīng)。越皓等[6-7]發(fā)現(xiàn)附子與甘草共煎后，脂類(lèi)生物堿含量顯著增長(zhǎng)。Kawata等[8]發(fā)現(xiàn)雙酯型生物堿在腸內(nèi)菌的作用下能夠轉(zhuǎn)變成脂類(lèi)生物堿，提示脂類(lèi)生物堿可能在體內(nèi)發(fā)揮藥理作用。因此可以推斷，脂類(lèi)生物堿是附子中重要的活性成分，并在附子復(fù)方配伍中發(fā)揮著重要的作用，對(duì)其進(jìn)行研究有助于揭示附子的炮制和配伍原理，揭示附子藥理作用與化學(xué)成分之間的關(guān)系。由于附子中脂類(lèi)生物堿種類(lèi)繁多，且結(jié)構(gòu)相似，因此液相色譜等常規(guī)方法難以對(duì)其進(jìn)行有效的分析。本研究應(yīng)用電噴霧三重四極桿質(zhì)譜的多種掃描功能(全掃描、子離子掃描、母離子掃描、中性丟失)對(duì)附子中脂類(lèi)生物堿進(jìn)行分析。

附子中主要含有的3種類(lèi)型C19二萜類(lèi)生物堿，其結(jié)構(gòu)示于圖1和表1[9-12]。附子中的雙酯型生物堿主要為次烏頭堿(hypaconitine,HA,[M+H]+=616)、去氧烏頭堿(deoxyaconitine,DA,[M+H]+=630)、中烏頭堿(mesaconitine,MA,[M+H]+=632)、烏頭堿(aconitine,AC,[M+H]=646)等。由于這些雙酯型的結(jié)構(gòu)極其相似，差別僅在于N原子聯(lián)接CH3或C2H5以及C3和C10位置是H或OH，因此其串聯(lián)質(zhì)譜也有著相似的裂解規(guī)律。以上4種雙酯型生物堿的最強(qiáng)子離子分別為m/z556、570、572、586，都是由C8位失去一分子乙酸所得。單酯型生物堿為雙酯型生物堿C8位乙?；馐ヒ宜崴?。脂類(lèi)生物堿(lipo-alkaloids)由雙酯型生物堿的C8位乙?；挥退?、亞油酸、亞麻酸或棕櫚酸等長(zhǎng)鏈脂肪酸取代后形成的。脂堿在質(zhì)譜子離子掃描中，C8位最容易斷裂，失去脂肪酸，所得子離子與雙酯型生物堿二級(jí)譜子離子相似，即它們含有相同的生物堿骨架結(jié)構(gòu)。

圖1 烏頭類(lèi)生物堿結(jié)構(gòu)式Fig.1 Constitutional formula of aconitum alkaloids

如果C8位取代基(圖1中OR4)轉(zhuǎn)變?yōu)镺H就是單酯型生物堿，當(dāng)C8連接的是長(zhǎng)鏈脂肪酸酯即為脂類(lèi)生物堿。

1 試驗(yàn)部分

1.1主要儀器與裝置

Waters UPLC-Quattro Premier三重四極桿質(zhì)譜：美國(guó)Waters公司產(chǎn)品，配有電噴霧離子源(ESI)及masslyns4.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。

表1 附子中部分已知的烏頭類(lèi)生物堿

1.2主要材料與試劑

制附子為黑順片：購(gòu)于哈藥集團(tuán)人民同泰藥店，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室鑒定為毛茛科植物烏頭(Aconitum carmichaeliDebx)子根的炮制品,使用前磨成粉末；甲醇(色譜純)：美國(guó)Fisher公司產(chǎn)品；乙醇、鹽酸、氯仿(分析純)：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.3試驗(yàn)條件

毛細(xì)管電壓：3.5 kV；錐孔電壓：55 V；萃取電壓：3 V；正離子電噴霧電離模式；源溫度：100 ℃；脫溶劑氣溫度：200℃；碰撞能量：55 V；注射泵流速：10 μL/min。

1.4樣品的制備

取500 g黑順片浸于95%乙醇中，超聲提取1 h，過(guò)濾得提取液，濾渣按上述方法處理兩次，合并提取液，蒸出乙醇，得到乙醇浸膏，加入200 mL 0.4%鹽酸水溶液，攪拌1 min，靜止1 h，抽濾得沉淀，將沉淀用100 mL 0.4%鹽酸水溶液清洗2次，溶于氯仿，用等量0.04%鹽酸水溶液萃取4次，蒸出氯仿，即得到脂類(lèi)生物總堿。取0.01 g脂類(lèi)生物總堿藥膏，溶于100 mL甲醇中，過(guò)0.45 μm濾膜，供電噴霧質(zhì)譜分析。

2 結(jié)果與討論

2.1脂類(lèi)生物堿的子離子掃描研究

脂類(lèi)生物堿全掃描圖示于圖2。m/z828、812、826、852、838、868等為脂類(lèi)生物堿中含量較高的成分。選取豐度最高的m/z828為例進(jìn)行分析。

圖2 脂類(lèi)生物堿的電噴霧質(zhì)譜全掃描圖Fig.2 ESI-MS/MS full scan chart of lipo-alkaloids

對(duì)m/z828離子進(jìn)行子離子掃描，示于圖3，得到的碎片離子為m/z572、540、512。m/z572離子是母離子的C8位失去一分子棕櫚酸所得；m/z540為母離子失去棕櫚酸和甲醇所得；m/z512為母離子失去棕櫚酸和甲醇以及CO所得，其裂解規(guī)律與中烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)品(mesaconitine,MA,[M+H]+=632)相似,根據(jù)參照文獻(xiàn)[13]可以確定m/z828的物質(zhì)為8-棕櫚酰-苯甲酰中烏頭原堿。

2.2脂類(lèi)生物堿的多種掃描方式研究

由于附子中脂類(lèi)生物堿有上百種之多，單純地使用質(zhì)譜子離子掃描功能確定其結(jié)構(gòu)工作量較大，因此本研究采用了多種掃描方式相結(jié)合的方法確定其結(jié)構(gòu)。許多脂類(lèi)生物堿都有相同的生物堿骨架，它們?cè)诖?lián)質(zhì)譜圖上具有相同的子離子，因此采用母離子掃描的方式確定其結(jié)構(gòu)更為方便。例如，對(duì)子離子m/z572進(jìn)行母離子掃描，示于圖4。這樣在全掃描圖中的脂類(lèi)生物堿中能產(chǎn)生m/z572子離子的母離子都可以?huà)呙璩鰜?lái)，m/z828、852、854等都是擁有相同子離子m/z572的脂類(lèi)生物堿。對(duì)圖4進(jìn)行放大，可以看到更多的脂類(lèi)生物堿信息，示于圖5。m/z868、884、870、866、882、886等都是擁有相同子離子m/z572(生物堿骨架)的脂類(lèi)生物堿。用掃描得到質(zhì)荷比數(shù)減去子離子質(zhì)量572得到的即是C8位取代的長(zhǎng)鏈脂肪酸質(zhì)量數(shù)。

圖3 m/z 828子離子掃描圖Fig.3 ESI-MS/MS daughter scan mass spectrum of the ion at m/z 828

圖4 m/z 572母離子掃描圖 Fig.4 ESI-MS/MS parent scan chart of the ion at m/z 572

同樣由于許多脂類(lèi)生物堿都含有相同的C8位取代基，所以在二級(jí)譜中會(huì)失去相同的中性碎片(C8位取代基)，因此采用中性丟失的掃描方式也可以快速獲得具有相同脂肪酸酯結(jié)構(gòu)的生物堿。中性丟失256 u的質(zhì)譜圖示于圖6，m/z828、812、826、842、810離子都含有棕櫚酸酯。以上質(zhì)荷比數(shù)減去256(棕櫚酸)所得即是其對(duì)應(yīng)的生物堿骨架。

圖5 m/z 572母離子掃描圖局部放大圖 Fig.5 Partial enlargement chart of parent scan at the ion m/z 572

圖6 中性丟失256 u掃描圖 Fig.6 The scan chart of neutral loss 256 u

例如，由于m/z828離子在子離子掃描中失去256 u(棕櫚酸)得到m/z572的子離子(生物堿骨架)，采用中性的碎片丟失和母離子掃描相結(jié)合的方法，分別對(duì)m/z572離子進(jìn)行母離子掃描，對(duì)m/z256(棕櫚酸)進(jìn)行中性丟失掃描，從而以m/z828為中心，在橫向(生物骨架)和縱向(C8位取代基)上擴(kuò)展開(kāi)，可以得到許多同8-棕櫚酰-苯甲酰中烏頭原堿具有相同生物骨架或者相同C8位取代基的脂類(lèi)生物堿。同樣可以采用兩種掃描方式相結(jié)合的方法對(duì)m/z812、826、852、838、868等脂類(lèi)生物堿進(jìn)行分析，均能得到大量的信息，從而可以確定多種脂類(lèi)生物堿。表2中列舉了采用上述方法所得的附子中12種脂類(lèi)生物堿，它們是由4類(lèi)不同的生物堿骨架分別與3類(lèi)不同的C8位取代脂肪酸相結(jié)合組成。

表2 附子中常見(jiàn)的幾類(lèi)生物堿骨架與C8位取代脂肪酸以及由其所組成的脂類(lèi)生物堿

樣品制備方法參照文獻(xiàn)[14]，根據(jù)脂類(lèi)生物堿具有長(zhǎng)酯鏈、極性小、難溶于水、溶于乙醇的特點(diǎn)進(jìn)行提取。通過(guò)乙醇超聲提取，雙酯型生物堿與脂類(lèi)生物堿被共同提取出來(lái)，根據(jù)雙酯型生物堿溶于酸水，而脂類(lèi)生物堿難溶于酸水的性質(zhì)，采用酸水處理、所得沉淀物溶于氯仿后酸水萃取的方法純化，此方法可以有效地將雙酯型生物堿與脂類(lèi)生物堿分離開(kāi)，得到較純凈的脂類(lèi)生物總堿。

在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的生物堿骨架和C8位取代脂肪酸有很多，表2中不能全部展現(xiàn)出來(lái)，只列舉出附子中含量相對(duì)多的、具有代表性的幾類(lèi)生物堿骨架和C8位取代脂肪酸。另外，在研究中發(fā)現(xiàn)某些脂類(lèi)生物堿具有相同的準(zhǔn)分子離子峰，如表2中，8-亞油酰-苯甲酰中烏頭原堿與8-油酰-苯甲酰脫氧烏頭原堿的準(zhǔn)分子離子峰都為852，但其生物堿骨架與C8為取代基均不相同，雖然準(zhǔn)分子離子峰都為852，但是卻包含了兩種不同的脂類(lèi)生物堿，采用本研究中的方法可以有效的將其區(qū)分開(kāi)來(lái)，獨(dú)立進(jìn)行分析研究，所得結(jié)果精準(zhǔn)、可靠。

3 結(jié)論

由于脂類(lèi)生物堿結(jié)構(gòu)相近，性質(zhì)相同，數(shù)量龐大，脂類(lèi)生物堿目前尚不能完全分離，只能合成得到，且合成條件苛刻，標(biāo)準(zhǔn)品十分難得，使用質(zhì)譜方法確定其結(jié)構(gòu)是目前最有效的方式；其次，串聯(lián)質(zhì)譜用于脂類(lèi)生物堿的結(jié)構(gòu)確證已經(jīng)有很多文獻(xiàn)報(bào)道[13，15-17]，并且普遍得到認(rèn)可。三重四極桿質(zhì)譜不同于離子阱質(zhì)譜，前者是空間上的串聯(lián)，后者是時(shí)間上的串聯(lián)，由于三重四極桿質(zhì)譜特殊的串聯(lián)方式，使其具有離子阱質(zhì)譜不具備的一些功能，如母離子掃描，中性碎片丟失掃描等，而人們往往只重視了三重四極桿質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)功能，忽略了其他功能，本研究采用母離子掃描及中性碎片丟失掃描功能分析了附子中脂類(lèi)生物堿，得到了良好的效果。掃描速度快、效率高、一次掃描同時(shí)確定多種結(jié)構(gòu)，為脂類(lèi)生物堿的定性研究以及今后研究脂類(lèi)生物堿在炮制、配伍中的變化規(guī)律提供了一種高效、快速的方法。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì). 中國(guó)藥典Ⅰ部[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：177-178.

[2] BISSET N G. Arrow poisons in China. Part II, Aconitum-Botany, chemistry, and pharmacology[M]. J Ethnopharmacology, 1981: 247-336.

[3] 祁明馥. 關(guān)于烏頭附子炮制機(jī)理的另一種解釋[J]. 中藥材，1986(6)：37-38.

[4] KITAGAWA I, YOSHIKAWA M, CHEN Z L, et al. Four new lipo-alkaloids from Aconiti tuber[J]. Chem Pharm Bull, 1982(30): 758-761.

[5] 王 勇，宋鳳瑞，劉志強(qiáng),等.四逆湯中脂類(lèi)生物堿來(lái)源于酯交換反應(yīng)的研究[J].中草藥，2006，37(1)：51-54.

[6] 越 皓，皮子鳳，趙宇峰,等.電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜分析附子炮制中的化學(xué)成分變化[J].分析化學(xué)研究報(bào)告，2007，35(7)：959-963.

[7] 越 皓，皮子鳳，宋鳳瑞,等.附子與不同藥味藥材配伍后烏頭堿類(lèi)生物堿的電噴霧質(zhì)譜分析[J].中草藥，2008，39(10)：1 474-1 477.

[8] KAWATA Y, MA C M. Conversion of aconitine to lipoaconitine by human intestinal bacteria and their antinociceptive effects[J]. J Trad Med, 1999(16): 15-23.

[9] 皮子鳳，越 皓，宋鳳瑞,等.附子不同配伍藥對(duì)中生物堿成分的電噴霧質(zhì)譜分析[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2007，42(2)：201-205.

[10] 王 勇，劉志強(qiáng)，宋鳳瑞,等.附子配伍原則的電噴霧質(zhì)譜研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2003，38(6)：451-454.

[11] 許慶軒，劉志強(qiáng)，王 勇,等.八味地黃方與人參湯共煎液中毒性物質(zhì)的電噴霧質(zhì)譜研究[J].中草藥，2005，36(1)：36-39.

[12] 許慶軒，王 勇，宋鳳瑞,等.八味地黃湯各藥味對(duì)附子生物堿影響的電噴霧質(zhì)譜研究[J].中草藥，2005，36(4)：519-522.

[13] WANG Y, SONG F R, XU Q X, et al. Characterization of aconitine-type alkaloids in the flowers of Aconitum kusnezoffii by electrospray ionization tandem mass spectrometry[J]. J Mass Spectrom, 2003(38): 962-970.

[14] 劉淑瑩, 許慶軒, 劉志強(qiáng),等.附子及烏頭屬植物中脂類(lèi)生物堿的分離提取方法：中國(guó)，ZL200410010820.5 [P]. 2006-05-31.

[15] 許慶軒，王 勇，劉志強(qiáng), 等.中藥草烏中二萜類(lèi)生物堿的電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜分析[J].高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào)，2005，26(4):638-641.

[16] WANG Y, XU Q X, SONG F R, et al. A new method for preparation and charcterization of lipo-alkaloid[J]. Chem Res Chinese U, 2004,20(1): 121-123.

[17] XU Q X, WANG Y, LIU Z Q, et al. Structure identification of five unknown dilipo-alkaloids extracted from processed tuber of Aconitum Carmiechaeli by electrospray ionization tandem mass spectrometry[J]. Analytical Sciences, 2003(19): 1 599-1 603.

AnalysisoftheLipo-AlkaloidsfromAconiteRootbyElectrosprayTripleQuadrupoleMassSpectrometry

GE Jing-cheng1, XU Qing-xuan2, YAN Jing1, CHEN Jian1,HE Yan-yu1

(1.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine，Haerbin150040,China;2.HeilongjiangUniversity,CropsResearchInstitute，Haerbin150081,China)

Aconite tuber is one of the commonly used Chinese traditional medicine. Lipo-alkaloids is the most important active ingredients in Aconite tuber. A stable, efficient and reliable method was established to quickly analysed the lipo-alkaloids which are rather complex in aconite tuber. The lipo-alkaloids in aconite tuber is analysed by using multiple scan function of electrospray ionization coupled with triple quadrupole mass spectrometry including full scan, daughter ion scan, parent ion scan and neutral loss scan. There are two kinds of differences in the lipo-alkaloidal structures, one in which base on the different alkaloid skeleton, the other difference is due to the connected with C8 substituted long chain fatty acids. The lipo-alkaloids with the high content in aconite tuber are due to 4 kinds of alkaloids skeleton and 3 kinds of C8 substituted fatty acids, e.g. a total of 12 kinds of lipo-alkaloids which are analysed. People often only focus on the much reaction monitoring(MRM) function of the triple quardrupole mass spectrometry, ignore the other functions. The function of parent ion scan and neutral loss scan for analysis of the lipo-alkaloids from aconite root has scanning speed, high efficiency. The results are stable and reliable.

aconite tuber; lipo-alkaloids; electrospray ionization coupled with triple quadrupole mass spectrometry; parent ion scan; neutral loss scan.

O 657.63

A

1004-2997(2012)03-0123-06