脂聯(lián)素對(duì)大鼠缺血再灌注心肌縫隙連接蛋白43表達(dá)的影響

喬英艷， 王晉青, 張 玖

(1山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院超聲科，山西 太原 030001；2太原市第二人民醫(yī)院麻醉科，山西 太原 030002)

1000-4718(2012)03-0464-06

2011-08-11

2011-12-02

△通訊作者 Tel：0351-3365624；E-mail:qiaoyingyan@163.com

脂聯(lián)素對(duì)大鼠缺血再灌注心肌縫隙連接蛋白43表達(dá)的影響

喬英艷1△， 王晉青2, 張 玖1

(1山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院超聲科，山西 太原 030001；2太原市第二人民醫(yī)院麻醉科，山西 太原 030002)

目的觀察脂聯(lián)素(APN)對(duì)大鼠缺血再灌注心肌縫隙連接蛋白43(Cx43)表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討其抗心律失常的可能機(jī)制。方法將48只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分成：(1)假手術(shù) (SM)組；(2)缺血再灌注(I/R)組：結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，30 min后松開(kāi)結(jié)扎線，再灌注120 min；(3)脂聯(lián)素+缺血再灌注組1(I/R+APN1)：先阻斷血流30 min，于再灌注120 min開(kāi)始時(shí)給予3.5 μg/kg APN；(4)脂聯(lián)素+缺血再灌注組2(I/R+APN2)：缺血前10 min給予3.5 μg/kg APN，余同I/R組。觀察各組心律失常的發(fā)生情況；應(yīng)用RT-PCR觀察各組心室肌細(xì)胞Cx43基因表達(dá)；用免疫組織化學(xué)方法觀察Cx43分布的變化；應(yīng)用硫代巴比妥酸(TBA)法和黃嘌呤氧化酶法測(cè)各組動(dòng)物血清中丙二醛(MDA)的含量和超氧化物歧化酶(SOD)的活性；用RT-PCR及Western blotting法分析內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)mRNA及蛋白的表達(dá)，用電鏡觀察各組心室肌超微結(jié)構(gòu)的改變。結(jié)果(1)I/R組與SM組比較，心律失常評(píng)分和血清MDA含量顯著增高(P<0.01)，SOD活性降低(P<0.01)；心室肌Cx43表達(dá)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，Cx43分布紊亂，失去正常的規(guī)律性；心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)有明顯損傷；心室肌eNOS mRNA及蛋白的表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。(2)無(wú)論缺血前還是缺血后使用脂聯(lián)素處理，與I/R組相比，心律失常評(píng)分顯著降低(P<0.01)；Cx43及eNOS表達(dá)增高(P<0.01)，Cx43分布紊亂的程度減輕；心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷明顯改善。結(jié)論APN可能通過(guò)氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)Cx43的功能，從而發(fā)揮抗缺血/再灌注心律失常的作用。

脂聯(lián)素; 連接蛋白43; 再灌注; 心律失常; 一氧化氮合酶

心肌缺血再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)損傷是指當(dāng)缺血心肌恢復(fù)血液灌注后，出現(xiàn)超微結(jié)構(gòu)、功能、代謝及電生理方面的進(jìn)一步損傷，其主要表現(xiàn)為再灌注后心律失常、微血管功能障礙、心肌頓抑及心肌細(xì)胞的損傷和凋亡或死亡[1]，是臨床上加重心肌損害、導(dǎo)致心律失常發(fā)生的重要原因，嚴(yán)重影響心臟病患者的生活質(zhì)量和預(yù)后?？p隙連接(gap junction，GJ)結(jié)構(gòu)和功能變化所引起的電脫耦聯(lián)是引起缺血性心律失常的重要因素。GJ主要成分為連接蛋白(connexin，Cx)，其中Cx43是哺乳動(dòng)物心肌細(xì)胞間最主要的連接蛋白，Cx43的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變可直接引起心肌組織的阻抗增加、電導(dǎo)性下降，出現(xiàn)GJ的電脫偶聯(lián)現(xiàn)象，導(dǎo)致折返性電活動(dòng)的發(fā)生， 研究表明，Cx43表達(dá)含量和分布與室性心律失常關(guān)系密切，對(duì)維持心臟傳導(dǎo)具有重大意義[2-4]。

脂聯(lián)素(adiponectin,APN)是脂肪組織分泌的血漿蛋白，具有促進(jìn)葡萄糖的利用和脂肪酸的氧化、降低血糖以及改善胰島素抵抗的功能[5-6]。近年研究表明，脂聯(lián)素在心肌缺血再灌注損傷以及病理性的心室重構(gòu)等心臟病理過(guò)程中發(fā)揮保護(hù)作用[7]，研究表明，脂聯(lián)素能減少心肌缺血再灌注性心律失常，部分機(jī)制可能通過(guò)保護(hù)缺血心肌血管內(nèi)皮功能的完整性，穩(wěn)定心電活動(dòng)，減少心律失常的發(fā)生[8]。但是否與改善Cx43的重塑過(guò)程，從而抑制缺血引起的縫隙連接脫偶聯(lián)現(xiàn)象，最終抑制因缺血導(dǎo)致的心律失常，尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)在制作大鼠心臟缺血/再灌注損傷模型的同時(shí)，觀察脂聯(lián)素對(duì)缺血/再灌注性心律失常以及Cx43基因和蛋白表達(dá)的影響，并在此基礎(chǔ)上探討脂聯(lián)素抗缺血/再灌注性心律失常的機(jī)制。

材 料 和 方 法

1材料

清潔級(jí)SD大鼠，體重(250±20)g，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。脂聯(lián)素購(gòu)自Sigma。Total RNA Kit購(gòu)自O(shè)mega， PrimeScriptTMRT Reagent Kit和Premix Taq購(gòu)自TaKaRa。Cx43抗體購(gòu)自Cell Signaling。SP免疫組化試劑盒和DAB試劑盒購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)有限公司。

2方法

2.1大鼠心臟缺血/再灌注損傷模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組 用30 g/L戊巴比妥鈉麻醉大鼠(1.5 mL/kg，ip)，氣管插管，接微型動(dòng)物呼吸機(jī)。而后于大鼠胸骨左緣第4～5肋間開(kāi)胸，暴露心臟，剪開(kāi)心包膜，在冠狀動(dòng)脈左前降支(left anterior descending,LAD)距左心耳下緣約2 mm處穿線(6/0絲線)，再用直徑約0.2 cm乳膠管穿過(guò)結(jié)扎線。心肌缺血時(shí)用止血鉗夾緊結(jié)扎線，再灌注時(shí)將結(jié)扎線松開(kāi)。以心電圖ST段明顯抬高、結(jié)扎線以下心肌顏色變暗、出現(xiàn)紫紺作為心肌缺血標(biāo)志，再灌注時(shí)心肌缺血區(qū)顏色逐漸轉(zhuǎn)為紅色、紫紺消失。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取心肌缺血區(qū)置于4%多聚甲醛固定液中固定。

將48只大鼠編號(hào)，按隨機(jī)原則分為4組，每組12只：(1)假手術(shù) (sham operation，SM)組：不結(jié)扎LAD；(2)I/R組：結(jié)扎LAD， 30 min后松開(kāi)結(jié)扎線，再灌注120 min；(3)I/R+APN1組：先阻斷血流30 min，于再灌注120 min開(kāi)始時(shí)給予3.5 μg/kg APN；(47)I/R+APN2組：缺血前10 min給予3.5μg/kg APN，余同I/R組。

2.2各組心律失常發(fā)生情況 心律失常的分析判斷按照Lambeth會(huì)議標(biāo)準(zhǔn)，分別全程記錄模型制備成功后1 h內(nèi)心電圖，觀察室性心律失常[包括室性期前收縮(ventricular extrasystole,VE)、室性心動(dòng)過(guò)速(ventricular tachycardia,VT)和室顫]的發(fā)生情況。室性心律失常評(píng)分(ventricular arrhythmia scores，VAS)參考文獻(xiàn)[13]的評(píng)分規(guī)則，具體如下：各組VE數(shù)<5計(jì)為0分；≥5計(jì)為1分；只有1次<60 s的VT計(jì)為2分；有多次VT，總持續(xù)時(shí)間<60 s，或只有1次≥60 s VT均計(jì)為3分；有多次VT，總持續(xù)時(shí)間≥60 s計(jì)為4分；出現(xiàn)可恢復(fù)室顫計(jì)為5分；出現(xiàn)于觀察期間不可恢復(fù)的室顫計(jì)為6分。

2.3逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR) 將組織充分研磨后，使用Total RNA Kit提取組織總RNA，用PrimeScriptTMRT Reagent Kit對(duì)提取的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。Cx43上游引物5’-GCGGCTTGCT GAGAACC-3’，下游引物 5’-TTGCGGCACGAGGAATT-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為454 bp。GAPDH為內(nèi)參照，上游引物5’-TCCCTCAAGATTGTCAGCAA-3’，下游引物5’-AGATCCACAACGGATACATT-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度318 bp。內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)上游引物5’-GAGTCCTCACCGCCTTCTC-3’，下游引物5’-AGGAAGCGGGTGGCAGTA-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度198 bp。取擴(kuò)增產(chǎn)物各6 μL，在1.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶染色，電壓80 V，時(shí)間60 min。Kadak生物凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描，分別測(cè)Cx43、eNOS和GAPDH條帶的吸光度值(absorbance，A)，計(jì)算Cx43或eNOS與GAPDH的A值比。

2.4免疫組織化學(xué)染色 切片常規(guī)脫蠟至水化，按SP免疫組化試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行Cx43免疫組化染色，經(jīng)DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水干燥、透明、中性樹(shù)膠封片，在Olympus 40倍物鏡下每張切片選取不重疊、不斷裂的5個(gè)清晰視野，共選15個(gè)視野，在切片空白處測(cè)量背底，取其平均值作為校正的基礎(chǔ)值。測(cè)定每個(gè)視野下陽(yáng)性物質(zhì)的平均吸光度。各測(cè)量數(shù)據(jù)由計(jì)算機(jī)自動(dòng)統(tǒng)計(jì)得出。

2.5Western blotting檢測(cè)eNOS蛋白表達(dá) 提取組織蛋白，用Bradford方法測(cè)定蛋白濃度。制作12%的分離膠和5%的積層膠，每泳道上樣量60 μg，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜， 5%脫脂奶粉溶液(溶于TBS-T緩沖液中)室溫封閉3 h，分別加入小鼠抗eNOS蛋白單克?、窨?1∶1 000)和小鼠抗GAPDH單克隆Ⅱ抗(1∶2 000)，4 ℃孵育過(guò)夜，TBS-T溶液洗膜4次，每次15 min。室溫下加相應(yīng)Ⅱ抗(1∶6 000)孵育2 h，同前法洗膜4次，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，X光片曝光顯影，凝膠成像分析系統(tǒng)攝像分析。

2.6血清超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性及丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量的測(cè)定 再灌結(jié)束時(shí)，分離頸動(dòng)脈取血5～6 mL，靜置30 min，2 000×g離心15 min，取上清，利用722光柵分光光度計(jì)進(jìn)行SOD活性及MDA含量的測(cè)定，分別采用采用黃嘌呤氧化酶法及硫代巴比妥酸法測(cè)定，具體按照試劑盒操作進(jìn)行。

2.7超微結(jié)構(gòu)觀察 實(shí)驗(yàn)結(jié)束，于左室前壁缺血區(qū)快速剪下1 mm3大小的心肌組織數(shù)塊，迅速置于4 ℃預(yù)冷的2%戊二醛溶液中，用利刀切成0.5 mm3大小的組織塊，選取切割規(guī)整的組織塊于4%戊二醛溶液中4 ℃固定2 h，PBS緩沖液漂洗3次，每次10 min，1%餓酸4℃后固定2 h，PBS緩沖液充分清洗3次，每次15 min，梯度乙醇(50%-70%-80%-90%-95%)脫水各1次，每次10 min，100%乙醇3次，每次15 min，包埋劑浸透37 ℃過(guò)夜，包埋，60 ℃下聚合36 h，修塊，超薄切片，醋酸鈾閉光染色30 min，蒸餾水漂洗，濾紙吸干，檸檬酸鉛染色15 min。JEOL-100CX高分辨透射電鏡觀察拍照。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1各組室性心律失常的發(fā)生情況

結(jié)果顯示，假手術(shù)組極少有室性心律失常發(fā)生，既有個(gè)別VE出現(xiàn)，未發(fā)生VT；缺血再灌注組心電圖ST段明顯抬高，大多出現(xiàn)VT，其中一只發(fā)生室顫經(jīng)心臟按壓后無(wú)效死亡，與假手術(shù)組比較，VAS評(píng)分顯著增高，VT總持續(xù)時(shí)間顯著延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與缺血再灌注組相比，無(wú)論缺血前還是缺血后給予脂聯(lián)素處理，在再灌注期間也可出現(xiàn)VE和VT，但無(wú)室顫發(fā)生，VAS評(píng)分明顯降低，VT總持續(xù)時(shí)間明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；脂聯(lián)素組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1各組室性心律失常的發(fā)生情況

GroupVT(s)VF(s)VASSM2.30±6.19 00.53±0.79I/R67.05±25.51** 10.10±26.32**3.65±1.28**I/R+APN126.23±29.43**▲▲ 0▲▲2.20±1.19**▲▲I/R+APN227.13±28.05**▲▲ 0▲▲2.25±1.04**▲▲

**P<0.01vsSM group;▲▲P<0.01vsI/R group.

2RT-PCR半定量分析Cx43的表達(dá)

在缺血再灌注組的心肌組織內(nèi)Cx43 mRNA的表達(dá)水平與假手術(shù)組相比降低，差異顯著(P<0.01)；脂聯(lián)素處理組的心肌組織內(nèi)Cx43 mRNA表達(dá)水平與缺血再灌注組相比明顯增加，差異顯著(P<0.01)；而脂聯(lián)素兩組之間心肌組織內(nèi)Cx43 mRNA表達(dá)水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)圖1。

3免疫組化染色觀察心室肌Cx43的表達(dá)

光鏡下見(jiàn)在SM組Cx43棕黃色顆粒強(qiáng)表達(dá)，呈規(guī)律條帶狀分布，大多分布在心肌纖維長(zhǎng)軸垂直的細(xì)胞端-端相接即閏盤處，少數(shù)位于與心肌纖維長(zhǎng)軸平行的細(xì)胞側(cè)-側(cè)相接的部位，見(jiàn)圖2A；在I/R組，Cx43表達(dá)明顯減弱，著色斑點(diǎn)大小不一、深淺不等，分布不均，大多分布在心肌細(xì)胞側(cè)-側(cè)連接處或細(xì)胞質(zhì)中，而閏盤處僅有少數(shù)，呈彌散點(diǎn)或條狀，無(wú)規(guī)則，見(jiàn)圖2B；I/R+APN1組和I/R+APN2組與I/R組相比，Cx43表達(dá)明顯改善，大小較一致，分布較均一，且I/R+APN1組比I/R+APN2組Cx43表達(dá)及分布更接近于SM組，但是無(wú)顯著差異，見(jiàn)圖2C、D。圖像半定量結(jié)果分析可知，后3組與SM組相比，Cx43表達(dá)降低，差異顯著(P<0.01)；I/R+APN組Cx43表達(dá)較I/R組明顯增高(P<0.01)；I/R+APN兩組間無(wú)顯著差異 (P>0.01)，見(jiàn)圖2、表2。

圖1不同組別Cx43mRNA水平的變化

Figure 2. Comparison of connexin 43 expression in the myocardium of rats in different groups (immunohistochemistry,×400).A: SM group; B: I/R group; C: I/R+APN1 group; D: I/R+APN2 group.

圖2免疫組化觀察各組Cx43的表達(dá)

表2免疫組化觀察各組Cx43的表達(dá)

GroupAvalueSM0.448±0.033I/R0.289±0.035I/R+APN10.342±0.021**▲▲I/R+APN20.406±0.035**▲▲

**P<0.01vsSM group;▲▲P<0.01vsI/R group.

4血清MDA和SOD的變化

與假手術(shù)組相比，缺血再灌注組血清MDA含量增高，血清SOD活性降低，與缺血再灌注組相比，I/R+APN1組及I/R+APN2組的血清MDA含量明顯降低，血清SOD活性顯著增高，兩組間血清SOD活性及MDA含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表3各組血清SOD活性和MDA含量的變化

GroupSOD(kU/L)MDA(μmol/L)SM178.56±17.186.30±1.41I/R129.59±13.12**19.79±2.27**I/R+APN1147.06±15.23**▲▲12.52±2.94**▲▲I/R+APN2156.08±13.67**▲▲9.95±1.61**▲▲

**P<0.01vsSM group;▲▲P<0.01vsI/R group.

5RT-PCR及Westernblotting法分析eNOSmRNA及蛋白的表達(dá)

在缺血再灌注組的心肌組織內(nèi)eNOS mRNA的表達(dá)水平與假手術(shù)組相比降低，差異顯著(P<0.01)；在脂聯(lián)素處理組，心肌組織內(nèi)eNOS mRNA表達(dá)水平與缺血再灌注組相比明顯增加，差異顯著(P<0.01)；而在脂聯(lián)素組間心肌組織內(nèi)eNOS mRNA表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，蛋白表達(dá)同基因表達(dá)趨勢(shì)相一致，見(jiàn)圖3、4。

6透射電鏡下觀察心肌纖維形態(tài)學(xué)變化

(1)在SM組：心肌纖維排列連續(xù)規(guī)則，閏盤結(jié)構(gòu)完整、清晰，可見(jiàn)橋粒、黏著膜和間隙連接；線粒體呈勻質(zhì)樣改變，峭排列整齊，見(jiàn)圖5A。(2)I/R組：心肌損傷嚴(yán)重，肌絲結(jié)構(gòu)排列紊亂，溶解，斷裂。閏盤斷裂、移位，間隙連接增寬；線粒體明顯腫脹，空泡樣變性，嵴排列紊亂，嵴突斷裂、消失，見(jiàn)圖5B。(3)I/R+APN組：無(wú)論缺血前還是缺血后給予APN，心肌超微結(jié)構(gòu)損傷均較輕，肌絲排列整齊，肌節(jié)清晰。閏盤結(jié)構(gòu)部分模糊，間隙連接略增寬，線粒體輕度水腫，空泡樣變性減輕，圖5C、D。

圖3不同組別eNOSmRNA水平的變化

圖4不同組別eNOS蛋白水平的變化

Figure 5. The morphological changes of the myocardial tissue in different groups examined by electron microscopy(×1 500). A: SM group; B: I/R group; C: I/R+APN1 group; D:I/R+APN2 group.

圖5透射電鏡下觀察心肌纖維形態(tài)學(xué)變化

討 論

心肌細(xì)胞GJ由相鄰心肌細(xì)胞膜通過(guò)相互緊密作用形成，主要分布在閏盤。GJ的主要功能是介導(dǎo)相鄰細(xì)胞間電和化學(xué)信號(hào)的傳遞，確保細(xì)胞間電偶聯(lián)與機(jī)械偶聯(lián)得以正常進(jìn)行[9-10]。既往研究表明在心肌缺血/再灌注時(shí)，由于氧自由基生成增加、酸中毒及鈣超載等因素導(dǎo)致心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)明顯破壞、心功能受損，可以發(fā)生心律失常。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，正常情況下Cx43主要位于閏盤內(nèi)，縱切面上呈線狀、條帶狀排列，與細(xì)胞長(zhǎng)軸方向垂直，少數(shù)位于細(xì)胞的側(cè)側(cè)連接處，與細(xì)胞長(zhǎng)軸平行，著色斑點(diǎn)清晰，大小一致、分布均一，與以往的研究相同[11]。心室肌經(jīng)缺血再灌注后，Cx43的表達(dá)顯著減少，分布彌散至心肌細(xì)胞長(zhǎng)軸的側(cè)面及細(xì)胞內(nèi)，且著色斑點(diǎn)大小不一、分布不均、深淺不等，RT-PCR 結(jié)果顯示Cx43 mRNA轉(zhuǎn)錄水平下降，提示缺血再灌注Cx43的含量下降、分布紊亂可導(dǎo)致GJ脫偶聯(lián)，通道電阻增加，使得局部發(fā)生傳導(dǎo)緩慢和傳導(dǎo)阻滯，心肌興奮性不一致，從而誘發(fā)折返性心律失常的發(fā)生[12-13]。

APN是由脂肪細(xì)胞分泌的膠原樣蛋白質(zhì)，在體內(nèi)通過(guò)結(jié)合其受體AdipoR1與AdipoR2，激活下游的AMPK，使之磷酸化，引發(fā)脂肪酸氧化、糖攝入和乳酸生成等反應(yīng)，在外周組織發(fā)揮降低血糖、改善胰島素抵抗等生理功能。近年研究表明，APN還參與了I/R損傷的心肌保護(hù)[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，APN使缺血再灌注所致的心室肌Cx43的降解程度較單純?nèi)毖俟嘧⒔M減輕，分布紊亂的狀況得以改善；使缺血再灌注心室肌Cx43 mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯升高，其變化趨勢(shì)與免疫組化結(jié)果的Cx43含量變化一致。同時(shí)也觀察到給予APN后，再灌注心律失常發(fā)生減少，室性心律失常評(píng)分降低。這提示APN有明顯改善I/R造成的損傷型ST段改變的作用，同時(shí)顯著減少了再灌注心律失常的發(fā)生，可能是由于APN具有改善心肌Cx43重塑的作用。

eNOS是內(nèi)皮細(xì)胞中重要的功能蛋白，活化的eNOS催化L-精氨酸產(chǎn)生NO，后者作為重要的第二信使激活復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而發(fā)揮其心血管保護(hù)作用，包括舒張血管、抗細(xì)胞增殖及抗動(dòng)脈粥樣硬化等[15]。缺血再灌注時(shí)產(chǎn)生大量的氧自由基，細(xì)胞內(nèi)ROS增加，氧化應(yīng)激使eNOS活性降低，NO合成減少。Bopassa等[16]的研究則發(fā)現(xiàn)用人的eNOS基因轉(zhuǎn)染大鼠后顯著減少心肌膠原聚集和TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞，并且發(fā)現(xiàn)NO的保護(hù)作用伴隨著NADH、NADPH氧化酶活性降低及超氧化物生成減少。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，與單純?nèi)毖俟嘧⒔M相比，APN組SOD和eNOS活性顯著升高，MDA含量顯著降低。研究表明，氧化應(yīng)激可能參與了心肌Cx43的脫磷酸化[17]。APN可能通過(guò)保護(hù)細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)完整性和強(qiáng)大的抗氧化作用對(duì)Cx43的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生有利作用，降低缺血再灌注引起的室性心律失常的發(fā)生率，并對(duì)缺血再灌注后心功能的穩(wěn)定與恢復(fù)發(fā)揮積極作用。

總之，本研究表明APN可以通過(guò)氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)縫隙連接蛋白Cx43的功能，從而發(fā)揮抗缺血/再灌注心律失常的作用，其具體機(jī)制仍待于進(jìn)一步探討。

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Effectsofadiponectinonexpressionofconnexin43inratmyocardiumduringischemia-reperfusion

QIAO Ying-yan1, WANG Jin-qing2, ZHANG Jiu1

(1DepartmentofUltrasound,TheSecondHospitalofShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China;2DepartmentofAnesthesiology,TheSecondPeople’sHospitalinTaiyuan,Taiyuan030002,China.E-mail:qiaoyingyan@163.com)

AIM: To observe the effects of adiponectin(APN) on the expression of connexin 43 (Cx43) in rat myocardium during ischemia-induced arrhythmias.METHODSThe SD rats were randomly divided into 4 groups (n=12): sham operation group (SM group), ischemia and reperfusion group (I/R group), I/R+adiponectin(APN1) group: pre-ischemia with 3.5 μg/kg of APN; I/R+APN2 group: post-ischemia with 3.5 μg/kg of APN. The incidence of ventricular arrhythmias and ventricular arrhythmia score (VAS) were determined. The expression of Cx43 in the ischemic myocardium was studied by the techniques of immunohistochemistry and RT-PCR. The levels of malondialdehyde(MDA) and superoxide dismutase(SOD) were measured by the methods of xanthine oxidase and thiobarbituric acid. The expression of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) at mRNA and protein levels was determined by RT-PCR and Western blotting,respectively.The morphological changes of the myocardial tissues were observed under electronic microscope.RESULTSThe VAS and concentration of MDA increased obviously and the activity of SOD was decreased in I/R group as compared with SM group (P<0.01). The expression of Cx43 was evidently decreased and the distribution of Cx43 in the myocardium was disturbed. The expression of eNOS at mRNA and protein levels was decreased in I/R group (P<0.05). The ultrastructure of ventricular myocardium was abnormal in I/R group. Compared with I/R group, APN obviously decreased the VAS caused by ischemia and reperfusion (P<0.01) no matter the drug was given before or after ischemia. APN increased the activity of SOD, inhibited the MDA content in serum, and resulted in normal distribution of Cx43 and increased the expression of Cx43 and eNOS. Compared with I/R group, the changes of heart ultrastructure attenuated greatly in APN group, but didn’t recover to normal state.CONCLUSIONAdiponectin antagonizes the arrhythmias during myocardial ischemia and reperfusion via inhibiting oxidative stress and regulating Cx43.

Adiponectin; Connexin 43; Reperfusion; Arrhythmias; Nitric oxide synthase

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.03.014