CD137-CD137L相互作用對(duì)ApoE-/-小鼠NFATc1表達(dá)的影響*

嚴(yán)金川， 楊海兵， 蘇紅玲， 袁 偉， 徐良潔

(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科， 江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

1000-4718(2012)07-1181-06

2012-01-27

2012-04-01

江蘇省科教興衛(wèi)工程(No.LJ201116)；鎮(zhèn)江市社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目(No.SH2010012)

△通訊作者 Tel: 0511-85026169; E-mail: yanjinchuan@hotmail.com

CD137-CD137L相互作用對(duì)ApoE-/-小鼠NFATc1表達(dá)的影響*

嚴(yán)金川△， 楊海兵， 蘇紅玲， 袁 偉， 徐良潔

(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科， 江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

目的觀察CD137-CD137配體(CD137L)軸對(duì)載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠活化T細(xì)胞核因子胞漿1型(NFATc1)表達(dá)的影響。方法ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣斑塊模型采用頸動(dòng)脈硅膠圈植入法；分別采用免疫組化及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠頸動(dòng)脈斑塊及淋巴細(xì)胞NFATc1表達(dá)；分別應(yīng)用RT-PCR和流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)體外培養(yǎng)的小鼠淋巴細(xì)胞NFATc1 mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果在體情況下應(yīng)用anti-CD137特異性刺激CD137-CD137L軸后，ApoE-/-小鼠斑塊及脾臟中淋巴細(xì)胞NFATc1表達(dá)增加；體外培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞刺激CD137-CD137L軸后，淋巴細(xì)胞NFATc1 mRNA和蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，anti-CD137刺激濃度以20 mg/L時(shí)作用最強(qiáng)，作用24 h最明顯(P<0.05)。應(yīng)用Anti-CD137L特異性阻斷CD137-CD137L軸能明顯抑制NFATc1 mRNA及蛋白表達(dá)，濃度在20 mg/L時(shí)抑制最強(qiáng)，時(shí)間為24 h后抑制最佳(P<0.05)。結(jié)論ApoE-/-小鼠體內(nèi)NFATc1的表達(dá)受CD137-CD137L軸調(diào)控。

CD137； CD137配體； 活化T細(xì)胞核因子，胞漿1型； 動(dòng)脈粥樣硬化

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是動(dòng)脈血管的慢性非特異性炎癥反應(yīng), AS斑塊的發(fā)展進(jìn)程涉及多種炎癥細(xì)胞、細(xì)胞因子之間的相互作用[1-2]。其中T淋巴細(xì)胞的激活是AS發(fā)生、發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。研究表明，體內(nèi)存在激活T細(xì)胞受體-配體信號(hào)通路多種途徑；CD137分子為腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)受體-配體超家族的新成員，該分子與其配體(CD137L)結(jié)合具有雙向信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，能調(diào)節(jié)多種免疫細(xì)胞的功能，并參與T細(xì)胞的活化、增殖及細(xì)胞外黏附；眾多資料顯示CD137-CD137L相互作用參與AS斑塊的形成和發(fā)展，已經(jīng)證實(shí)人頸動(dòng)脈斑塊中存在CD137高表達(dá)，CD137能加速小鼠AS中炎癥斑塊的進(jìn)展，敲除CD137基因能抑制載脂蛋白E基因敲除(apolipoprotein E-knockout,ApoE-/-)小鼠AS斑塊形成[3-4]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也證實(shí)刺激CD137-CD137L軸能明顯增強(qiáng)ApoE-/-小鼠斑塊形成，阻斷該軸能抑制AS斑塊形成[5]?；罨疶細(xì)胞核因子胞漿1型(nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 1, NFATc1)最初是其在免疫激活中起重要作用而得名，近來(lái)發(fā)現(xiàn)NFATc1參與了AS的發(fā)生。抑制NFATc1活性能抑制平滑肌的增殖從而阻遏粥樣斑塊的形成[6-7]。因此，我們推測(cè)NFATc1可能是CD137-CD137L軸調(diào)控的下游分子。為證實(shí)這一設(shè)想，我們采用ApoE-/-小鼠AS斑塊模型，分別在體內(nèi)、外刺激和阻斷CD137-CD137L軸后，觀察NFATc1表達(dá)是否受該軸的調(diào)控。

材 料 和 方 法

1試劑及動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)用ApoE-/-小鼠，體重約20 g，6周齡，購(gòu)自北京大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。Foxp3 Staining Buffer Set和anti-CD3e、anti-mouse CD137和anti-mouse CD137L抗體購(gòu)自eBioscience。Anti-NFATc1 monoclonal antibody購(gòu)自Santa Cruz，mouse CD4-PE、FITC標(biāo)記Ⅱ抗和同型對(duì)照IgG2b購(gòu)自Multisciences。Trizol mRNA提取液和PCR上、下游引物為上海Sangon生物工程公司產(chǎn)品。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ 試劑盒均購(gòu)自TaKaRa，RPMI-1640為Gibco產(chǎn)品。

2ApoE-/-斑塊模型的制作及檢測(cè)

取6周大小ApoE-/-小鼠(該小鼠具有自發(fā)形成AS傾向)[8]麻醉后，分離頸總動(dòng)脈，應(yīng)用頸動(dòng)脈硅膠圈植入法快速制作斑塊模型[9]。硅膠圈(Dow Corning Corporation)內(nèi)徑為0.3 mm，小鼠頸動(dòng)脈在80 mmHg灌注壓下，頸總動(dòng)脈的外徑平均為0.36 mm，因此使用硅膠圈，可使頸總動(dòng)脈狹窄30%，高脂飲食喂養(yǎng)2周后可形成明顯斑塊。術(shù)后經(jīng)高脂飼料喂養(yǎng)2、4、6周及予以抗體干預(yù)后，分別手術(shù)取下頸動(dòng)脈，行HE常規(guī)染色，觀察頸動(dòng)脈內(nèi)粥樣斑塊的變化。

3體內(nèi)干預(yù)CD137-CD137L軸

3.1實(shí)驗(yàn)分組 小鼠分為3組：(1)對(duì)照組(模型組)；(2)刺激組(每只小鼠腹腔注射anti-CD137 200 μg, 每周1次, 連續(xù)6周)；(3)抑制組(每只小鼠腹腔注射anti-CD137L 200 μg, 每周1次, 連續(xù)6周)。

3.2ApoE-/-小鼠頸動(dòng)脈斑塊中NFATc1表達(dá) 免疫組化檢測(cè)小鼠頸動(dòng)脈斑塊NFATc1表達(dá)；結(jié)果判斷依據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞密度及顯色強(qiáng)度計(jì)算。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野，各計(jì)數(shù)細(xì)胞100個(gè)，計(jì)算NFATc1陽(yáng)性細(xì)胞百分率。陽(yáng)性細(xì)胞少于5%記0分；占5%～25%記1分；占26%～49%記2分；占50%～75%記3分；大于75%記4分。顯色強(qiáng)度記0～3分：細(xì)胞內(nèi)無(wú)著色記0分；細(xì)胞內(nèi)淡黃色記1分；棕黃色記2分；棕褐色記3分；將2項(xiàng)指標(biāo)評(píng)分相加，分4級(jí)，即陰性(-)為0～1分；弱陽(yáng)性(+)為2～3分；中等陽(yáng)性(++)4～5分；強(qiáng)陽(yáng)性(+++)大于5分。陰性無(wú)表達(dá)，弱陽(yáng)性為低表達(dá)，強(qiáng)陽(yáng)性為高表達(dá)。

3.3ApoE-/-小鼠脾臟淋巴細(xì)胞表達(dá)NFATc1 取脾臟制備單個(gè)淋巴細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸于PBS中，加CD4-PE抗體0.25 μL，4 ℃下孵育30 min，PBS洗2次后，加入0.5 mL破膜劑，4 ℃下孵育30 min，破膜緩沖液洗2次，加NFATc1抗體5 μL(其中一管加1 μL IgG2b作同型對(duì)照即陰性對(duì)照)，4 ℃下孵育1.5 h，破膜緩沖液洗2次，加FITC標(biāo)記Ⅱ抗1 μL，4 ℃下孵育1.5 h，洗滌后將細(xì)胞重懸于0.3 mL PBS中，流式細(xì)胞檢測(cè)并分析。

4體外培養(yǎng)的細(xì)胞中干預(yù)CD137-CD137L軸

無(wú)菌取出小鼠脾臟，剪碎后置于有PBS篩網(wǎng)中輕柔研磨，將研磨液于離心管中離心(4 ℃、500×g離心5 min)，棄上清加Ficoll液密度梯度離心法分離淋巴細(xì)胞，用PBS將所得細(xì)胞沉淀洗滌2遍，計(jì)數(shù)后RPMI-1640培養(yǎng)液配置成2×109/L的單個(gè)淋巴細(xì)胞懸液。取細(xì)胞懸液置6孔板(6孔板已用10 mg/L anti-CD3e抗體4 ℃包被過(guò)夜)，設(shè)3組：(1)對(duì)照組(不加抗體組)；(2) anti-CD137 刺激組(10、20、30 mg/L)；(3) anti-CD137L抑制組(10、20、30 mg/L)。在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，分別作用8 h、12 h、24 h、36 h收獲細(xì)胞用于NFATc1 mRNA和蛋白的檢測(cè)。

5RT-PCR檢測(cè)淋巴細(xì)胞NFATc1mRNA及蛋白表達(dá)

按RT-PCR試劑盒提供的方法進(jìn)行，NFATc1 上游引物5’-GTGGCAGCCATCAACGCCCT-3’，下游引物5’-TACGAGGCCTGTGGCACCGA-3’，產(chǎn)物大小為241 bp。β-actin上游引物5’-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3’，下游引物5’-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3’，產(chǎn)物大小為349 bp。RT- PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，NFATc1進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，β-actin進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。結(jié)果采用2-ΔΔCt分析。NFATc1蛋白表達(dá)采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)步驟同上。

6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1ApoE-/-小鼠頸動(dòng)脈斑塊形態(tài)觀察

正常對(duì)照組頸動(dòng)脈內(nèi)膜光滑平整，管壁呈半透明狀；無(wú)脂紋和斑塊形成，彈力板完整。術(shù)后動(dòng)脈粥樣斑塊模型小鼠有明顯斑塊形成，含大量泡沫細(xì)胞，富含脂質(zhì)，可見(jiàn)膽固醇結(jié)晶，彈力板變性、斷裂，而術(shù)后給予anti-CD137刺激劑后斑塊更顯著，術(shù)后給予anti-CD137L抑制劑后斑塊較少，見(jiàn)圖1。

2體內(nèi)干預(yù)CD137-CD137L軸后頸動(dòng)脈斑塊及淋巴細(xì)胞表達(dá)NFATc1變化

體內(nèi)給予anti-CD137刺激CD137-CD137L軸后，免疫組化及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)均顯示ApoE-/-小鼠頸動(dòng)脈斑塊及脾臟淋巴細(xì)胞中NFATc1表達(dá)明顯較對(duì)照組強(qiáng)； 而應(yīng)用anti-CD137L抑制該軸后，ApoE-/-小鼠斑塊及脾臟淋巴細(xì)胞中NFATc1表達(dá)顯著減弱，見(jiàn)圖2、表1和圖3。

Figure 1. Mouse carotid sections (HE staining, ×100). A: normal control;B: 2 weeks after carotid collar placement; C: 4 weeks after carotid collar placement;D: 6 weeks after carotid collar placement; E: after carotid collar placement, 6-week treatment with intraperitoneal injection of anti-CD137L;F: after carotid collar placement, 6-week treatment with intraperitoneal injection of anti-CD137.

圖1小鼠頸動(dòng)脈切片HE染色

Figure 2. The expression of NFATc1 in the carotid atherosclerotic plaques ofApoE-/-mice in each group (immunohistochemical staining, ×100). A: normal control; B: control, 6 weeks after carotid collar placement; C: stimulation, carotid collar placement and 6-week treatment with intraperitoneal injection of anti-CD137; D: inhibition, carotid collar placement and 6-week treatment with intraperitoneal injection of anti-CD137L.

圖2各組ApoE-/-小鼠頸動(dòng)脈斑塊內(nèi)NFATc1表達(dá)強(qiáng)度

表1 各組ApoE-/-小鼠斑塊中NFATc1免疫組化分析結(jié)果

*P<0.05vscontrol.

圖3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞NFATc1表達(dá)

3體外刺激CD137-CD137L軸對(duì)淋巴細(xì)胞NFATc1mRNA及蛋白表達(dá)影響

如圖4所示，與對(duì)照組相比，使用anti-CD137刺激CD137-CD137L軸后，淋巴細(xì)胞NFATc1 mRNA表達(dá)上調(diào)，以20 mg/L刺激最顯著，呈時(shí)間依賴性，24 h作用最明顯。不同濃度anti-CD137作用24 h后，NFATc1 mRNA表達(dá)均明顯上調(diào)，以20 mg/L濃度最佳(P<0.05),見(jiàn)圖4A。以20 mg/L anti-CD137刺激細(xì)胞不同時(shí)間后，NFATc1蛋白表達(dá)在24 h明顯升高，36 h下降，見(jiàn)圖4B、C。

4體外抑制CD137-CD137L軸對(duì)淋巴細(xì)胞NFATc1mRNA及蛋白表達(dá)影響

如圖5所示，與對(duì)照組相比，使用抑制型anti-CD137L抑制CD137-CD137L軸后，NFATc1 mRNA表達(dá)下調(diào)，以20 mg/L最顯著，呈時(shí)間依賴性，在24 h作用最明顯，36 h后作用減弱。不同濃度anti-CD137L作用24 h后，NFATc1 mRNA表達(dá)均明顯下調(diào)，20 mg/L濃度最顯著(P<0.05),見(jiàn)圖5A。以20 mg/L anti-CD137L抑制細(xì)胞不同時(shí)間后，NFATc1蛋白表達(dá)明顯下降，在24 h最顯著,見(jiàn)圖5B、C。

討 論

AS是由多種復(fù)雜因素及免疫系統(tǒng)參與的慢性非特異性炎癥，包括炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和脂質(zhì)沉積，其中炎癥細(xì)胞的相互作用起關(guān)鍵作用，特別是T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答是一系列炎癥反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)[10]，在AS的形成及斑塊進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。T細(xì)胞識(shí)別抗原依賴T細(xì)胞表面的膜蛋白分子及其配體介導(dǎo)的共刺激信號(hào)。近年來(lái)，通過(guò)調(diào)控T細(xì)胞共刺激物，抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，達(dá)到延緩AS發(fā)生、發(fā)展已經(jīng)成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。CD137-CD137L作為激活T細(xì)胞信號(hào)通路的一對(duì)關(guān)鍵共刺激分子，在促進(jìn)T細(xì)胞的增殖和分化、介導(dǎo)T細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞間的黏附、調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞抗原遞呈功能中發(fā)揮重要作用。CD137在人類AS斑塊中高表達(dá)，CD137-CD137L相互作用能加速AS炎癥斑塊的進(jìn)展，在CD137基因表達(dá)缺陷及單抗封閉CD137L的小鼠均可發(fā)現(xiàn)AS斑塊面積明顯減少，眾多研究表明CD137-CD137L軸可能是致AS形成的一個(gè)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，能促進(jìn)AS斑塊的進(jìn)展，影響斑塊的穩(wěn)定性。

圖4刺激CD137-CD137L軸對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞NFATc1mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響

圖5阻斷CD137-CD137L軸對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞NFATc1mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響

NFAT是一類至關(guān)重要的核轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平，參與免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)、T細(xì)胞生長(zhǎng)分化等。NFATc1是NFAT家族重要成員之一，最初是其在免疫激活中起重要作用而得名，在外周淋巴細(xì)胞中編碼相應(yīng)的蛋白合成，在活化的T細(xì)胞和NK細(xì)胞中NFATc1表達(dá)上調(diào)。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)NFATc1參與心血管疾病的發(fā)生，抑制NFATc1活性能抑制平滑肌的增殖從而抑制粥樣斑塊形成。我們體內(nèi)也證實(shí)CD137高表達(dá)與冠脈斑塊不穩(wěn)定相關(guān)[11-12]，因此，我們推測(cè)NFATc1是受CD137-CD137L調(diào)控動(dòng)脈粥樣斑塊進(jìn)展的下游分子。

本實(shí)驗(yàn)中，我們從體內(nèi)、體外兩方面分別刺激和抑制CD137-CD137L軸，觀察小鼠NFATc1表達(dá)的變化。體外采用ApoE-/-鼠頸動(dòng)脈硅膠圈植入法快速制作AS斑塊模型，明確AS斑塊形成的前提下，取未經(jīng)治療的ApoE-/-小鼠脾臟淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)，應(yīng)用刺激型anti-CD137和抑制型anti-CD137L分別干預(yù)CD137-CD137L軸；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示ApoE-/-小鼠腹腔注射刺激型anti-CD137后，斑塊及脾臟淋巴細(xì)胞中NFATc1表達(dá)明顯增強(qiáng)，而抑制型anti-CD137L干預(yù)后；斑塊及淋巴細(xì)胞中NFATc1表達(dá)受到抑制。體外培養(yǎng)ApoE-/-小鼠淋巴細(xì)胞后，應(yīng)用激發(fā)型CD137單抗刺激CD137-CD137L軸，進(jìn)而在體外可進(jìn)一步擴(kuò)增活化的T細(xì)胞，使胞漿Ca2+濃度升高，啟動(dòng)促分裂素原活化蛋白激酶(MAP激酶)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使NFATc1在核內(nèi)表達(dá)增加。CD137L單抗與抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell, APC)或B細(xì)胞上的CD137L有較強(qiáng)的結(jié)合能力，能有效封閉CD137與CD137L的相互作用，阻斷共刺激信號(hào)傳遞，NFATc1表達(dá)下降。上述結(jié)果提示，體內(nèi)、外刺激和阻斷CD137-CD137L軸可在轉(zhuǎn)錄及蛋白翻譯水平調(diào)控ApoE-/-小鼠NFATc1表達(dá)。而體外實(shí)驗(yàn)所用的淋巴細(xì)胞采自未經(jīng)治療的ApoE-/-動(dòng)脈粥樣斑塊模型小鼠，使得實(shí)驗(yàn)得以在動(dòng)脈粥樣硬化疾病的背景下進(jìn)行，也就進(jìn)一步證實(shí)NFATc1是受CD137-CD137L調(diào)控動(dòng)脈粥樣斑塊進(jìn)展的下游分子。盡管體內(nèi)注射CD137抗體可能會(huì)引起小鼠免疫系統(tǒng)功能紊亂，但這一動(dòng)物模型及實(shí)驗(yàn)方法對(duì)了解CD137-CD137L在AS的作用和相關(guān)機(jī)制提供了很多幫助。

AS的發(fā)生受局部炎癥刺激及全身炎癥反應(yīng)的影響，目前大多數(shù)實(shí)驗(yàn)是從局部炎癥刺激角度探討AS的源頭機(jī)制，本研究在明確CD137-CD137L參與AS斑塊進(jìn)展的前提下，從全身炎癥反應(yīng)的角度出發(fā)，證實(shí)NFATc1是CD137-CD137L信號(hào)活化的下游分子。該結(jié)果為我們?cè)O(shè)想能夠?qū)S炎癥反應(yīng)抑制在信號(hào)活化階段，高效預(yù)防AS的發(fā)生與發(fā)展，并為阻斷CD137-CD137L通路防治冠心病提供新的源頭防治靶點(diǎn)。

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EffectofCD137-CD137ligandinteractiononexpressionofNFATc1inapolipoproteinE-deficientmice

YAN Jin-chuan, YANG Hai-bing, SU Hong-ling, YUAN Wei, XU Liang-jie

(DepartmentofCardiology,AffiliatedHospitalofJiangsuUniversity,Zhenjiang212001,China.E-mail:yanjinchuan@hotmail.com)

AIM: To observe the effects of CD137-CD137 ligand(CD137L) interaction on the nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 1 (NFATc1) in apolipoprotein E-knockout (ApoE-/-) mice.METHODSAtherosclerotic plaque model was produced by perivascular carotid collar placement inApoE-/-mice.Invivo, the expression levels of NFATc1 in mouse plaques and lymphocytes were detected by immunohistochemical method and flow cytometry, respectively.Invitro, the expression of NFATc1 at mRNA and protein levels in cultured lymphocytes ofApoE-/-mice was measured by RT-PCR and flow cytometry, respectively.RESULTSInvivo, after CD137-CD137L signaling pathway was stimulated, the expression of NFATc1 was significantly increased in the atherosclerotic plaques and lymphocytes.Invitro, the expression of NFATc1 at mRNA and protein levels in cultured leukocytes ofApoE-/-mice was also significantly increased, with the maximal effect exerted by anti-CD137 monoclonal antibody (mAb) at the concentration of 20 mg/L, and 24 h after stimulation at any concentration (P<0.05). Anti-CD137L mAb significantly inhibited the expression of NFATc1 at mRNA and protein levels in the lymphocytes ofApoE-/-mice, with the maximal effect exerted by anti-CD137L mAb at the concentration of 20 mg/L, and 24 h after stimulation (P<0.05).CONCLUSIONCD137-CD137L interaction can regulate the expression of NFATc1 inApoE-/-mice.

CD137; CD137 ligand; Nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 1; Atherosclerosis

R392.12

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.07.006