不同人結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞系對常用抗腫瘤藥物體外化療敏感性的比較*

張曉莉， 師憲平， 曹錦萍， 宋敏敏， 盧碧燕， 李 文， 黃蘭蘭， 溫創(chuàng)宇， 皮榮標(biāo)， 黃美近， 劉煥亮△

(1中山大學(xué)胃腸病學(xué)研究所， 2中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院，廣東 廣州 570655;3廣州醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，廣東 廣州 510182； 4中山大學(xué)藥學(xué)院， 廣東 廣州 510080)

1000-4718(2012)12-2172-06

2012-09-09

2012-11-16

廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.2011J5200009)；中山大學(xué)百人計(jì)劃科研團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目(No.88000-3281302)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.2011B080701064)；廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.9151008901000196)

△通訊作者Tel: 020-39443272； 黃美近E-mail: maymay0129@21cn.com； 劉煥亮E-mail: Huanliang.Liu@gmail.com

不同人結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞系對常用抗腫瘤藥物體外化療敏感性的比較*

張曉莉1,2， 師憲平3， 曹錦萍1,2， 宋敏敏1,2， 盧碧燕1,2， 李 文1,2， 黃蘭蘭1,2， 溫創(chuàng)宇1,2， 皮榮標(biāo)4， 黃美近2△， 劉煥亮1,2△

(1中山大學(xué)胃腸病學(xué)研究所，2中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院，廣東 廣州 570655;3廣州醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，廣東 廣州 510182；4中山大學(xué)藥學(xué)院， 廣東 廣州 510080)

目的觀察5種常用抗腫瘤藥物對這些人結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞系的生長抑制作用，探討5種常用抗腫瘤藥物對11株人結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞系的作用強(qiáng)度以及比較其體外敏感性，研究不同抗腫瘤藥物對人結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116和SW480熱休克蛋白27(HSP27)和HSP70表達(dá)水平的影響。方法采用CCK-8(Cell Counting Kit-8)法檢測5種常用抗腫瘤藥物分別對11株人結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞系的生長抑制效應(yīng)，計(jì)算50%抑制濃度(50% inhibitory concentration, IC50)及敏感指數(shù)，并比較不同人結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞系對5種抗腫瘤藥物的敏感性，Western blotting檢測HSP27和HSP70蛋白表達(dá)水平。結(jié)果11株人結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞系對5-氟尿嘧啶(5-FU)和奧沙利鉑(OHP)均比較敏感，沒有明顯耐藥性；5株人結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞系對絲裂霉素(MMC)敏感，6株中度敏感；除SW1116 外的10株人結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞系都對多西紫杉醇(DXL)敏感，而SW1116細(xì)胞對DXL表現(xiàn)出明顯耐藥性；除LS174T和SW1116外的9株人結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞系都對伊立替康(IFL)表現(xiàn)出中度敏感，LS174T細(xì)胞對IFL表現(xiàn)敏感，而SW1116細(xì)胞對IFL表現(xiàn)出明顯耐藥性。抗腫瘤藥物作用于人結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116和SW480使HSP27的表達(dá)上調(diào)，但HSP70的表達(dá)水平變化不明顯。結(jié)論LS174T是多藥敏感細(xì)胞株，SW1116是多藥耐藥細(xì)胞株，5-FU和OHP為廣譜抗結(jié)直腸腫瘤藥物；化療藥物的敏感性及HSP27表達(dá)量檢測對臨床選擇化療藥物具有一定的提示意義。

結(jié)直腸腫瘤； 化學(xué)療法； 藥物篩選； 熱休克蛋白70； 熱休克蛋白27

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是最常見的消化道惡性腫瘤，嚴(yán)重危害人類的生命和健康，也是目前致死率最高的腫瘤之一，2008年世界范圍內(nèi)大約有120萬新發(fā)病例，每年因結(jié)直腸癌死亡的病例超過60萬[1]。據(jù)2012年衛(wèi)生部的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，我國結(jié)直腸癌病死率已位居惡性腫瘤第5位[2]。近年來,包括手術(shù)切除、放化療以及新輔助治療在內(nèi)的結(jié)直腸腫瘤的各種治療手段,都取得了顯著的進(jìn)步[3]。隨著抗腫瘤藥物的不斷出現(xiàn),化療在綜合治療中占有越來越重要的地位，然而化療藥物毒性并且存在明顯的個(gè)體差異。同時(shí)，結(jié)直腸腫瘤化療耐藥現(xiàn)象十分常見，很大程度上影響化療效果，因此深入系統(tǒng)的研究探討結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性是提高結(jié)直腸腫瘤化療療效及安全性的一個(gè)重要問題。

熱休克蛋白(heat-shock protein, HSP)是一組生物體內(nèi)普遍存在、進(jìn)化上高度保守的蛋白質(zhì)家族，又被稱為分子伴侶(molecular chaperone)，是在生理應(yīng)激或病理狀態(tài)等環(huán)境因素的刺激下，細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)合成的一組高度保守的蛋白質(zhì)。其基本作用是作為分子伴侶參與蛋白質(zhì)的合成、折疊、積聚、裝配、運(yùn)輸和降解，在應(yīng)激狀態(tài)下HSP的含量會(huì)顯著增加并起到保護(hù)細(xì)胞的作用[4]。其中腫瘤細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)的HSP27和HSP70一方面可能與多種原癌基因互相作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖[5]，另一方面還參與了腫瘤細(xì)胞抗凋亡過程[6]從而增強(qiáng)細(xì)胞對損害的耐受力，維持細(xì)胞正常功能，提高生存能力。Mazurov等[7]證實(shí)了結(jié)直腸癌細(xì)胞HSP27的誘導(dǎo)性表達(dá)使腫瘤細(xì)胞獲得對順鉑等藥物產(chǎn)生獲得性耐受。Venkatakrishnan等[8]也證明外源性或內(nèi)源性HSP27表達(dá)上調(diào)可提高腫瘤細(xì)胞耐藥性。HSP70家族是熱休克蛋白中最保守的一族，在生物的應(yīng)激反應(yīng)中最敏感。當(dāng)受外界刺激特別是熱沖擊后，細(xì)胞內(nèi)其它大部分基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白合成降低，而HSP70蛋白合成增加并與肽鏈結(jié)合，發(fā)揮分子伴侶的作用，穩(wěn)定肽鏈的空間結(jié)構(gòu)和分布，增加細(xì)胞對外界刺激的耐受性，同時(shí)也對某些細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄通路進(jìn)行調(diào)節(jié)[9]。因此研究不同抗腫瘤藥物對人結(jié)直腸癌細(xì)胞HSP27和HSP70蛋白表達(dá)水平的影響，對在臨床用藥過程中有很重要的提示意義。

本實(shí)驗(yàn)選用簡便、準(zhǔn)確性高的CCK-8(Cell Counting Kit-8)法，系統(tǒng)檢測11株人結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞系SW480、HT-29、HCT116、LoVo、SW1116、HCT-8、HCT15、DLD-1、LS174T、SW620和Caco-2對5-氟尿嘧啶(fluorouracil，5-FU)、奧沙利鉑(oxaliplatin，OHP)、多西紫杉醇(docetaxel，DXL)、伊立替康(irinotecan，IFL)和絲裂霉素(mitomycin，MMC)5種臨床常用抗腫瘤藥物的敏感性，同時(shí)分析了化療藥物對HCT116和SW480細(xì)胞內(nèi)HSP27及HSP70表達(dá)水平的影響，為進(jìn)一步探討熱休克蛋白與腫瘤細(xì)胞耐藥性的內(nèi)在聯(lián)系奠定基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1材料

人結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞系SW480、HT-29、HCT116、LoVo、SW1116、HCT-8、HCT15、DLD-1、LS174T、SW620和Caco-2購買于中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。

2主要試劑與儀器

CCK-8試劑盒購自Dojindo Molecular Technologies；RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco； 胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購自Gibco；青霉素、鏈霉素購自Gibco；0.25%胰酶+EDTA購自Gibco；96孔培養(yǎng)板購自Corning；5-FU購自杭州賽諾菲安萬特民生制藥有限公司；OHP購自杭州賽諾菲安萬特民生制藥有限公司；DXL購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；IFL購自Pfizer(Perth) Pty Limited；MMC購自浙江海正藥業(yè)有限公司；兔抗人HSP70 IgG抗體和兔抗人HSP27 IgG抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；兔抗GAPDH IgG抗體購自杭州賢至生物科技有限公司；羊抗兔IgG熒光Ⅱ抗購自LI-COR；細(xì)胞裂解液購自碧云天生物技術(shù)研究所；Odyssey紅外成像系統(tǒng)購自LI-COR；Model680酶標(biāo)儀購自Bio-Rad；CO2恒溫培養(yǎng)箱購自Thermo；Forma ClassⅡA2生物安全柜。

3試劑和藥物配制

3.1RPMI-1640完全培養(yǎng)基的配制 在基礎(chǔ)RPMI-1640培養(yǎng)基中加入10%FBS、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素。

3.2CCK-8測定液的配制 按照CCK-8∶無血清培養(yǎng)基=1∶9的比例配制CCK-8測定液，現(xiàn)配現(xiàn)用，避光操作。

3.3藥敏實(shí)驗(yàn)所用藥物的配制 5-FU的濃度分別是500 μmol/L、125 μmol/L、31.25 μmol/L、7.81 μmol/L和1.95 μmol/L；OHP的濃度分別是100 μmol/L、25 μmol/L、6.75 μmol/L、1.688 μmol/L和0.422 μmol/L；DXL的濃度分別為50 nmol/L、12.5 nmol/L、3.375 nmol/L、0.844 nmol/L和0.211 nmol/L；IFL的濃度分別是100 μmol/L、25 μmol/L、6.75 μmol/L、1.686 μmol/L和0.422 μmol/L；MMC的濃度分別是1 000 nmol/L、250 nmol/L、62.5 nmol/L、15.875 nmol/L和3.969 nmol/L。

4主要方法

4.1細(xì)胞培養(yǎng) 取液氮凍存的各細(xì)胞，37～38 ℃水溫迅速融化后900 r/min離心3 min,去上清，接種于培養(yǎng)瓶中,37 ℃恒溫恒濕、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。毎3～4 d傳代1次，用0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA消化后傳代或收集對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

4.2細(xì)胞生長曲線測定 取生長狀態(tài)良好處于對數(shù)生長期各細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)染色進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后按1 000 cells/well、2 000 cells/well、3 000 cells/well、4 000 cells/well和5 000 cells/well接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)基為RPMI-1640完全培養(yǎng)基，邊緣孔用無菌的PBS填充，毎孔100 μL，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，37 ℃培養(yǎng)24 h至貼壁。更換新鮮的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后分別用CCK-8測定法測定吸光度(absorbance,A)值。

4.3體外藥物敏感性實(shí)驗(yàn) 用生長曲線所確定的細(xì)胞濃度，接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)基為RPMI-1640完全培養(yǎng)基，邊緣孔用無菌的PBS填充，毎孔100 μL，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育24 h后，用各梯度濃度的藥物作用72 h，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，對照組的藥物濃度為0，作用72 h后，用CCK-8法測定A值。

4.4CCK-8測定 棄去96孔板中原有的培養(yǎng)基，每孔加入100 μL CCK-8測定液，以僅含CCK-8測定液的無細(xì)胞孔為空白調(diào)零孔。37 ℃避光孵育0.5～4 h，分別于0.5 h、1 h、2 h、3 h和4 h時(shí)點(diǎn)在酶標(biāo)儀上測定A值，測定波長為450 nm，參比波長為630 nm。

4.5敏感性判定[10]敏感指數(shù)(耐藥指數(shù))根據(jù)IC50與最高血漿濃度(peak plasma concentration,PPC)的比值來確定。即敏感指數(shù)(耐藥指數(shù))=IC50/PPC。有敏感性：IC50低于PPC者(敏感指數(shù)<1者)；中等敏感性：IC50為PPC的1～10倍(耐藥指數(shù)為1～10者)；無敏感性即耐藥性：IC50超過PPC的10倍者(耐藥指數(shù)>10者)。

4.65種抗腫瘤藥物的PPC 所用化療藥物的100%測試藥物濃度(TDC)為按國人藥物常規(guī)用量(毫克/體表面積),在藥物的藥代動(dòng)力學(xué)指導(dǎo)下測出的血液內(nèi)峰值濃度PPC,分別為:5-FU(192.189 μmol/L)；OHP(12.585 μmol/L)；DXL(12.387 μmol/L)；IFL(6.940 μmol/L)；MMC(0.688 μmol/L)。

4.7Western blotting檢測 將對數(shù)生長期的HCT116細(xì)胞和SW480細(xì)胞分別用IC50對應(yīng)濃度的化療藥物處理24 h后提取細(xì)胞總蛋白，10% SDS-PAGE凝膠分離蛋白，通過半干轉(zhuǎn)方式將蛋白轉(zhuǎn)至0.22 μm孔徑的硝酸纖維膜上,用Ⅰ抗封閉液室溫封閉2 h后，分別加入含HSP70(1∶400)、HSP27(1∶400)和GAPDH(1∶500)的Ⅰ抗稀釋液(PBST配制)，4 ℃過夜孵育，PBST洗膜3次，每次10 min，分別滴加羊抗兔IgG熒光Ⅱ抗(1∶10 000)(PBST配制)稀釋液，室溫避光孵育1 h，PBST洗膜4次，每次10 min，利用Odyssey紅外成像系統(tǒng)儀檢測目標(biāo)條帶并測定條帶灰度值，通過計(jì)算HSP70和HSP27分別與GAPDH灰度值的比值考察蛋白表達(dá)水平。

5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

111株人結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞系種板濃度

所得A值保證3個(gè)復(fù)孔標(biāo)準(zhǔn)差不大于均數(shù)的10%，以3個(gè)復(fù)孔平均A值為縱坐標(biāo)，毎孔的種板細(xì)胞數(shù)量為橫坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線，得到11株人結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞系的藥物敏感性實(shí)驗(yàn)種板濃度。根據(jù)細(xì)胞的生長曲線,SW480、HCT116、LoVo、HCT-8、HCT15、LS174T、Caco-2和SW620細(xì)胞的種板密度均為4 000 cells/well，HT-29和DLD-1細(xì)胞的種板密度均為5 000 cells/well，SW1116細(xì)胞的種板密度為6 000 cells/well。

25種常用抗腫瘤藥物對11株人結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞系的IC50

5-FU對11株人結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞系的IC50為0.108～651.537 μmol/L,以Caco-2細(xì)胞對藥物最為敏感，SW1116細(xì)胞最不敏感；OHP的IC50為0.558～16.618 μmol/L,以HCT116細(xì)胞對藥物最為敏感，SW620細(xì)胞最不敏感；DXL的IC50為0.001～461.090 μmol/L,以LS174T細(xì)胞對藥物最為敏感，SW1116細(xì)胞最不敏感；IFL的IC50為8.378～1 256.187 μmol/L,以LS174T細(xì)胞對藥物最為敏感，SW1116細(xì)胞最不敏感；MMC的IC50為0.151～4.445 μmol/L,以HCT15細(xì)胞對藥物最為敏感，SW1116細(xì)胞最不敏感,見表1。

表1 5種常用化療藥物對11株人結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞系的IC50

aRepresentative IC50values of DXL for Caco-2, HCT15, HCT116, HT29, DLD-1 and LS174T cells were 0.00344 μmol/L, 0.001352 μmol/L, 0.003883 μmol/L, 0.003596 μmol/L, 0.001217 μmol/L and 0.000548 μmol/L, respectively.*P<0.05vsother groups.

311株人結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞系對5種常用抗腫瘤藥物的敏感指數(shù)

11株人結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞對5-FU和OHP比較敏感，沒有表現(xiàn)出耐藥性；5株人結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞對MMC敏感，6株中度敏感；除SW1116外的10株人結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞系都對DXL敏感，而SW1116細(xì)胞對DXL表現(xiàn)出明顯耐藥性；除LS174T和SW1116外的9株人結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞系都對IFL表現(xiàn)出中度敏感，LS174T細(xì)胞對IFL表現(xiàn)敏感，而SW1116細(xì)胞對IFL表現(xiàn)出明顯耐藥性。LS174T是多藥敏感細(xì)胞株，SW1116是多藥耐藥細(xì)胞株,5-FU和OHP為廣譜抗結(jié)直腸腫瘤藥物，見表2。

表2 11株結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞對5種常用化療藥物的敏感指數(shù)

aRepresentative sensitivity indexes of Caco-2, HCT15, HCT116, HT29, DLD-1, LS174T, LoVo and SW620 cells to DXL were 0.000277912, 0.000109226, 0.000313702, 0.000290515, 9.83196×10-5, 4.42721×10-5, 0.001426967 and 0.000883907, respectively.*P<0.05vsother groups.

4HCT116細(xì)胞中HSP27和HSP70的表達(dá)

Western blotting結(jié)果顯示,HCT116細(xì)胞在各化療藥物IC50濃度的作用下，HSP27的表達(dá)有不同程度的增高，而HSP70表達(dá)量的變化不明顯，見圖1。

5SW480細(xì)胞中HSP27和HSP70的表達(dá)

Western blotting結(jié)果顯示，SW480細(xì)胞在各化療藥物IC50濃度的作用下，HSP27在5-FU、OHP和DXL IC50的作用下有不同程度的上調(diào)，但是在IFL和MMC的作用下表達(dá)量下調(diào)；HSP70在5-FU IC50的作用下表達(dá)上調(diào)，在其它藥物的IC50作用都有不同程度的下調(diào)。

圖1化療藥物對HCT116細(xì)胞中HSP70和HSP27表達(dá)的影響

圖2化療藥物對SW480細(xì)胞中HSP70和HSP27表達(dá)的影響

討 論

由于腫瘤是一個(gè)異質(zhì)性、多態(tài)性、分化不均的細(xì)胞群體，臨床上常發(fā)現(xiàn)同一組織學(xué)類型的腫瘤對同一化療藥物敏感性存在著差異，而且腫瘤多藥耐藥(multidrug resistance, MDR)也普遍存在，這些因素直接影響腫瘤的化療效果。目前臨床上使用的抗腫瘤藥物多達(dá)上百種，而不同的組織學(xué)類型的腫瘤甚至來自同一臟器具有相同組織學(xué)類型的腫瘤對抗腫瘤藥物的敏感性也不盡相同。提高腫瘤化療效果的一個(gè)關(guān)鍵性問題是克服化療藥物的耐藥性。根據(jù)藥物敏感性進(jìn)行個(gè)體化治療，可以提高治療效果，因此，通過藥物敏感性試驗(yàn)來選擇藥物，不僅可以提高療效，而且也可以避免無效的抗腫瘤藥物帶來的毒副作用。本實(shí)驗(yàn)采用5種臨床常用的化療藥物,以系統(tǒng)的確定和比較體外人結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞系對化療藥物的敏感性。

從上述體外藥物敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出大部分人結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞系對5種常規(guī)臨床抗腫瘤藥物比較敏感，LS174T細(xì)胞對5種抗腫瘤藥物都具有敏感性；Caco-2、HCT15、HCT116和HT29細(xì)胞對5-FU、OHP、DXL和MMC均具有敏感性，但是對IFL中度敏感；DLD-1、LoVo、SW480和HCT-8細(xì)胞對5-FU、OHP和DXL均具有敏感性，但是對IFL和MMC中度敏感；SW620細(xì)胞對5-FU和DXL均具有敏感性，但是對OHP、IFL和MMC中度敏感；SW1116細(xì)胞對DXL和IFL產(chǎn)生耐藥，對5-FU、OHP和MMC具有中度敏感性。人結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞系對各種抗腫瘤藥物的敏感性不同，存在自然耐藥性，可根據(jù)不同的人結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞系對抗腫瘤藥物的敏感性來選擇不同的抗腫瘤藥物。11株結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞對5-FU和OHP比較敏感，沒有表現(xiàn)出耐藥性，因此5-FU和OHP可以考慮作為治療結(jié)直腸腫瘤的廣譜性化療藥物。體外抗腫瘤藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果為臨床選擇有效的抗腫瘤藥物，開展結(jié)直腸腫瘤的個(gè)體化治療從而明顯改善結(jié)直腸腫瘤患者的預(yù)后有一定的提示作用。

熱休克蛋白是一組廣泛存在于原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中，在生理、病理及應(yīng)激狀態(tài)下，于細(xì)胞內(nèi)合成的具有高度保守的氨基酸序列及其編碼基因的蛋白質(zhì)，在應(yīng)激狀態(tài)下提高細(xì)胞對應(yīng)激損傷的耐受性[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，不同抗腫瘤藥物作用對不同人結(jié)直腸癌細(xì)胞(HCT116和SW480)中HSP70和HSP27表達(dá)水平的影響不同，這可能與不同腫瘤細(xì)胞的基因型不同以及不同藥物的作用機(jī)制不同有關(guān)，同時(shí)HSP27和HSP70對化療藥物的響應(yīng)濃度和響應(yīng)時(shí)間存在差異。HSP27與細(xì)胞耐藥性密切相關(guān)[13-14],而本研究發(fā)現(xiàn)5種化療藥物均誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞內(nèi)HSP27的表達(dá)，同時(shí)HCT116細(xì)胞對化療藥物均比較敏感。這主要是因?yàn)楸狙芯渴褂玫乃幬餄舛仁荌C50對應(yīng)濃度，該濃度下對藥物敏感的細(xì)胞株HCT116仍對藥物有一定的耐受性，可見化療藥物的臨床使用不僅要選擇合適的藥物，同時(shí)要確定合適的藥物濃度。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看到，不同抗腫瘤藥物作用人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116使HSP27表達(dá)量有不同程度的增加?？赡苁且?yàn)镠SP27磷酸化形成二聚體可以通過三方面穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)：(1)與微管蛋白相結(jié)合增加微管的穩(wěn)定性和完整性；(2) 使肌動(dòng)蛋白(F-actin)磷酸化，阻止微絲的分裂以促進(jìn)微絲多聚化以保持微絲的穩(wěn)定，HSP27同一種體外肌動(dòng)蛋白聚合抑制劑有著高度序列相似性，能夠穩(wěn)定肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架來抵抗外界應(yīng)激；(3) 還通過與中間絲相互作用來避免中間絲異常聚合[15]，所以HSP27在細(xì)胞中的表達(dá)會(huì)有不同程度的升高，但是在IFL和MMC作用下SW480細(xì)胞HSP27的表達(dá)是下調(diào)的，可能還有其它的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步的研究。

HSP27在HCT116細(xì)胞系中在受到各抗癌藥物的IC50濃度作用后，均有不同程度的上調(diào)，說明HCT116本身對各化療藥物敏感的特性在受到化療藥物刺激后發(fā)生改變。由于多數(shù)耐藥腫瘤細(xì)胞中存在HSP27表達(dá)上調(diào)，并且體外阻斷HSP27表達(dá)可逆轉(zhuǎn)藥物耐受性，因此，可以認(rèn)為HSP27表達(dá)可作為預(yù)測抗癌藥物療效的指標(biāo)。雖然體外研究提示阻斷HSP27表達(dá)可逆轉(zhuǎn)耐藥,但如何通過其它方法抑制HSP27基因的保護(hù)功能，更有效地發(fā)揮化療藥物的抗癌作用需要進(jìn)一步的深入的研究，其臨床應(yīng)用尚存在許多問題,作為一類在機(jī)體大多數(shù)正常細(xì)胞持續(xù)表達(dá)、生物學(xué)作用廣泛的小分子蛋白,HSP27的表達(dá)一旦被阻斷后,是否會(huì)對機(jī)體產(chǎn)生嚴(yán)重的不良影響?所有這些均需要學(xué)者們在基礎(chǔ)和臨床領(lǐng)域的繼續(xù)探索。

本實(shí)驗(yàn)是將腫瘤細(xì)胞完全暴露在藥物下進(jìn)行的，而藥物在體內(nèi)分布、代謝、排泄速度與體外實(shí)驗(yàn)具有較大差異，因此，對于此類細(xì)胞毒類抗腫瘤藥物有效性研究的結(jié)果并不能準(zhǔn)確地預(yù)測受試物的臨床療效。然而,體外藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果的初步篩選可為臨床治療提供線索。因此,我們將進(jìn)一步對影響人結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞的功能化合物進(jìn)行研究，深入探討熱休克蛋白等腫瘤細(xì)胞耐藥相關(guān)蛋白的作用機(jī)制，為結(jié)直腸腫瘤藥物開發(fā)提供新靶點(diǎn)，同時(shí)也為結(jié)直腸腫瘤的綜合防治提供新思路。

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Sensitivityofdifferenthumancolorectaltumorcelllinestocommonlyusedchemotherapeuticdrugsinvitro

ZHANG Xiao-li1,2, SHI Xian-ping3, CAO Jin-ping1, 2, SONG Min-min1, 2, LU Bi-yan1, 2, LI Wen1, 2, HUANG Lan-lan1, 2, WEN Chuang-yu1, 2, PI Rong-biao4, HUANG Mei-jin2, LIU Huan-liang1,2

(1InstituteofGastroenterology,SunYat-senUniversity,2theSixthAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510655,China;3DepartmentofBiochemistry,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510182,China;4SchoolofPharmaceuticalSciences,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China,E-mail:maymay0129@21cn.com,Huanliang.Liu@gmail.com)

AIM: To observe the antitumor effect of 5 commonly used chemotherapeutic drugs on 11 human colorectal cancer cell linesinvitro.METHODSCCK-8 method was used to determine the growth inhibitory effects of 5 antitumor drugs, which were expressed as the half growth inhibitory concentration (IC50) and sensitivity index IC50/PPC (peak plasma concentration) on 11 human colorectal cancer cell lines. The expression variations of heat-shock protein 27 (HSP27) and HSP70 at protein levels in human colorectal tumor cell lines treated with different chemotherapeutic drugs were observed by Western blotting.RESULTSAll the 11 colorectal cancer cell lines were sensitive to 5-fluorouracil (5-FU) and oxaliplatin (OHP) without drug resistant. Five colorectal cancer cell lines were sensitive to mitomycin (MMC), while the other 6 cell lines were moderately sensitive. Ten colorectal cancer cell lines except SW1116 were sensitive to docetaxel (DXL), while SW1116 cells were resistant to DXL. Nine colorectal cancer cell lines except LS174T and SW1116 were moderately sensitive to irinotecan (IFL), and SW1116 cells were also resistant to IFL, while LS174T cells were sensitive to IFL. After treated with the antitumor drugs, HSP27 was up-regulated in HCT116 cells and SW480 cells, while the expression of HSP70 didn’t change.CONCLUSIONLS174T cells are multidrug-sensitive, while SW1116 cells are multidrug-resistant. 5-FU and OHP are the wide-spectrum anti-colorectal cancer drugs. Determining the sensitivity to chemotherapeutic drugs and the expression level of HSP27 can improve the accuracy in drug selection.

Colorectal neoplasms; Chemotherapy; Drug screening; Heat-shock protein 70; Heat-shock protein 27

R735.3

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.12.011