雌激素通過KATP通道影響大鼠腸系膜動(dòng)脈的反應(yīng)性*

張登文, 徐 林, 張傳漢, 韓愛迪, 姚文龍, 王學(xué)仁

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院麻醉學(xué)教研室，湖北 武漢 430030 )

1000-4718(2012)07-1176-05

2012-01-07

2012-03-16

教育部博士點(diǎn)基金新教師資助項(xiàng)目(No.20070487131)；湖北省衛(wèi)生廳青年科技人才基金資助項(xiàng)目(No.QJX2008-1)

△通訊作者 Tel:027-83663173;E-mail: xrwang@mail.hust.edu.cn

▲并列第1作者

雌激素通過KATP通道影響大鼠腸系膜動(dòng)脈的反應(yīng)性*

張登文▲, 徐 林▲, 張傳漢, 韓愛迪, 姚文龍, 王學(xué)仁△

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院麻醉學(xué)教研室，湖北 武漢 430030 )

目的觀察雌激素對(duì)大鼠腸系膜動(dòng)脈平滑肌ATP敏感性鉀離子通道 (KATP通道)mRNA表達(dá)的影響，探討KATP通道在雌激素調(diào)節(jié)大鼠腸系膜血管反應(yīng)性中的作用。方法雌性SD大鼠48只，體重(100±10) g，隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham)、卵巢切除組(Ovx)和卵巢切除后補(bǔ)充雌激素組(Ovx +E)。采取實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)大鼠腸系膜動(dòng)脈中KATP通道m(xù)RNA的表達(dá)；觀察各組大鼠腸系膜動(dòng)脈對(duì)去甲腎上腺素(NE)升壓效應(yīng)的反應(yīng)性。結(jié)果與sham組相比，Ovx組大鼠腸系膜動(dòng)脈KATP通道的Kir6.1及SUR2B亞單位mRNA表達(dá)減少(P<0.05)，而Ovx+E組則表達(dá)增加(P<0.05)。與sham組相比，Ovx組大鼠的血管反應(yīng)性明顯增加(P<0.05)，Ovx+E組無明顯差異。給予KATP通道阻滯劑格列本脲后，sham組和Ovx+E組的動(dòng)脈反應(yīng)性增加(P<0.05)，Ovx組無明顯變化(P>0.05)，此時(shí)3組間比較無明顯差異(P>0.05)。結(jié)論雌激素可能通過上調(diào)腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞KATP通道的表達(dá)來降低動(dòng)脈對(duì)去甲腎上腺素升壓效應(yīng)的反應(yīng)性。

雌激素； ATP敏感性鉀離子通道； 血管反應(yīng)性； 去甲腎上腺素

流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)前女性的冠心病及卒中發(fā)生率比同齡男性低，到絕經(jīng)后其發(fā)病率迅速增高[1]。而冠心病及卒中主要是由高血壓和動(dòng)脈硬化等導(dǎo)致血管功能受損的一類疾病所引起，這種血管功能損害主要表現(xiàn)為血管收縮功能增強(qiáng)、舒張功能減弱。既往研究表明，絕經(jīng)后雌激素的缺乏導(dǎo)致血管功能發(fā)生了這一系列的變化。

ATP敏感性鉀離子通道(ATP-sensitive K+channels, KATP通道)是一種內(nèi)向整流性鉀通道，廣泛分布于心肌細(xì)胞、胰島β細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、血管與非血管平滑肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等多種細(xì)胞中。血管平滑肌中KATP通道開放可以引起血管舒張，它廣泛參與了多種血管活性藥物對(duì)血管功能的調(diào)節(jié)以及休克時(shí)血管功能變化[2]。然而雌激素對(duì)血管功能的影響是否有KATP通道參與目前尚不清楚。 因此，本研究采用卵巢去勢(shì)及雌激素干預(yù)模型，real-time RT-PCR技術(shù)檢測(cè)大鼠腸系膜動(dòng)脈平滑肌中KATP通道表達(dá)的變化，觀察KATP通道阻滯劑對(duì)大鼠去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)升壓效應(yīng)的影響。

材 料 和 方 法

1動(dòng)物

雌性SD大鼠48只，體重(100±10) g，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供，隨機(jī)分為3組，假手術(shù)組(sham)、卵巢切除組(ovariectomy，Ovx)和卵巢切除后補(bǔ)充雌激素組(ovariectomy+estrogen， Ovx+E)。

2試劑及儀器

Trizol試劑(TaKaRa),實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa),StepOne Real-time PCR儀(ABI)，紫外分光光度計(jì)(Eppendorf)，Biometra 96 PCR儀(Biometra)，17β-雌二醇(Sigma)，格列本脲(Sigma)，iWorx 214電生理記錄儀(iWorx)，重酒石酸去甲腎上腺素(武漢遠(yuǎn)大制藥公司)，麻油(Sigma)。

3方法

3.1動(dòng)物模型的建立 10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉后，取側(cè)臥位固定，以最后肋骨稍后方為中心備皮、消毒。自腰椎沿背部正中線向下做縱行切口約1～2 cm，切開皮膚，離脊柱約1 cm并沿肩胛線分別于左右兩肋下剪開腰肌，切口長約1 cm，立即見位于兩側(cè)腎臟外下方呈淡粉紅色的卵巢及緊密相連的子宮角，輕輕夾住脂肪組織將其拉出體外。在子宮角上部及下部的輸卵管部位做2個(gè)結(jié)扎，結(jié)扎后剪斷子宮角，將卵巢摘除。把脂肪組織推回腹腔內(nèi)，將腹膜與肌層一起縫1針，檢查有無出血，縫合皮膚。術(shù)后常規(guī)腹腔注射抗生素3 d，并連續(xù)陰道涂片，Ovx組及Ovx+E組陰道上皮無動(dòng)情周期變化提示去勢(shì)完全。

3.2藥物干預(yù) 于去勢(shì)后第4周Ovx+E組每天皮下注射100 μL溶有17β-雌二醇(10 μg/kg)的麻油，Ovx組及sham組每天皮下注射等體積麻油，連續(xù)給藥2周后，每組各取4只大鼠，10%水合氯醛麻醉后處死，提取腸系膜動(dòng)脈組織。

3.3子宮指數(shù)的測(cè)定及HE染色 所有大鼠處死前稱取體重，處死后剪取子宮，電子分析天平稱取子宮濕重，計(jì)算子宮指數(shù)(子宮濕重/大鼠體重)。然后進(jìn)行冰凍切片，行HE染色。

3.4Real-time RT-PCR 檢測(cè)KATP通道m(xù)RNA的表達(dá) 用Trizol試劑盒提取各組大鼠腸系膜動(dòng)脈RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的純度和濃度，按實(shí)時(shí)定量RT-PCR試劑盒說明書將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后在ABI StepOne Real-time PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR引物序列見表1，其反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，40個(gè)循環(huán)。分析熔解曲線，根據(jù)熔解曲線判斷是否存在非特異性擴(kuò)增。以2-ΔΔCt的方法分析 mRNA的相對(duì)表達(dá)變化，ΔΔCt=[Ct(目的基因)-Ct(內(nèi)參照基因)]處理組-[Ct(目的基因)-Ct(內(nèi)參照基因)]對(duì)照組[3-4]。

表1 Real time PCR引物序列

3.5血管反應(yīng)性 通過給予NE后平均動(dòng)脈壓(mean arterial pressure，MAP)的變化觀察動(dòng)脈血管的反應(yīng)性[5]。大鼠吸入異氟烷麻醉后，通過頸總動(dòng)脈插管連接壓力換能器監(jiān)測(cè)動(dòng)脈血壓，通過頸靜脈插管開放靜脈通道。手術(shù)完成后，平衡血壓30 min，通過靜脈插管推注NE 3 μg/kg，記錄注射NE 前后大鼠MAP值，NE作用后MAP變化值反映整體血管反應(yīng)性。格列本脲溶于0.01 mol/L NaOH溶液中，靜脈插管緩慢注射4 g/L格列本脲(1 mg/kg)，5 min后重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，給予3 μg/kg NE[6]。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1子宮HE染色

Sham組和Ovx+E組大鼠的子宮外觀質(zhì)地飽滿、色澤粉紅，而Ovx組大鼠子宮質(zhì)地細(xì)薄、色澤較白。與sham組相比較，Ovx+E組大鼠子宮指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而Ovx組大鼠子宮指數(shù)顯著降低(P<0.05)，見表2。HE染色可以看出Ovx組大鼠子宮肌層及內(nèi)膜萎縮，體積明顯減小，腺體減少散在、腔隙變窄，sham組及Ovx+E組子宮內(nèi)膜及肌層明顯增厚，腺體數(shù)量增加、腔隙增大，見圖1。

2腸系膜動(dòng)脈中KATP通道m(xù)RNA的表達(dá)

與sham組相比，Ovx 組大鼠腸系膜動(dòng)脈KATP通道的Kir6.1亞單位mRNA表達(dá)減少(P<0.05)，而Ovx+E組SUR2B亞單位mRNA表達(dá)增加(P<0.05)。與Ovx組比較，Ovx+E組Kir6.1和SUR2B亞單位mRNA表達(dá)增加(P<0.05)，見圖2。

表23組子宮指數(shù)的比較

GroupUterineindexSham1.947±0.270Ovx0.285±0.040*Ovx+E1.684±0.600#

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsOvx group.

Figure 1. Histological changes of the rat uteri in different groups (HE staining). A，B，C:×40；D，E，F(xiàn):×100.

圖1各組大鼠子宮的組織學(xué)變化

圖2大鼠腸系膜動(dòng)脈KATP通道亞單位Kir6.1和SUR2BmRNA的表達(dá)

3血管反應(yīng)性

與sham組相比，Ovx組大鼠在NE作用下的MAP增幅明顯升高(P<0.05)，而Ovx+E組無明顯變化。與Ovx組相比，Ovx+E組NE引起的MAP增幅顯著降低(P<0.05)。給予KATP通道阻滯劑格列本脲后，sham組和Ovx+E組對(duì)NE的反應(yīng)性增加(P<0.05)，此時(shí)3組之間NE引起的MAP增幅無明顯差別(P>0.05)，見圖3。

圖3NE誘導(dǎo)的升壓反應(yīng)

討 論

本研究結(jié)果顯示，雌激素可以增加腸系膜動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞KATP通道m(xù)RNA的表達(dá)；卵巢去勢(shì)后大鼠對(duì)NE的升壓作用反應(yīng)性增加，補(bǔ)充雌激素后則可以抑制此作用。

本實(shí)驗(yàn)首先通過陰道涂片觀察大鼠的動(dòng)情周期，判斷卵巢去勢(shì)模型的建立是否成功。在確定卵巢去勢(shì)成功后，再分別補(bǔ)充雌激素。補(bǔ)充雌激素后的大鼠子宮指數(shù)與假手術(shù)組相比無明顯差異，但比去勢(shì)組明顯升高，同時(shí)HE染色可以看到Ovx組大鼠子宮肌層及內(nèi)膜萎縮，體積明顯減小，腺體減少散在、腔隙變窄，sham組及Ovx+E組子宮內(nèi)膜及肌層明顯增厚，腺體數(shù)量增加、腔隙增大，這說明卵巢去勢(shì)模型建立成功及雌激素干預(yù)有效。

如前所述，冠心病及卒中主要是由高血壓和動(dòng)脈硬化等可以導(dǎo)致血管功能受損的一類疾病所引起，而這種血管功能損害主要表現(xiàn)為血管收縮功能增強(qiáng)、舒張功能減弱。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇靜脈注射NE引起的升壓效應(yīng)來反映動(dòng)脈血管的收縮功能。結(jié)果顯示，卵巢去勢(shì)后大鼠對(duì)NE升壓效應(yīng)的反應(yīng)性明顯增加，血管反應(yīng)性增加；而卵巢去勢(shì)后又重新補(bǔ)充雌激素，大鼠血管反應(yīng)性與假手術(shù)組大鼠相比則沒有明顯差異。由此可以說明，卵巢去勢(shì)后導(dǎo)致雌激素缺乏，使得血管收縮功能增強(qiáng)，反應(yīng)性增高，補(bǔ)充雌激素可以降低血管對(duì)NE的反應(yīng)性。流行病學(xué)研究顯示，絕經(jīng)后的女性高血壓的發(fā)病率明顯高于絕經(jīng)前女性。其它研究也提示，雌激素可以通過調(diào)控血管活性物質(zhì)如前列環(huán)素、一氧化氮、血漿內(nèi)皮素的生成與分泌，抑制血管的收縮，從而使血管擴(kuò)張[7-8]。

KATP通道是一種內(nèi)向整流性鉀通道，其開放主要受細(xì)胞內(nèi)ATP水平的調(diào)控，在ATP濃度降低或缺氧時(shí)其開放率明顯增加，從而將各種興奮性組織中細(xì)胞的電活動(dòng)與胞質(zhì)的代謝狀態(tài)相偶聯(lián)[9]。KATP通道在廣泛分布與心肌細(xì)胞、胰島β細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、血管與非血管平滑肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等多種細(xì)胞中。血管平滑肌細(xì)胞KATP通道由Kir6.1和SUR2B亞單位構(gòu)成，此通道開放，K+外流增加，細(xì)胞超級(jí)化，接著引起電壓門控Ca2+通道關(guān)閉增加并降低Ca2+內(nèi)流，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的降低引起血管平滑肌細(xì)胞收縮功能的降低和反應(yīng)性降低[10]?？梢奒ATP通道對(duì)動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的膜電位和動(dòng)脈血管張力起重要的調(diào)節(jié)作用[2, 11]。它廣泛參與了多種血管活性藥物對(duì)血管功能的調(diào)節(jié)如腺苷、β受體激動(dòng)劑，以及休克時(shí)血管功能變化[12]。在內(nèi)毒素性休克時(shí)，血管反應(yīng)性明顯降低，而在給予一定量的KATP通道的阻滯劑格列本脲后，可以增強(qiáng)血管對(duì)NE的反應(yīng)性。Shi等[13]的研究發(fā)現(xiàn)脂多糖可以增加血管平滑肌KATP通道的表達(dá)，這進(jìn)一步說明了KATP通道對(duì)血管反應(yīng)性起著重要的作用。我們推測(cè)KATP通道可能參與了雌激素降低血管對(duì)NE反應(yīng)性的過程。

本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)雌激素是否影響了腸系膜動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞KATP通道表達(dá)。腸系膜動(dòng)脈床面積大，在維持外周阻力中具有重要作用，因此本實(shí)驗(yàn)取材于腸系膜動(dòng)脈。而實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示卵巢去勢(shì)組大鼠腸系膜動(dòng)脈組織中KATP通道各亞單位mRNA表達(dá)較假手術(shù)組明顯降低，而補(bǔ)充雌激素后KATP通道表達(dá)又明顯升高。這說明雌激素可以上調(diào)腸系膜血管平滑肌KATP通道的表達(dá)。其它研究也發(fā)現(xiàn)類似雌激素上調(diào)KATP通道的現(xiàn)象：Huang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，雌激素作用于下丘腦POA區(qū)通過上調(diào)KATP通道來發(fā)揮對(duì)GnRH釋放峰的負(fù)反饋?zhàn)饔?。Ranki等[15]研究結(jié)果顯示，雌激素可以上調(diào)心臟組織KATP通道表達(dá)，從而增加心肌細(xì)胞對(duì)代謝應(yīng)激的耐受力。Park等[16]發(fā)現(xiàn)暴露在雌激素下的子宮平滑肌KATP通道的表達(dá)增加，可能導(dǎo)致子宮平滑肌瘤細(xì)胞的增殖。同時(shí)，我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給予KATP通道阻滯劑格列本脲后，NE引起的升壓作用在sham組、Ovx組及Ovx+E組之間無明顯差別。這進(jìn)一步證實(shí)了KATP通道可能參與雌激素減低血管對(duì)NE的反應(yīng)性。

總之，本研究表明雌激素可能通過上調(diào)腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞KATP通道的表達(dá)來降低血管對(duì)縮血管物質(zhì)刺激的反應(yīng)性。這可能是雌激素對(duì)心血管保護(hù)作用的另一種潛在機(jī)制，也可能是絕經(jīng)后女性冠心病及卒中發(fā)生率發(fā)病率迅速增高的原因之一。

[1] Appelros P, Stegmayr B, Terent A. Sex differences in stroke epidemiology: a systematic review [J]. Stroke, 2009, 40(4): 1082-1090.

[2] Wang X, Wu J, Li L, et al. Hypercapnic acidosis activates KATPchannels in vascular smooth muscles [J]. Circ Res, 2003, 92(11): 1225-1232.

[3] Schmittgen TD, Livak KJ. Analyzing real-time PCR data by the comparative CTmethod [J]. Nat Protoc, 2008, 3(6): 1101-1108.

[4] Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTmethod [J]. Methods, 2001, 25(4): 402-408.

[5] 李 濤，徐 競(jìng)，劉良明，等. 缺血預(yù)處理對(duì)失血性休克大鼠血管反應(yīng)性及鈣敏感性的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2011, 27(03): 437-442.

[6] Nakagawa M, Hori S, Adachi T, et al. Adenosine triphosphate-sensitive potassium channels prevent extension of myocardial ischemia to subepicardium during hemorrhagic shock[J]. Shock, 2008, 30(2): 178-183.

[7] Ross RL, Serock MR, Khalil RA. Experimental benefits of sex hormones on vascular function and the outcome of hormone therapy in cardiovascular disease[J]. Curr Cardiol Rev, 2008, 4(4): 309-322.

[8] Pojoga LH, Yao TM, Sinha S, et al. Effect of dietary sodium on vasoconstriction and eNOS-mediated vascular relaxation in caveolin-1-deficient mice[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2008, 294(3): H1258-H1265.

[9] Nichols CG. KATPchannels as molecular sensors of cellular metabolism [J]. Nature, 2006, 440(7083): 470-476.

[10]Buckley JF, Singer M, Clapp LH. Role of KATPchannels in sepsis [J]. Cardiovasc Res, 2006, 72(2): 220-230.

[11]Brayden JE. Functional roles of KATPchannels in vascular smooth muscle [J]. Clin Exp Pharmacol Physiol, 2002, 29(4): 312-316.

[12]Collin S, Sennoun N, Dron A G, et al. Vascular ATP-sensitive potassium channels are over-expressed and partially regulated by nitric oxide in experimental septic shock[J]. Intensive Care Med, 2011, 37(5): 861-869.

[13]Shi W, Cui N, Wu Z, et al. Lipopolysaccharides up-regulate Kir6.1/SUR2B channel expression and enhance vascular KATPchannel activity via NF-κB-dependent signaling[J]. J Biol Chem, 2010, 285(5): 3021-3029.

[14]Huang W, Acosta-Martinez M, Levine JE. Ovarian steroids stimulate adenosine triphosphate-sensitive potassium KATPchannel subunit gene expression and confer responsiveness of the gonadotropin-releasing hormone pulse generator to KATPchannel modulation[J]. Endocrinology, 2008, 149(5): 2423-2432.

[15]Ranki HJ, Budas GR, Crawford RM, et al. 17β-estradiol regulates expression of KATPchannels in heart-derived H9c2 cells[J]. J Am Coll Cardiol, 2002, 40(2): 367-374.

[16]Park SH, Ramachandran S, Kwon SH, et al. Upregulation of ATP-sensitive potassium channels for estrogen-mediated cell proliferation in human uterine leiomyoma cells[J]. Gynecol Endocrinol, 2008, 24(5): 250-256.

EstrogenaffectsreactivityofratmesentericarterythroughATP-sensitivepotassiumchannel

ZHANG Deng-wen, XU Lin, ZHANG Chuan-han, HAN Ai-di, YAO Wen-long, WANG Xue-ren

(DepartmentofAnesthesiology,TongjiHospitalAffiliatedtoTongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China.E-mail:xrwang@mail.hust.edu.cn)

AIM: To observe the expression of ATP-sensitive potassium (KATP) channel mRNA in mesenteric artery smooth muscle of rats with estrogen administration, and to evaluate the role of KATPchannel in the effects of estrogen on the reactivity of mesenteric artery in rats.METHODSForty-eight female Sprague-Dawley rats, weighing (100±10) g, were randomly divided into 3 groups: sham operation (sham) group, ovariectomy (Ovx) group and ovariectomy with estrogen administration (Ovx+E) group. The mRNA expression of KATPsubunits in mesenteric artery smooth muscle was detected by quantitative real-time PCR. Artery reactivity in the rats was observed by norepinephrine-induced pressor response.RESULTSCompared with sham group, the mRNA expression of Kir6.1 and SUR2B was significantly decreased in Ovx group (P<0.05), but increased in Ovx+E group (P<0.05). Compared with sham group and Ovx+E group, the pressor response induced by norepinephrine in the rats were enhanced in Ovx group (P<0.05). No significant difference between sham group and Ovx+E group was observed. After administered with glibenclamide (a KATPchannel blocker), the pressor response induced by norepinephrine was enhanced in sham group and Ovx +E group, and no changes in Ovx group. Meanwhile, no difference among the 3 groups was found.CONCLUSIONEstrogen up-regulates the expression of KATPchannel subunits, which may be involved in estrogen-reduced pressor response to norepinephrine.

Estrogen; ATP-sensitive potassium channels; Vascular reactivity; Norepinephrine

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.07.005