MNNG誘導TERC基因沉默的16HBE細胞惡性轉化模型的建立*

朱俊峰, 黃小榮, 馮宇鵬, 周俊宜△

(中山大學中山醫(yī)學院 1生物化學與分子生物學教研室，2實驗教學中心，廣東 廣州 510080；3廣東醫(yī)學院附屬西鄉(xiāng)人民醫(yī)院泌尿外科，廣東 深圳 518102)

1000-4718(2012)07-1326-05

2011-12-30

2012-04-13

廣東省科技計劃項目(No. 2006B35502007；No.2010B031200013)；廣東省自然科學基金重點項目(No.04105351)

△通訊作者 Tel: 020-87330770； E-mail: zhoujy@mail.sysu.edu.cn

MNNG誘導TERC基因沉默的16HBE細胞惡性轉化模型的建立*

朱俊峰1, 黃小榮2, 馮宇鵬3, 周俊宜1△

(中山大學中山醫(yī)學院1生物化學與分子生物學教研室，2實驗教學中心，廣東 廣州 510080；3廣東醫(yī)學院附屬西鄉(xiāng)人民醫(yī)院泌尿外科，廣東 深圳 518102)

目的建立N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine, MNNG)誘導的人端粒酶RNA組分(telomerase RNA component,TERC)缺陷的人支氣管上皮細胞株(16HBE)惡性轉化細胞模型。方法將靶向TERC基因的shRNA干擾質粒載體轉染16HBE細胞，G418抗性克隆篩選得到穩(wěn)定轉染的16HBE-1細胞，RT-PCR檢測16HBE-1細胞TERC mRNA的干擾效率；用1 mg/L MNNG對16HBE-1細胞進行隔代染毒，每次染毒1 h；直到染毒27次轉化灶的出現。分離擴增轉化灶細胞并命名為16HBE-T，用軟瓊脂克隆形成實驗和裸鼠成瘤實驗鑒定細胞的轉化程度。結果從轉化灶分離培養(yǎng)的細胞能在軟瓊脂中生長,且轉化細胞能在裸鼠體內成瘤，HE染色后光鏡下顯示為鱗癌。結論成功建立MNNG誘導的TERC基因缺陷的16HBE細胞惡性轉化模型。

端粒酶RNA；人支氣管上皮細胞；RNA干擾；N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍

端粒酶是一個核蛋白酶復合體，可以在染色體末端增加端粒的重復序列。人端粒酶由人端粒酶逆轉錄酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)和人端粒酶RNA組分(telomerase RNA component, TERC)組成。在大多數腫瘤細胞中，端粒酶的表達水平顯著增高，如肺癌[1]、乳腺癌[2]、宮頸癌[3]等。早期資料表明，TERC的表達與端粒酶活性的調節(jié)是分離的[4]。但越來越多資料表明，TERC與端粒酶活性的維持有著密切的關系[5-9]。本研究皆在建立N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍 (N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine, MNNG) 誘導的TERC基因缺陷的16HBE細胞株惡性轉化細胞模型，從而為研究TERC在腫瘤發(fā)生階段的分子機制研究提供了理想的研究系統(tǒng)。

材 料 和 方 法

1材料

1.1細胞、質粒、菌株和裸鼠 人支氣管上皮細胞(16HBE)購自中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所；pEGFP-C1和大腸桿菌JM109均由本實驗室保存；重組質粒pEGFP-U6和pEGFP-U6-shRNA1為本實驗室構建并保存；BALB/c裸鼠購自中山大學醫(yī)學實驗動物中心。

1.2主要試劑 RPMI-1640固體培養(yǎng)基購自Gibco；MNNG購自日本東京化成工業(yè)株式會社，用RPMI-1640基礎培養(yǎng)基將MNNG溶劑配成100 mg/L儲存液，避光保存于4 ℃。用于染毒細胞時，儲存液與無血清RPMI-1640基礎培養(yǎng)基再以1∶100比例充分混合后，制成MNNG應用液直接染毒細胞。胎牛血清購自TBD；胰酶購自Amresco；DMSO購自Sigma；低熔點瓊脂粉購自Promega。

2方法

2.1細胞培養(yǎng) 16HBE細胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當細胞生長至90%融合時可進行傳代，吸去舊培養(yǎng)液，PBS洗2遍，加適量0.25%胰酶消化，37 ℃溫箱1～3 min，至顯微鏡下細胞分散成單粒狀，吸去胰酶，加完全培養(yǎng)基2～3 mL終止消化，吹打混勻至鏡下成單細胞懸液，均分到3個培養(yǎng)瓶里，補足培養(yǎng)液，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

2.2細胞轉染 應用LipofectamineTM2000(按Introgen公司試劑盒說明書)將空載體pEGFP-U6和重組質粒pEGFP-U6-shRNA1分別轉染16HBE細胞株。轉染后24 h，將細胞以1∶10的比例傳代，48 h后加G418選擇培養(yǎng)基，其篩選濃度為200 mg/L，約3周后，可見抗性克隆長出，熒光顯微鏡下標記綠色熒光克隆，經有限稀釋挑取單克隆細胞分別命名為16HBE-C1和16HBE-1，并擴大培養(yǎng)。

2.3RT-PCR方法分析干擾效率 收集對數生長期16HBE、16HBE-C1和16HBE-1細胞，總RNA提取嚴格按照RNAiso Reagent(TaKaRa)試劑說明書進行，每組細胞總RNA模板量為1 μg，用Oligo(dT)18引物逆轉錄成cDNA。以cDNA為模板，相應引物進行PCR反應，25 μL反應體系如下：2.5 μL 10×PCR buffer、0.5 μL dNTP(各10 mmol/L)、1 μg cDNA、0.25 μL Taq 酶(5 U)及引物各 0.5 μL(10 μmol/L)，其余用滅菌水補足25 μL。PCR反應條件為94 ℃ 20 s,50 ℃ 20 s,72 ℃ 30 s,25個循環(huán)。TERC的引物為：上游引物5'-CTGGGAGGGGTGGTGGCCATTT-3',下游引物5'-CGAACGGGCCAGCAGCTGACAT-3'。內參照GAPDH擴增所用引物：上游引物5'-CGGGAAACTGTGGCGTGAT-3'，下游引物5'-CAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3'。PCR反應條件均為：94 ℃ 預變性3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，25個循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR反應結束后，各取5 μL反應液進行2%瓊脂糖凝膠電泳分析，并用NIH ImageJ 1.38軟件進行灰度分析。

2.4細胞毒性實驗 接種16HBE-1細胞約200個于直徑為60 mm的細胞培養(yǎng)皿中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，分別加入0 mg/L、0.1 mg/L、0.5 mg/L和1 mg/L MNNG應用液。加入后1 h棄去MNNG染毒液，細胞用PBS洗滌3次，加入新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)10 d。顯微鏡下計數大于50個細胞的細胞集落數，然后按下列公式計算絕對集落形成率(absolute colony forming efficiency,A-CFE)和相對集落形成率(relative colony forming efficiency,R-CFE)：

其次是語言的淺易對后世影響極大，語言的通俗易懂為李漁當時打開戲劇正常開辟了捷徑，也對同時代小說創(chuàng)作影響極大。語言用詞淺顯為文化下移提供了可能性，促進了戲劇的興盛，清代各類戲種的興旺發(fā)展與此不無關系。

A-CFE(%)=每孔集落形成數/每孔細胞接種數×100%。R-CFE(%)=實驗組每孔集落數/陰性對照組每孔集落數×100%。

2.5細胞惡性轉化實驗 16HBE-1細胞轉化實驗在24孔板中進行，每孔接種細胞數約105個。至細胞生長至70%～80%融合時，每孔加入0.5 mL 1 mg/L MNNG應用液。1 h后，棄去處理液，細胞用PBS洗滌2次，0.25%胰酶消化后以1∶3傳代。隔代按上述方法處理細胞1次，共27次。每天觀察、記錄細胞形態(tài)變化。

2.6軟瓊脂克隆形成實驗 取對數期轉化細胞，即16HBE-T細胞，胰酶消化后吹散成單個細胞懸液，計數，并調整細胞密度為1×106/L。在24孔板中制備0.5%底層瓊脂，溫室凝固。制備0.3%上層瓊脂，上層瓊脂含約500 cells/well，混勻，置于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 周，定期觀察細胞集落形成情況。

2.7裸鼠成瘤實驗 收集對數生長期對照16HBE和16HBE-T細胞，調整細胞密度均為1×1010/L,裸鼠左、右側頸部皮下分別注入10 μL，共5只。每天觀察裸鼠注射部位成瘤情況。4周后處死裸鼠，分離腫塊并進行常規(guī)病理切片檢查。

3統(tǒng)計學處理

結 果

1穩(wěn)定轉染細胞株的獲得

Figure 1. A screened cell clone(×100).

圖1篩選出的一個細胞克隆

2RT-PCR檢測穩(wěn)定轉染細胞株TERC基因的沉默效率

TERC和內參照GAPDH的擴增產物分別為179 bp和311 bp，見圖2。16HBE和16HBE-C1細胞的TERC mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；16HBE-1與16HBE細胞的TERC mRNA表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01), 16HBE-1細胞的TERC mRNA表達較16HBE細胞下降了64.750%；16HBE-1細胞與16HBE-C1細胞的TERC mRNA表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，16HBE-1細胞的TERC mRNA表達較16HBE-C1細胞下降了66.468%。

圖2TERCmRNA表達分析

3MNNG對16HBE細胞的毒性作用

16HBE細胞的A-CFE和R-CFE隨著MNNG劑量的增加而降低,見表1。選擇 R-CFE在70%～80%范圍之內的1 mg/L作為轉化實驗的劑量。

表1MNNG對16HBE細胞集落形成率的影響

MNNG(mg/L)A-CFE(%)R-CFE(%)070.0±5.0100.00.561.5±4.287.91.052.5±4.075.02.047.3±2.867.6

4“轉化灶”的產生

持續(xù)染毒第27次的16HBE-1細胞失去接觸抑制,堆積

生長,細胞排列紊亂并堆積成島嶼狀,出現了明顯可見的轉化灶，見圖3。

5MNNG處理的細胞在軟瓊脂中生長

細胞在軟瓊脂上錨著非依賴生長能力是體外立體細胞培養(yǎng)條件下衡量細胞惡性程度的重要指標。染毒至第10代和20代各組細胞均不能在軟瓊脂上形成克隆。從“轉化灶”分離培養(yǎng)的16HBE-T細胞獲得了在軟瓊脂上生長的能力，此時形成的細胞克隆呈明顯的立體三維空間生長狀態(tài)，見圖4。

Figure 3. 16HBE-1 cells formed transforming foci after MNNG treatment(×100). Arrow: a transforming focus.

圖316HBE-1細胞經MNNG染毒形成的“轉化灶”

Figure 4. 16HBE-T cells could grow in the soft agar(×100).

圖416HBE-T細胞獲得在軟瓊脂中生長的能力

6裸鼠成瘤實驗

接種裸鼠1周后，其中4只裸鼠在注射16HBE-T細胞的局部開始出現可觸及腫物。接種4周，瘤體逐漸增大生長漸不規(guī)則，凸凹不平，見圖5A。而接種16HBE細胞局部未見皮下結節(jié)的形成。接種4周后處死裸鼠取腫塊，病理切片鏡下所見為低分化鱗狀細胞癌，見圖5B，可見細胞呈巢狀或團狀。細胞大小不一，核大，并可見病理性核分裂像。

Figure 5. Visual inspection (A) and histopathological examination (B,×100) of the tumor in nude mice formed by 16HBE-T cells. Arrow: tumor.

圖516HBE-T細胞在裸鼠體內成瘤的肉眼觀察和組織病理學檢查

討 論

體外培養(yǎng)細胞的人工誘變實驗已經成為研究致癌機制的一種比較理想有效的方法，除用于檢測外來致癌因素外，還能被用來研究感興趣的基因是否參與某一類腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。始于1963年的體外細胞轉化研究經歷了由動物細胞向人類細胞、成纖維細胞向上皮細胞的兩大過渡。人類85%的腫瘤中來源于上皮，因此，直接研究人上皮細胞轉化系統(tǒng)對于研究細胞癌變機制有更重要的意義。本實驗中采用的是經SV40病毒永生化的16HBE細胞株，該細胞株具有較好的遺傳穩(wěn)定性，保留著正常人氣道上皮細胞的特定形態(tài)和功能[10]，體外易于培養(yǎng)，裸鼠體內無致瘤性；同時由于永生化的細胞具備了腫瘤發(fā)生多階段(即啟動-促進-發(fā)展)的啟動階段的某些特點，而且體外培養(yǎng)細胞可人為控制誘變劑的作用時間、方式等，還可以在體外直接觀察細胞的形態(tài)改變。因此用其做靶細胞來研究致癌物的致癌作用更具有實際意義。

正常細胞具有接觸抑制特性，一般情況下，不具增殖能力而處于分化狀態(tài)。當細胞癌變時，則失去接觸抑制性而呈無限性增殖。細胞轉化是一個多因素、多階段、多途徑的過程。無論用化學、物理、病毒或癌基因處理正常人體細胞，一次處理均難以實現惡性轉化[11-12]，均需要多階段多次染毒。本實驗用1 mg/L MNNG隔代染毒第27次后，從轉化灶分離的細胞呈現增殖旺盛，失去接觸抑制，細胞堆積生長，至最后堆積成島嶼狀。我們進一步選用細胞惡性轉化較為可靠的指標——軟瓊脂克隆形成實驗和裸鼠成瘤實驗來鑒定細胞惡性轉化的程度。結果發(fā)現，轉化細胞能夠在軟瓊脂中生長，且能在裸鼠體內成瘤，組織病理學證實為低分化鱗狀細胞癌。以上結果說明，轉化灶分離的細胞已經改變了正常16HBE細胞的生長特性，失去接觸抑制呈無限增殖生長的特性而發(fā)生轉化。

本課題運用RNAi技術沉默16HBE細胞中TERC基因的表達后，隨著MNNG處理次數的增加，16HBE-1細胞逐漸獲得惡性轉化特性，而此時，陰性對照組16HBE細胞并未獲得相似的惡性轉化特性，提示TERC參與調控細胞的惡性轉化。研究表明，在多種腫瘤細胞中均可檢測出TERC基因拷貝數的增高，提示TERC基因拷貝數的增高與細胞獲得生長優(yōu)勢有關[13]。因此，我們推測，TERC表達較低的16HBE-1細胞在MNNG的多次刺激下，TERC通過某些途徑重新表達至一定較高水平，然后激活端粒酶的表達，進而使細胞獲得惡性轉化的特性。因此，這一假設需要我們在后續(xù)實驗中進一步研究驗證。TERC對端粒酶活性維持的必要性以及在腫瘤發(fā)生中的作用使得其成為腫瘤研究領域的一個有效靶點。本研究建立的MNNG誘導的TERC基因缺陷16HBE細胞株惡性轉化細胞模型，為研究TERC的功能和表達調控在人類腫瘤發(fā)生階段的分子機制提供了有用的研究模型。

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AmalignanttransformationmodelofTERC-deficient16HBEcellsinducedbyMNNG

ZHU Jun-feng1, HUANG Xiao-rong2, FENG Yu-peng3, ZHOU Jun-yi1

(1DepartmentofBiochemistry&MolecularBiology,2ExperimentalCenterforBasisMedicalTeaching,ZhongshanSchoolofMedicine,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China;3DepartmentofUrinarySurgery,AffiliatedXixiangPeople’sHospitalofGuangdongMedicalCollege,Shenzhen518102,China.E-mail:zhoujy@mail.sysu.edu.cn)

AIM: To establish a malignant transformed human bronchial epithelial (16HBE) cell model induced byN-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG).METHODSA combination plasmid expressing shRNA specific for the human telomerase RNA component (TERC) was transfected into 16HBE cells and G418-resistant stable clone was obtained, named 16HBE-1 cells. The mRNA expression of TERC in 16HBE-1 cells was detected by RT-PCR. 16HBE-1 cells were treated with MNNG at concentration of 1 mg/L for 1 h in every other generation for 27 times until the transforming foci were formed. The cells from the transforming foci were separated and called 16HBE-T cells. Malignancy of 16HBE-T cells was identified by colony formation in soft agar and tumorigenesis in nude mice.RESULTS16HBE-T cells grew in soft agar and turned into tumor in nude mice. The tumor was squamous carcinoma confirmed by histopathological examination.CONCLUSIONThe malignant transformation ofTERC-deficient 16HBE cells is successfully induced by MNNG.

Telomerase RNA; Human bronchial epithelial cells; RNA interference;N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.07.033