磷酸化缺陷型RARα1受體對(duì)人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞體外增殖的影響*

郭小娟, 鄭 冬△, 王安訓(xùn), 李 娟, 夏 盈

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院 1血液內(nèi)科; 2口腔外科，廣東 廣州 510080)

1000-4718(2012)05-0816-07

2012-02-23

2012-04-01

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.2011B031800139)

△通訊作者 Tel: 020-87755766-8831; E-mail: zcxzd@tom.com

磷酸化缺陷型RARα1受體對(duì)人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞體外增殖的影響*

郭小娟1, 鄭 冬1△, 王安訓(xùn)2, 李 娟1, 夏 盈1

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院1血液內(nèi)科;2口腔外科，廣東 廣州 510080)

目的研究磷酸化缺陷型維甲酸受體RARα1(RARαS77A)對(duì)人多發(fā)性骨髓瘤(MM)細(xì)胞增殖的影響。方法(1)RT-PCR檢測(cè)U266 細(xì)胞RARα受體亞型mRNA的表達(dá)；(2)RARαS77A過(guò)表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建，慢病毒包裝，滴度測(cè)定及MM細(xì)胞轉(zhuǎn)染；(3)CCK-8檢測(cè)全反式維甲酸(ATRA,0～100 μmol/L)處理或RARαS77A過(guò)表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染后U266 細(xì)胞的增殖；(4)Western blotting檢測(cè)RARαS77A過(guò)表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染或ATRA處理后U266 細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白R(shí)b和P53的表達(dá)。結(jié)果(1)U266為RARα1(+)、RARα2(-)細(xì)胞；(2)ATRA明顯抑制U266 細(xì)胞增殖，其作用呈時(shí)間和劑量依賴(lài)性；RARαS77A過(guò)表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染48 h 后U266細(xì)胞增殖明顯被抑制，抑制率為15.16%±3.84%；(3)RARαS77A過(guò)表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染及ATRA處理均可上調(diào)U266細(xì)胞Rb蛋白表達(dá)及下調(diào)其P53蛋白表達(dá)。結(jié)論磷酸化缺陷型維甲酸受體RARα1與ATRA均可通過(guò)上調(diào)Rb及下調(diào)P53表達(dá)抑制RARα1(+)、RARα2(-)的U266細(xì)胞增殖，提示降低維甲酸受體RARα1的磷酸化是ATRA抑制MM細(xì)胞增殖的一個(gè)重要作用途徑。

多發(fā)性骨髓瘤； 受體，維甲酸； 磷酸化； 細(xì)胞增殖

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是血液系統(tǒng)常見(jiàn)腫瘤，傳統(tǒng)化療效果較差，目前仍被認(rèn)為是一種不能治愈的疾病。雖然自體造血干細(xì)胞移植術(shù)和萬(wàn)珂等新藥的臨床應(yīng)用大大提高了MM患者的無(wú)病生存時(shí)間，但由于耐藥的出現(xiàn)以及復(fù)發(fā)的不可避免，新的藥物研發(fā)以及新的治療方式的探索仍然是目前急需解決的問(wèn)題。自從1985年全反式維甲酸(all-transretinoic acid,ATRA)聯(lián)合化療作為急性早幼粒細(xì)胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)的誘導(dǎo)和鞏固治療方案應(yīng)用于臨床,初治APL患者的完全緩解率(complete remission,CR)提高至90%～95%，5年無(wú)病生存率(disease-free survival,DFS)提升至 74%。ATRA的出現(xiàn)將APL從致死率最高的急性髓細(xì)胞白血病(AML)類(lèi)型轉(zhuǎn)變?yōu)榕R床預(yù)后最好的類(lèi)型。自此，近年來(lái)大量的研究將ATRA應(yīng)用于許多實(shí)體腫瘤上，研究報(bào)道ATRA可以誘導(dǎo)許多腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生再分化和凋亡的作用，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，如口腔鱗癌、乳腺癌、肺癌、胃癌以及胰腺癌等。同樣，對(duì)于大多數(shù)MM細(xì)胞株，ATRA均具有抑制其生長(zhǎng)增殖的作用[1]；對(duì)于骨髓中新鮮分離的MM細(xì)胞增殖，其抑制作用呈劑量依賴(lài)性[2]。隨后大量研究發(fā)現(xiàn)ATRA不僅可以抑制MM細(xì)胞的增殖，同時(shí)可以促使MM細(xì)胞凋亡，其可通過(guò)調(diào)節(jié) MM細(xì)胞的Fas抗原發(fā)揮對(duì)MM細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)MM細(xì)胞凋亡，而聯(lián)合抗Fas抗體可增強(qiáng)其抑制增殖及促凋亡作用。ATRA聯(lián)合地塞米松可降低MM細(xì)胞白細(xì)胞介素-6受體(interleukin-6 receptor,IL-6R)及B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)的表達(dá)，增加地塞米松的細(xì)胞毒作用以及其促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，通過(guò)上調(diào)p21WAF1以及減低磷酸化Rb蛋白的表達(dá)來(lái)抑制MM細(xì)胞增殖[3]。然而維甲酸的分化綜合征及高鈣血癥等不良反應(yīng)限制了傳統(tǒng)的維甲酸類(lèi)藥物的進(jìn)一步發(fā)展及對(duì)MM患者的臨床應(yīng)用，改進(jìn)和研發(fā)靶向性高、毒副作用小的維甲酸類(lèi)藥物成為了目前的一個(gè)研究方向。既往研究發(fā)現(xiàn)ATRA主要是通過(guò)維甲酸受體α(retinoic acid receptor alpha,RARα)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控發(fā)揮效應(yīng)的[4]，其中RARα的 轉(zhuǎn)錄激活作用主要通過(guò)RARα1受體AF-1區(qū)域第77位絲氨酸的磷酸化實(shí)現(xiàn)[5]。RARα1與cyclin H/CDK7復(fù)合物結(jié)合以及將RARα1受體氨基酸末端第77位絲氨酸磷酸化可增強(qiáng)RARα的反式激活作用，而ATRA通過(guò)抑制cyclin H/CDK7的表達(dá)而降低RARα1氨基酸末端第77位絲氨酸的磷酸化來(lái)發(fā)揮作用[6]。磷酸化缺陷型維甲酸受體RARα1可以模擬ATRA的作用誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)G1期阻滯從而抑制細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)再分化作用[7-9]。本研究通過(guò)構(gòu)建磷酸化缺陷型維甲酸受體RARα1 (RARαS77A)過(guò)表達(dá)的慢病毒轉(zhuǎn)染MM細(xì)胞U266，研究其對(duì)MM細(xì)胞增殖的影響。

材 料 和 方 法

1細(xì)胞株及主要試劑

人胚腎細(xì)胞株293T和人MM細(xì)胞株U266均來(lái)源于ATCC，胎牛血清購(gòu)于HyClone。ATRA購(gòu)于Sigma;EcoRⅠ及NheⅠ限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)于NEB;Lipofectamin2000購(gòu)于Invitrogen;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑及Trizol購(gòu)于TaKaRa;PCR引物由上海生工合成，質(zhì)粒中提試劑盒及DH-5α感受態(tài)大腸桿菌購(gòu)于天根，Cell Counting Kit-8 (CCK-8)試劑盒購(gòu)買(mǎi)于DOJINDO Laboratory;全蛋白提取及BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自凱基生物，兔抗人P53單克隆抗體及鼠抗人Rb單克隆抗體購(gòu)于Cell Signaling Technology,兔抗人GAPDH單克隆抗體及IgG/HRP Ⅱ抗購(gòu)于博奧森，PVDF膜(0.45 μm)為Millipore產(chǎn)品。

2細(xì)胞培養(yǎng)

293T和U266細(xì)胞分別于含10%胎牛血清、100 mg/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM和RPMI-1640完全培養(yǎng)基中(Gibco)，37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)， U266細(xì)胞濃度維持在(5～10)×1018/L，所有細(xì)胞長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期即可用于實(shí)驗(yàn)研究。

3RT-PCR檢測(cè)U266細(xì)胞RARα受體亞型(RARα1及RARα2)的表達(dá)情況

離心收集未干預(yù)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U266細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA并將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA, 引物序列如表1所示，其中β-actin (196 bp)為用于標(biāo)準(zhǔn)化各個(gè)樣本cDNA含量的管家基因。PCR循環(huán)過(guò)程如下：94 ℃ 預(yù)變性5 min，94 ℃ 1 min,61 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 5 min。收集PCR產(chǎn)物于1.5% 瓊脂糖凝膠行電泳分析(100 V 30 min), 將凝膠取出后于紫外凝膠成像系統(tǒng)成像分析。

表1 RT-PCR引物序列

4磷酸化缺陷型維甲酸受體RARα1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及慢病毒包裝

本研究的磷酸化缺陷型維甲酸受體RARα1過(guò)表達(dá)載體為上海吉瑪公司構(gòu)建，具體構(gòu)建過(guò)程如下：提取RARα1(+)MM細(xì)胞株U266總RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA, RT-PCR反應(yīng)后經(jīng)過(guò)DNA膠回收獲取RARα1模板cDNA，測(cè)序驗(yàn)證后通過(guò)PCR擴(kuò)增反應(yīng)在已獲取的RARα1目的基因序列兩端加入酶切位點(diǎn)EcoRⅠ及NheⅠ，將上述PCR產(chǎn)物雙酶切獲得含酶切位點(diǎn)RARα1模板cDNA，通過(guò)T4DNA連接酶將上述膠回收產(chǎn)物連接線性化空質(zhì)粒構(gòu)建質(zhì)粒pGLV1-CMV-RARα1，測(cè)序驗(yàn)證；通過(guò)點(diǎn)突變的方法(Stratagene)將所購(gòu)建質(zhì)粒RARα1第77位編碼絲氨酸的密碼子TCG突變成GCG，挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行核甘酸測(cè)序分析，得到突變型RARα1受體pGLV1-CMV-RARαS77A質(zhì)粒，RARαS77A編碼蛋白的磷酸化缺陷驗(yàn)證在Rochette-Egly等的研究中通過(guò)[32P]放射性同位素標(biāo)記等方法證實(shí)[5, 7, 10]。構(gòu)建含無(wú)關(guān)序列的帶增強(qiáng)綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)的慢病毒穿梭質(zhì)粒為對(duì)照。將構(gòu)建含RARαS77A目的基因的慢病毒穿梭質(zhì)粒行雙酶切反應(yīng)驗(yàn)證構(gòu)建質(zhì)粒的正確性后將穿梭質(zhì)粒pGLV1-CMV-RARαS77A 或者pGLV1-CMV-NC-EGFP 40 μg, 包裝質(zhì)粒混合物(pG-p1-VSVG,PG-P3-RRE,PG-P2-RRE)42 μg及適量Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑混勻加入DMEM完全培養(yǎng)基中共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，72 h收集培養(yǎng)液上清離心超濾即可得到病毒純化液。

5病毒滴度測(cè)定及靶細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將293T 細(xì)胞接種于96孔板，5×103cells/well，第2 d將病毒液10倍稀釋呈3～5個(gè)梯度，并加入終濃度5 mg/L 聚凝胺(polybrene)，移去舊培養(yǎng)液加入稀釋好的病毒液100 μL, 5% CO2、37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，第3 d換液，第4 d根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)將細(xì)胞分出1/3～1/5繼續(xù)培養(yǎng)，第5 d熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，結(jié)合稀釋倍數(shù)估計(jì)病毒滴度。將U266細(xì)胞分5×103cells/well 及1×104cells/well 2個(gè)濃度接種于96孔板, 分別用MOI=1∶1、1∶10、1∶20、1∶50、1∶100 5個(gè)梯度的表達(dá)EGFP的對(duì)照病毒侵染，加入polybrene(5 mg/L)增強(qiáng)病毒感染力，培養(yǎng)24、48、72、96 h后熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，并選擇熒光表達(dá)高的轉(zhuǎn)染組行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)EGFP陽(yáng)性表達(dá)率。本研究中選取MOI=1∶50，并加用polybrene(5 mg/L)對(duì)U266細(xì)胞進(jìn)行侵染(96孔板 1×104cells/well，12孔板 2×105cells/well)，慢病毒轉(zhuǎn)染后24 h培養(yǎng)液加倍，轉(zhuǎn)染后48 h 收集細(xì)胞行增殖及Western blotting實(shí)驗(yàn)。

6ATRA處理U266細(xì)胞

將ATRA粉末溶解于無(wú)水乙醇配制濃度為104μmol/L的儲(chǔ)存液, RPMI-1640培養(yǎng)基將其稀釋至0～100 μmol/L后加入U(xiǎn)266細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組(96孔板中 2×104cells/well，12孔板 2×105cells/well)進(jìn)行藥物干預(yù)，≤ 1‰無(wú)水乙醇設(shè)為對(duì)照組，加藥完畢將培養(yǎng)板放置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)避光培養(yǎng)。

7CCK8檢測(cè)U266細(xì)胞增殖

取對(duì)數(shù)期U266細(xì)胞接種于96孔板，2×104cells/well ，加藥處理后于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中分別避光培養(yǎng)24、48、72、96 h，以不含細(xì)胞但含1 μmol/L ATRA的RPMI-1640培養(yǎng)基為空白組；慢病毒轉(zhuǎn)染組分實(shí)驗(yàn)組(RARαS77A過(guò)表達(dá)的慢病毒轉(zhuǎn)染組)和對(duì)照組(對(duì)照慢病毒轉(zhuǎn)染組)，細(xì)胞數(shù)為1×104cells/well，轉(zhuǎn)染后分別培養(yǎng)48 h及72 h，以不含細(xì)胞的RPMI-1640培養(yǎng)基為空白組。ATRA處理組及慢病毒轉(zhuǎn)染組每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，在處理好的細(xì)胞中加入CCK-8試劑(10 μL/well)，培養(yǎng)箱中避光孵育1～4 h，酶標(biāo)儀450 nm 波長(zhǎng)下測(cè)試每個(gè)樣孔的吸光度值(A)，根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率(inhibitory rate,IR)。

IR(%)=100%-(對(duì)照組A-空白組A)/(實(shí)驗(yàn)組A-空白組A)×100%。

8Westernblotting檢測(cè)U266細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)

提取12孔板經(jīng)過(guò)ATRA(0 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L)處理及慢病毒轉(zhuǎn)染48 h后的U266細(xì)胞蛋白，測(cè)蛋白濃度、定量、變性。配制12%的蛋白分離膠及3.75%濃縮膠，蛋白上樣及電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜中，0.5% 脫脂奶粉封閉 1 h, 分次加入0.5%BSA 稀釋的抗體P53(1∶500)，Rb (1∶500)4 ℃孵育12～16 h,洗膜，加入0.5% BSA稀釋的Ⅱ抗(1∶3 000),室溫孵育1 h,洗膜，取出放入曝光暗盒，至暗房加ECL發(fā)光液于膜上反應(yīng)，壓膠片，曝光，顯影，定影，再將膜取出用Striping buffer 洗脫后，重復(fù)上述封閉步驟，加入內(nèi)參照抗體GAPDH(1∶1 000)同上顯影，定影。用 Quantity One(Bio-Rad) 進(jìn)行灰度分析。

9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1U266細(xì)胞中RARα受體亞型(RARα1及RARα2)的表達(dá)

所用引物RARα1、RARα2及β-actin PCR產(chǎn)物分別為200 bp、300 bp和196 bp，RT-PCR檢測(cè)U266細(xì)胞為RARα1(+)、RARα2(-)的人MM細(xì)胞，見(jiàn)圖1。

Figure 1. The expression of RARα1 and RARα2 mRNA in human multiple myeloma U266 cells detected by RT-PCR.

圖1RT-PCR檢測(cè)U266細(xì)胞株中RARα1和RARα2mRNA的表達(dá)

2磷酸化缺陷型維甲酸受體RARα1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的驗(yàn)證

pGLV1-CMV-RARαS77A質(zhì)粒擴(kuò)增抽提后用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ以及NheⅠ進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，酶切產(chǎn)物電泳后凝膠成像圖譜見(jiàn)圖2(RARαS77A為1 376 bp)，酶切質(zhì)粒中可見(jiàn)與目的基因片段大小一致的清晰條帶，未酶切質(zhì)粒中只有一單一片段。

Figure 2. The detection of RARαS77A fragment by double-enzyme cleavage analysis in the recombinant plasmid (pGLV1-CMV-RARαS77A). M: marker;Lane 1:lentivirus expression plasmid digested by endonuclease;Lane 2:the complete lentivirus expression plasmid.

圖2雙酶切反應(yīng)驗(yàn)證在重組質(zhì)粒PGLV1-CMV-RARαS77A中的RARαS77A片段

3ATRA對(duì)U266細(xì)胞增殖的影響

不同濃度的ATRA(0～100 μmol/L)處理48 h后, U266細(xì)胞增殖受到明顯抑制(P<0.05)，見(jiàn)圖3A，半數(shù)抑制濃度(IC50)為 62.65 μmol/L，藥物濃度增加，細(xì)胞增殖抑制率相應(yīng)升高。用4個(gè)濃度ATRA(0 μmol/L、 1 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L)分別處理24、48、72和96 h 后，ATRA對(duì)U266細(xì)胞增殖抑制率伴隨處理時(shí)間延長(zhǎng)而升高，見(jiàn)圖3B。

圖3ATRA對(duì)U266細(xì)胞增殖的影響

4慢病毒轉(zhuǎn)染驗(yàn)證以及RARαS77A過(guò)表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染對(duì)U266細(xì)胞增殖的影響

病毒轉(zhuǎn)染U266細(xì)胞48 h后可見(jiàn)大量熒光表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)U266細(xì)胞中EGFP陽(yáng)性表達(dá)率為52.66%，見(jiàn)圖4A。經(jīng)過(guò)RARαS77A過(guò)表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染48 h后，U266細(xì)胞的增殖受到明顯抑制(P<0.01)，其抑制率為15.16%±3.84%，見(jiàn)圖4B。

5磷酸化缺陷型維甲酸受體RARα1(RARαS77A)及ATRA對(duì)U266細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

ATRA處理48 h后，U266細(xì)胞中Rb蛋白表達(dá)較對(duì)照組升高(圖5A、6A)(P<0.05)， P53蛋白的表達(dá)較對(duì)照組下降(圖5C、6C)(P<0.05)。與對(duì)照慢病毒轉(zhuǎn)染組比較，在RARαS77A過(guò)表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染48 h后的U266細(xì)胞中同樣檢測(cè)到Rb蛋白表達(dá)升高(圖5B、6B)(P<0.05)，P53蛋白表達(dá)水平下降(圖5D、6D)(P<0.05)。以上結(jié)果證明磷酸化缺陷型維甲酸受體RARα1與ATRA一樣均通過(guò)上調(diào)Rb蛋白表達(dá)、下調(diào)P53的表達(dá)實(shí)現(xiàn)對(duì)U266細(xì)胞增殖的抑制作用。

討 論

維甲酸(retinoic acid,RA)是視黃醇(即維生素A)的活性分子衍生物，是一種普遍存在于幾乎所有細(xì)胞中的信號(hào)分子，其對(duì)胚胎的發(fā)育、器官的生成、組織的恒定以及細(xì)胞的增殖分化及凋亡有深遠(yuǎn)的影響[11]，在癌癥治療上維甲酸可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的分化和/或誘導(dǎo)對(duì)藥物聯(lián)合作用的敏感蛋白表達(dá)，是目前臨床上應(yīng)用最為成功的分化誘導(dǎo)劑。

圖4RARαS77A慢病毒轉(zhuǎn)染效率的評(píng)估及其對(duì)U266細(xì)胞增殖的影響

維甲酸主要通過(guò)作用于RARα發(fā)生作用，RARα1及RARα2為大量存在于人體的兩種主要的

RARα的亞型，其中RARα1在各種組織中的表達(dá)水平相似，而RARα2為組織特異性表達(dá)，其表達(dá)水平隨著RA及G-CSF的誘導(dǎo)分化作用而上調(diào)。曾有研究者對(duì)所收治的80例初治的MM病人進(jìn)行RARα亞型的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)RARα1普遍存在于所有病人中，而RARα2(+)僅占32.5%，RARα2的表達(dá)與多發(fā)性骨髓瘤的疾病進(jìn)展以及ATRA的治療效果緊密相關(guān)，表達(dá)RARα2的患者總生存時(shí)間較不表達(dá)者短；高表達(dá)的RARα2刺激了STAT及MEK/Erk途徑，敲除其的表達(dá)將抑制MM細(xì)胞的增殖及促進(jìn)其凋亡，因此增加RARα2的表達(dá)可以增加RARα2表達(dá)陰性的MM細(xì)胞株對(duì)ATRA藥物作用的敏感性[12]。而對(duì)于本研究中細(xì)胞株U266均為RARα2(-)表達(dá)的細(xì)胞株，磷酸化缺陷型RARα1受體與ATRA一樣均可以抑制其細(xì)胞增殖，提示在缺少RARα2表達(dá)的細(xì)胞中ATRA主要通過(guò)降低RARα1的磷酸化來(lái)發(fā)揮抑制MM細(xì)胞增殖的作用。

RARα作為一種磷酸化蛋白，正常情況下增強(qiáng)其磷酸化水平可促進(jìn)細(xì)胞的增殖，在細(xì)胞核受體途徑進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用。RARα1受體通過(guò)與cyclin H及 CDK 結(jié)合導(dǎo)致RARα1受體AF-1反式激活區(qū)域的第77位絲氨酸磷酸化可增強(qiáng)RARα1受體的轉(zhuǎn)錄激活作用[5, 13]，增強(qiáng)細(xì)胞增殖能力，磷酸化缺陷型的RARα1受體可以模擬維甲酸的作用，對(duì)EGFR產(chǎn)生作用，介導(dǎo)AP-1的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞G1期阻滯從而減少細(xì)胞進(jìn)入S期的量達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[8]。研究顯示ATRA通過(guò)抑制CAK復(fù)合物(cyclinH, CDK,MAT1)活性抑制RARα1受體磷酸化后可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖及促進(jìn)癌細(xì)胞再分化，將磷酸化缺陷型RARα1受體(RARαS77A)整合到腫瘤細(xì)胞內(nèi)同樣可以發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖及促進(jìn)癌細(xì)胞再分化的作用，其作用在急性早幼粒白血病、骨肉瘤及神經(jīng)母細(xì)胞瘤中已得到證實(shí)[9, 10, 14]。

Figure 5. The expression of Rb and P53 in U266 cells treated with ATRA or transfected with lentivirus RARαS77A detected by Western blotting. A：Rb expression in U266 cells treated with ATRA；B: Rb expression in U266 cells transfected with lentivirus RARαS77A; C:P53 expression in U266 cells treated with ATRA ; D: P53 expression in U266 cells transfected with lentivirus RARαS77A .

圖5RARαS77A過(guò)表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染或ATRA處理后U266細(xì)胞Rb和P53蛋白的表達(dá)

圖6RARαS77A過(guò)表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染或ATRA處理后U266細(xì)胞Rb和P53蛋白的表達(dá)

本研究將磷酸化缺陷型維甲酸受體RARα1(RARαS77A)過(guò)表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染人MM細(xì)胞U266中，發(fā)現(xiàn)其可以模擬ATRA的作用抑制U266細(xì)胞增殖，且磷酸化缺陷型維甲酸受體RARα1與ATRA一樣在作用U266細(xì)胞后均可出現(xiàn)Rb蛋白表達(dá)的升高及P53蛋白表達(dá)的下降。既往研究已經(jīng)證實(shí)Rb是一種抑癌基因，其表達(dá)升高可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)和形成，而正常的p53基因也是一種腫瘤抑制基因，但在惡性腫瘤細(xì)胞中50%以上的p53基因會(huì)出現(xiàn)該基因的突變，成為了一種腫瘤的促進(jìn)因子，而本研究U266細(xì)胞中的p53基因是屬于突變型的[15]。因此本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)磷酸化缺陷型維甲酸受體RARα1可以模擬ATRA抑制MM細(xì)胞增殖，其作用均是通過(guò)上調(diào)Rb蛋白表達(dá)及下調(diào)P53蛋白表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)在ATRA抑制MM細(xì)胞增殖的作用中，降低維甲酸受體RARα1的磷酸化是重要的作用途徑，對(duì)維甲酸相關(guān)藥物的研發(fā)有重要意義。

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Effectsofphosphorylation-defectiveretinoicacidreceptorα1onproli-ferationofhumanmultiplemyelomacellsinvitro

GUO Xiao-juan1, ZHENG Dong1, WANG An-xun2, LI Juan1, XIA Ying1

(1DepartmentofHematology;2DepartmentofOralSurgery,TheFirstAffiliatedHospital,SUNYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:zcxzd@tom.com)

AIM: To investigate the effect of phosphorylation-defective retinoic acid receptor α1 (RARα1) on the proliferation of human multiple myeloma cells.METHODSThe mRNA expression of RARα subtypes in U266 cells was detected by RT-PCR. Lentiviral plasmid construction, viral production, titer determination and cell transfection were carried out by the general methods of molecular biology. Proliferation analysis was performed with CCK-8 assay. The U266 cells were treated with all-transretinoic acid (ATRA,0～100 μmol/L) or transfected with lentivirus RARαS77A. The expression levels of proliferation-related proteins, P53 and Rb, in U266 cells treated with ATRA or transfected with lentivirus RARαS77A were detected by Western blotting.RESULTSRARα1 was positively expressed in U266 cells and RARα2 expression was negative. ATRA significantly inhibited the proliferation of U266 cells in a dose- and time-dependent manner. Proliferation of U266 cells was significantly inhibited 48 h after transfection with lentivirus RARαS77A, and the inhibitory rate was 15.16%±3.84%. The up-regulated expression of Rb and down-regulated expression of P53 were detected in U266 cells not only in the cells treated with ATRA, but also in the cells transfected with lentivirus RARαS77A.CONCLUSIONPhosphorylation-defective RARα1 (RARαS77A) mimics the growth inhibitory effect of ATRA on U266 cells that express RARα1 (+) and RARα2 (-) via down-regulating the expression of P53 and up-regulating the expression of Rb, suggesting that the antiproliferative effect of ATRA is mainly mediated by decreasing the phosphorylation of RARα1.

Multiple myeloma; Receptors, retinoic acid; Phosphorylation; Cell proliferation

R453.9

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.05.009