新型腹腔降溫法對心肺復(fù)蘇后兔炎癥反應(yīng)的影響*

魏紅艷， 李 欣， 廖曉星， 戴 瑄， 劉 榮， 李穎慶， 胡春林△

(1中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科，廣東 廣州 510080； 2廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院急診科，廣東 廣州 510120)

1000-4718(2012)09-1559-06

2012-04-13

2012-07-13

廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. S201040003615)；教育部博士點(diǎn)新教師基金資助項(xiàng)目(No. 20110171120066)

△通訊作者 Tel：020-87755766-8500;E-mail：hu-chunlin@163.com

新型腹腔降溫法對心肺復(fù)蘇后兔炎癥反應(yīng)的影響*

魏紅艷1， 李 欣1， 廖曉星1， 戴 瑄1， 劉 榮2， 李穎慶1， 胡春林1△

(1中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科，廣東 廣州 510080；2廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院急診科，廣東 廣州 510120)

目的觀察心肺復(fù)蘇(CPR)后不同降溫方法對自主循環(huán)恢復(fù)(ROSC)后兔炎癥反應(yīng)的影響。方法48只新西蘭成年大白兔，采用交流電致顫的方式建立CPR模型， 依據(jù)降溫方式的不同，隨機(jī)分為常溫組(NT)、腹腔內(nèi)降溫組(PC)、體表降溫組(SC)和頭部局部降溫組(LC)。觀察不同降溫方法對ROSC后血漿TNF-α和IL-6濃度的影響，ROSC后12 h取肝臟組織，Western blotting檢測NF-κB p65和NF-κB p50蛋白表達(dá)。記錄每組動物的存活時(shí)間并進(jìn)行比較。結(jié)果ROSC后4 h、8 h和12 h，PC組血漿TNF-α水平顯著低于NT組；至12 h時(shí)PC組也顯著低于SC組和LC組(P<0.05)；ROSC后2 h、4 h、8 h和12 h，PC組血漿IL-6水平明顯低于NT組(P<0.05)，而與SC、LC組間無顯著差異。ROSC后12 h，PC組肝核蛋白內(nèi)NF-κB p65和p50蛋白表達(dá)水平顯著低于其它各組(P<0.05)，而其它3組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ROSC后PC組動物的存活率顯著高于NT、SC和LC組(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論CPR后腹腔降溫法可快速誘導(dǎo)亞低溫和降低腹腔內(nèi)溫度，抑制肝臟內(nèi)NF-κB的激活，降低血漿TNF-α和IL-6水平，減輕ROSC后全身炎癥反應(yīng)，延長動物存活時(shí)間。

心肺復(fù)蘇; 低溫; 腹腔降溫法; 炎癥

隨著心肺復(fù)蘇(cardiopulmonary resuscitation, CPR)技術(shù)的發(fā)展，心源性猝死患者的自主循環(huán)恢復(fù)(return of spontaneous circulation, ROSC)率有了極大提高，但是總的出院存活率還不高，大約75% ROSC患者死于復(fù)蘇后綜合征，過度的炎癥反應(yīng)是引起這一綜合癥的重要機(jī)制。近年的研究表明亞低溫可以提高CPR病人的出院存活率和改善神經(jīng)功能[1]。炎癥反應(yīng)是缺血再灌注后引起組織損傷的重要機(jī)制之一[2]，在各種缺血再灌注損傷的模型中，低溫都顯示出了對這一過程的強(qiáng)大抑制作用，對炎癥反應(yīng)的影響是亞低溫減輕缺血再灌注后組織損傷的重要機(jī)制。但臨床研究中亞低溫并沒有減輕ROSC后的炎癥反應(yīng)[3]，可能和降溫方法有關(guān)。動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ROSC后血漿致炎因子迅速升高，部分在1 h內(nèi)達(dá)到峰值[3]，因而，ROSC后應(yīng)迅速、有效地降溫才有可能減輕炎癥反應(yīng)，擴(kuò)大亞低溫的保護(hù)作用。

我們前期的研究表明CPR后肝臟可能是產(chǎn)生致炎因子的主要來源[4]，新型腹腔降溫法可直接作用于腹部，快速降低肝、脾臟器官的溫度，理論上具有更強(qiáng)的抑炎效果[5]。因此我們假設(shè)新型腹腔降溫法可能較其它降溫方法更能減輕ROSC后全身炎癥反應(yīng)，從而改善預(yù)后。本研究觀察腹腔降溫法對ROSC后全身炎癥反應(yīng)的影響，闡明CPR后經(jīng)腹腔降溫的優(yōu)勢，為該方法進(jìn)入臨床奠定理論基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1動物

48只新西蘭成年大白兔，雌雄不拘，由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，所有實(shí)驗(yàn)經(jīng)中山大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)倫理委員會批準(zhǔn)。動物購進(jìn)后在SPF級動物房飼養(yǎng)1周，實(shí)驗(yàn)前晚禁食不禁水。動物麻醉：1%戊巴比妥鈉(Sigma)30 mg/kg，由耳緣靜脈注入，給予1/4的首劑量維持。

2動物模型的建立

按照我們前期的方法建立室顫心臟驟停CPR模型[1]。誘發(fā)室顫成功的標(biāo)準(zhǔn)為：動脈搏動消失，血壓迅速下降，接近0 mmHg，心電圖顯示室顫波形，持續(xù)室顫5 min后開始CPR。先給予2 min的心前區(qū)胸外按壓，按壓頻率200次/min，按壓深度為前后胸徑的1/3，同時(shí)給予腎上腺素20 μg·kg-1·(3 min)-1。按壓2 min后給予25 J的能量除顫(除顫儀，Cardiopace)，所有的胸外按壓均由同一實(shí)驗(yàn)人員實(shí)施。反復(fù)進(jìn)行上述CPR周期，如15 min未出現(xiàn)ROSC，宣布復(fù)蘇失敗。ROSC的標(biāo)準(zhǔn)為恢復(fù)室上性心率，平均動脈壓>60 mmHg持續(xù)10 min以上。

3實(shí)驗(yàn)分組和溫度控制

48只兔根據(jù)隨機(jī)數(shù)字分為4組：①常溫治療組(normothermic treatment, NT)，ROSC后放置在37℃恒溫箱內(nèi)，維持核心溫度在正常范圍內(nèi)；②腹膜腔內(nèi)降溫治療組(peritoneal cooling treatment, PC)，按照我們前期研究方法，ROSC后向兔腹腔內(nèi)灌注80 mL/kg 4 ℃低溫液體進(jìn)行誘導(dǎo)亞低溫和維持亞低溫[5]；③體表降溫治療組(surface cooling treatment, SC)，ROSC后在體表主要在頸部、腹股溝和胸腹腔周圍放置冰塊，依據(jù)降溫情況增減冰塊數(shù)量[6]；④頭部局部降溫治療組(local cooling treatment, LC)，ROSC后僅在頭部周圍放置冰塊。同時(shí)監(jiān)測鼓膜溫度(tympanic temperature，TympT)和腹腔內(nèi)溫度(peritoneal temperature, PerT)。本實(shí)驗(yàn)中動物的核心溫度鼓膜溫度的正常范圍為(39.5±0.5)℃，目標(biāo)溫度為33～35 ℃,達(dá)到目標(biāo)溫度后維持亞低溫治療12 h。

4血漿炎癥因子腫瘤壞死因子α(tumornecrosisfactorα,TNF-α)和白細(xì)胞介素6(Interleukin-6,IL-6)測定

誘發(fā)室顫前、ROSC后2、4、8和12 h取耳緣靜脈血，用ELISA法檢測炎癥因子TNF-α和IL-6濃度，TNF-α和IL-6 ELISA 檢測試劑盒購自Unionhonest，操作按說明書進(jìn)行。

5肝臟組織病理變化及核因子κB(nuclearfactorκB,NF-κB)活化情況檢測

ROSC后12 h，每組隨機(jī)通過過量麻醉的方式處死動物3只，取肝臟組織，HE染色觀察肝組織損傷及炎癥細(xì)胞浸潤情況，用Western blotting法檢測肝組織胞漿、NF- κB p65和NF-κB p50蛋白表達(dá)水平，并計(jì)算兩者的比例。Rabbit Anti-p65及p50購自北京博奧生物技術(shù)有限公司，胞漿內(nèi)參照GAPDH抗體和核蛋白內(nèi)參照PCNA抗體(Catalog No:10205-2-AP)購自Proteintech Group。

6動物存活時(shí)間的觀察

ROSC后觀察96 h，記錄每組動物的存活時(shí)間，計(jì)算、比較每組動物存活率的差異。

7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1動物分組及CPR復(fù)蘇情況

48只新西蘭大白兔每組12只，所有動物均能成功誘發(fā)室顫，交流電刺激后動脈搏動消失，血壓迅速下降；停止交流電刺激后，心電圖顯示心室顫動波形，血壓接近0 mmHg。NT、PC、SC和LC組分別有9、10、9和10只動物復(fù)蘇成功，見表1，復(fù)蘇成功率組間沒有顯著差異。各組動物的基本生理參數(shù)之間沒有差異。

表1 各組動物的自主循環(huán)恢復(fù)情況比較

2溫度控制情況

誘導(dǎo)亞低溫階段NT組動物鼓膜溫度維持在38 ℃以上，其它3組均迅速下降，其中PC組溫度下降最為迅速，達(dá)到目標(biāo)溫度的時(shí)間為(26±7)min，SC組和LC組達(dá)到目標(biāo)溫度的時(shí)間分別為(60±9)min、(69±12)min。維持亞低溫階段除NT組外，其余各組鼓膜溫度均穩(wěn)定地維持在33～35 ℃之間,見圖1。

誘導(dǎo)亞低溫階段NT組動物腹腔溫度維持38～39 ℃，LC組溫度稍降低，維持在38.5 ℃左右；其余2組腹膜溫度均明顯下降，SC組達(dá)到目標(biāo)溫度的時(shí)間為(61±6)min；PC組平均10 min左右達(dá)到目標(biāo)溫度，最低溫度為26 ℃。維持亞低溫階段NT組腹腔溫度維持在38～39 ℃之間，LC組維持在38 ℃左右，SC組維持在33～35 ℃之間，而PC組腹腔溫度始終低于鼓膜溫度1～2 ℃，維持在31～34 ℃之間，最低達(dá)到29 ℃,見圖2。

圖1誘導(dǎo)和維持亞低溫階段每組動物的鼓膜溫度變化趨勢

圖2誘導(dǎo)和維持亞低溫階段每組動物的腹腔溫度變化趨勢

3ROSC后各組血漿TNF-α和IL-6的水平變化

ROSC后各組動物均出現(xiàn)了明顯的炎癥反應(yīng)，血漿TNF-α(表2)和IL-6(表3)的水平顯著升高，TNF-α升高至基礎(chǔ)值的4～5倍，IL-6升高2～3倍，兩者約在ROSC后4 h左右達(dá)到高峰，隨后逐漸下降。ROSC后的4、8、12 h，PC組血漿TNF-α水平顯著低于NT組，P<0.05；在ROSC后12 h時(shí)，PC組血漿TNF-α水平也顯著低于其它降溫組，P<0.05；PC組血漿IL-6水平在ROSC后2、4、8、12 h均明顯低于NT組，P<0.05；其它降溫組對ROSC后血漿IL-6水平的影響不明顯。

表2 自主循環(huán)恢復(fù)后各組動物血漿TNF-α的水平比較

*P<0.05vsother groups.

表3 自主循環(huán)恢復(fù)后各組動物血漿IL-6的水平比較

*P<0.05vsother groups.

4ROSC后各組肝組織病理變化

ROSC后12 h NT組、LC組肝組織內(nèi)肝細(xì)胞索腫脹明顯，細(xì)胞邊界模糊，匯管區(qū)內(nèi)可見大量的炎癥細(xì)胞浸潤，而SC組、PC組肝細(xì)胞腫脹不明顯，細(xì)胞邊界相對清晰，匯管區(qū)內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤明顯減少，見圖3。

Figure 3. The pathological changes of liver after ROSC in each group (HE staining,×40).

圖3自主循環(huán)恢復(fù)后各組動物肝組織病理變化

5Westernblotting檢測肝臟組織內(nèi)NF-κBp65和NF-κBp50蛋白水平

ROSC后12 h肝組織內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB明顯激活，組織內(nèi)p65和p50蛋白表達(dá)水平升高，不同低溫治療方式對ROSC后肝組織內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB激活有明顯的影響。各組p65蛋白含量比較，PC組顯著低于其它各組，P<0.05，SC組、NT組和LC組之間無顯著差異，見圖4。各組肝組織內(nèi)p50蛋白含量比較，與p65相似，PC組顯著低于其它各組，P<0.05，而其它3組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖5。

6不同降溫方法對動物存活率的影響

ROSC后各組動物的存活時(shí)間用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，結(jié)果表明，PC組動物的累積生存率顯著高于其余各組(P<0.05或P<0.01)，即PC可延長動物的存活時(shí)間，見圖6。

討 論

ROSC后有大約75%患者死于復(fù)蘇后綜合征(post resuscitation syndrome, PRS)，主要表現(xiàn)為進(jìn)展性的多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)[7]。神經(jīng)功能障礙和心力衰竭是這一綜合征的兩個(gè)主要構(gòu)成部分。心跳驟停期間氧化應(yīng)激損傷激活再灌注損傷過程中的代謝級聯(lián)反應(yīng)(自由基的產(chǎn)生)和全身炎癥反應(yīng)。多項(xiàng)臨床觀察研究表明PR-MODS和全身炎癥反應(yīng)有關(guān)[8-9]。CPR后心肌內(nèi)TNF-α迅速升高，高水平的TNF-α可使收縮期心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平降低，影響心肌收縮功能，也參與心肌氧自由基的釋放，進(jìn)一步增加TNF-α的產(chǎn)生[10]。CPR后顱內(nèi)高水平的TNF-α，可使凋亡因子FasL和p53增加，通過多條途徑導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞凋亡[11]，在CPR后繼發(fā)性腦損傷中發(fā)揮重要作用。

圖4自主循環(huán)恢復(fù)后各組動物肝臟組織胞漿和胞核內(nèi)p65的表達(dá)

圖5自主循環(huán)恢復(fù)后各組動物肝臟組織胞漿和細(xì)胞核內(nèi)p50的表達(dá)

Figure 6. The effects of different cooling methods on rabbit survival time after ROSC.n=12.

圖6不同降溫方法對自主循環(huán)恢復(fù)后動物存活時(shí)間的影響

TNF-α和IL-6由腸上皮細(xì)胞、肝臟的枯否氏細(xì)胞和肺內(nèi)的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生和釋放[12]?？莘袷霞?xì)胞是人體內(nèi)最大的巨噬細(xì)胞群，占全身巨噬細(xì)胞的80%～90%，對炎癥因子的產(chǎn)生和釋放有重要的影響，其產(chǎn)生的細(xì)胞因子可以導(dǎo)致遠(yuǎn)隔器官損傷。我們前期的研究結(jié)果也表明，肝臟可能是ROSC后炎癥因子的主要來源[4]。NF-κB是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的樞紐，可促進(jìn)炎癥因子IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、 TNF-α、干擾素-γ、細(xì)胞黏附分子如E-選擇素、細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecules, ICAM-1)、血管細(xì)胞間黏附分子-1 (vascular cellular adhesion molecules, VCAM-1)和病毒蛋白的轉(zhuǎn)錄。

亞低溫能改善CPR病人的存活率和神經(jīng)功能與減輕炎癥反應(yīng)有關(guān)，但臨床研究中亞低溫并沒有減輕ROSC后的炎癥反應(yīng)[3]，可能和降溫方法有關(guān)。動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ROSC后血漿致炎因子迅速升高，部分在1h內(nèi)達(dá)到峰值[3]，因而，ROSC后應(yīng)迅速、有效降溫才有可能減輕炎癥反應(yīng)，擴(kuò)大亞低溫保護(hù)作用。當(dāng)前國內(nèi)外常用的亞低溫治療方法分為體外降溫法和體內(nèi)降溫法。體外降溫法大約需要300 min左右才能達(dá)到目標(biāo)溫度，即使是被認(rèn)為最有效的降溫方法——血管內(nèi)降溫法，達(dá)到目標(biāo)溫度也需3～4 h[13]。此外，Kuboki等[14]的研究表明肝臟枯否氏細(xì)胞內(nèi)NF-κB的激活具有溫度依賴性，中度低溫(<33 ℃)較亞低溫(33～35℃)更能抑制NF-κB的激活，但全身中度低溫可能增加惡性心律失常的發(fā)生率，抵消低溫治療的益處[15]。本研究結(jié)果表明，ROSC后腹腔降溫法可快速誘導(dǎo)亞低溫和降低腹腔內(nèi)溫度，鼓膜溫度30 min左右、腹腔溫度10 min左右就達(dá)到了目標(biāo)溫度，并且在維持亞低溫過程中使腹腔局部保持中度低溫水平，從而避免了全身過低溫的副作用，這正是其獨(dú)特的優(yōu)勢所在，因而較其體表降溫和頭部局部降溫方法更能減輕肝臟內(nèi)NF-κB的激活，從而改善ROSC后的全身炎癥反應(yīng)，延長動物的存活時(shí)間。

總之，CPR后腹腔降溫法可快速誘導(dǎo)亞低溫和降低腹腔內(nèi)溫度，抑制肝臟內(nèi)NF-κB的激活，降低血漿TNF-α和IL-6水平，減輕ROSC后全身炎癥反應(yīng)，延長動物存活時(shí)間。

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Effectsofperitonealcoolingoninflammationaftercardiopulmonaryresuscitationinrabbits

WEI Hong-yan1, LI Xin1, LIAO Xiao-xing1, DAI Xuan1, LIU Rong2, LI Ying-qing1, HU Chun-lin1

(1DepartmentofEmergencyMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China;2DepartmentofEmergencyMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalCollege,Guangzhou510120,China.E-mail:hu-chunlin@163.com)

AIM: To explore the effects of different cooling methods on systemic inflammation after cardiopulmonary resuscitation (CPR) in New Zealand rabbits.METHODSVentricular fibrillation in 48 adult New Zealand rabbits was induced by alternating current and was resuscitated after cardiac arrest for 5 min. The rabbits were randomly divided into 4 groups according to the way of cooling methods: normothermia group (NT), peritoneal cooling group (PC), surface cooling group (SC) and local cooling group (LC). The plasma concentrations of tumor necrosis factor α (TNF-α) and interleukin-6 (IL-6) were measured in each group at different time points after return of spontaneous circulation (ROSC). The liver tissues were removed 12 h after ROSC, and the levels of NF-κB p65 and NF-κB p50 were tested by Western blotting. The survival time was recorded and compared 96 h after ROSC.RESULTSThe plasma concentration of TNF-α in PC group was lower than that in NT group 4 h, 8 h and 12 h after ROSC, and was also lower than that in SC group and LC group 12 h after ROSC. The level of IL-6 in PC group was lower than that in NT group 2 h, 4 h, 8 h and 12 h after ROSC, while there was no difference between the other 2 groups. The levels of p65 and p50 in PC group were lower than those in other groups (P<0.05), while there was no difference between the other 3 groups. The cumulative survival rate after ROSC in PC group was higher than that in NT group, SC group and LC group.CONCLUSIONThe novel peritoneal cooling rapidly induces and maintains mild hypothermia, and decreases the peritoneal temperature quickly, thus inhibiting liver NF-κB activation, reducing the releases of TNF-α and IL-6, subsequently relieving systemic inflammation after ROSC and prolonging rabbit survival.

Cardiopulmonary resuscitation; Hypothermia; Peritoneal cooling; Inflammation

R541.7+8

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.09.005