不同廠家復(fù)方丹參片的有效成分含量考察

楊春智，徐玉紅，李玉珍，姚苑梅，黃瑞英

(廣東醫(yī)學(xué)院附屬福田醫(yī)院，廣東 深圳 518033)

復(fù)方丹參片由丹參、三七和冰片組方，具有活血化瘀、理氣止痛功效，用于心血管疾病可顯著擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，增加血流量，減少心肌耗氧量，改善血液流變性[1]。丹參為方中君藥，活性成分主要分為脂溶性和水溶性成分兩大類(lèi)，脂溶性成分主要為丹參酮ⅡA、隱丹參酮等，具有抗心肌缺血、抗菌、抗雄性激素作用;水溶性成分主要為丹酚酸類(lèi)，如丹酚酸B，具有抗心肌缺血和增加冠狀動(dòng)脈血流量等生物活性[2]。自1985年版《中國(guó)藥典》收錄復(fù)方丹參片后，其質(zhì)量控制方法不斷改進(jìn)[3]。但2010年版《中國(guó)藥典(一部)》對(duì)復(fù)方丹參片中兩類(lèi)活性成分的代表成分丹參酮ⅡA和丹酚酸B的含量只規(guī)定了下限，未對(duì)其上限進(jìn)行限定[1]。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，不同廠家生產(chǎn)的市售復(fù)方丹參片中丹參酮ⅡA和丹酚酸B的含量雖均符合中國(guó)藥典要求，但不同批次的復(fù)方丹參片活性成分含量存在較大差異[4-5]。本研究中，對(duì)幾家醫(yī)院使用的不同廠家生產(chǎn)的復(fù)方丹參片活性成分含量進(jìn)行了連續(xù)跟蹤測(cè)定，并就有效成分含量的廠間一致性與批間穩(wěn)定性進(jìn)行了質(zhì)量分析，希望能為醫(yī)院藥品招標(biāo)選擇提供依據(jù)。

1 儀器和試藥

Agilent 1100型高效液相色譜儀，包括G1311A四元泵，G1322A真空脫氣機(jī)，G1315B-DAD檢測(cè)器，D1316A柱溫箱，rheodyne-7725i手動(dòng)進(jìn)樣器，ChemStation工作站;UV-2201型紫外分光光度計(jì)(日本島津);pHS-3C型精密pH計(jì)(上海精科雷磁儀器廠);AG285型電子天平(梅特勒托利多儀器有限公司);數(shù)顯示隔水式電熱培養(yǎng)箱(上海浦東躍欣科學(xué)儀器廠)。丹參酮ⅡA對(duì)照品(批號(hào)為 1107662200417)，丹酚酸 B對(duì)照品(批號(hào)為1115622200605，含量98.15%)，均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所;復(fù)方丹參片(市售品，來(lái)源于不同醫(yī)院臨床采購(gòu)的A，B，C 3個(gè)生產(chǎn)廠家，每個(gè)廠家6個(gè)批次);甲醇(色譜純，天津市西華特種市劑廠)，乙腈(色譜純，天津四友)，純化水，其他試劑為分析純。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件[6]與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

丹酚酸 B:色譜柱為 eclipseXDBC18柱(150mm×4.6mm，5μm)，流動(dòng)相為甲醇-0.2%磷酸水溶液(40∶60)，流速1.0 mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，理論塔板數(shù)按丹酚酸B色譜峰計(jì)大于3 000。丹參酮ⅡA:流動(dòng)相為甲醇-水(85∶15)，檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm，其他條件與丹酚酸B相同，理論塔板數(shù)按丹參酮ⅡA色譜峰計(jì)大于3 000。按上述色譜條件，丹酸酮ⅡA和丹酚酸B的保留時(shí)間分別約為6.0 min和5.2 min，色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 溶液制備

精密稱(chēng)取丹參酮ⅡA和丹酚酸B對(duì)照品各10.0 mg，分別置10 mL棕色量瓶中，加甲醇定容，搖勻分別作為丹參酮ⅡA和丹酚酸B的對(duì)照品貯備液;精密量取丹參酮ⅡA對(duì)照品貯備液1 mL，置10 mL棕色量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制得質(zhì)量濃度為100.0μg/mL的丹參酮ⅡA對(duì)照品溶液;精密量取丹酚酸B對(duì)照品貯備液2 mL，加水制成質(zhì)量濃度為200.0μg/mL的丹酚酸B對(duì)照品溶液。取同一批次復(fù)方丹參片10片，精密稱(chēng)定(糖衣片先除去糖衣)，研細(xì)，取約2.0 g，精密稱(chēng)定，置具塞棕色量瓶中，每次加甲醇50 mL，超聲波(功率 100 W，頻率 40 kHz)提取 15 min，共 3次;過(guò)濾，合并提取液，水浴濃縮近干，加入少量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移到50 mL量瓶中，用甲醇定容，作為供試品溶液。測(cè)定丹參酮ⅡA時(shí)，用微孔濾膜過(guò)濾后直接進(jìn)樣;測(cè)定丹酚酸B時(shí)，將濾液稀釋10倍后進(jìn)樣。

2.3 方法學(xué)考察

圖1 高效液相色譜圖

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制:分別精密量取丹參酮ⅡA和丹酚酸B對(duì)照品溶液 0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0 mL，置 10 mL 量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，依次分別吸取各質(zhì)量濃度丹參酮ⅡA和丹酚酸B對(duì)照品溶液20μL，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)、相應(yīng)的峰面積(A)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程A=1 169.82C+20.15，r=0.9999(丹參酮ⅡA)和 A=876.13C+61.20，r=0.999 8(丹酸酚 B)。結(jié)果表明，丹參酮ⅡA與丹酚酸B質(zhì)量濃度分別在5.0～80.0μg/mL和10.0～160.0μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

精密度試驗(yàn):分別配制低、中、高質(zhì)量濃度的丹參酮ⅡA和丹酚酸B對(duì)照品溶液，依上述色譜條件每個(gè)濃度分別進(jìn)樣5次，記錄丹酸酮ⅡA和丹酚酸B的峰面積。結(jié)果丹參酮ⅡA和丹酚酸B峰面積的 RSD均小于2%。

重復(fù)性試驗(yàn):取同廠家同批號(hào)的復(fù)方丹參片，依法平行制備5份供試品溶液，按擬訂的色譜條件測(cè)定含量。結(jié)果丹參酮ⅡA和丹酚酸B含量的 RSD分別為2.1%和1.8%。

加樣回收試驗(yàn):取已知丹參酮ⅡA、丹酚酸B含量的樣品適量(約1 g)，精密稱(chēng)定，分別精密加入低、中、高不同量的丹參酮ⅡA和丹酚酸B對(duì)照品后，按供試品溶液處理方法制得供試液并按上述色譜條件分別測(cè)定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 丹參酮ⅡA和丹酚酸B加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

穩(wěn)定性試驗(yàn):分別取質(zhì)量濃度為40μg/mL的丹參酮ⅡA和丹酚酸B對(duì)照品溶液，每隔一定時(shí)間測(cè)定1次。結(jié)果表明，對(duì)照品溶液至少在48 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.4 樣品含量測(cè)定

取不同醫(yī)院臨床使用的來(lái)自3個(gè)生產(chǎn)廠家的樣品各6個(gè)批次，每批次平行測(cè)定3份，取其平均值作為該批次樣品含量。每份約稱(chēng)取2.0 g，精密稱(chēng)定后按2.2項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按擬訂的色譜條件測(cè)定，計(jì)算丹參酮ⅡA和丹酚酸B的含量及含量變異系數(shù)(RSD)。3個(gè)廠家18批次樣品中丹參酮ⅡA、丹酚酸B含量總體變異系數(shù)分別為19.5%和19.4%。對(duì)各廠家6批次樣品測(cè)定結(jié)果進(jìn)行 t檢驗(yàn)，除B廠和C廠在丹參酮ⅡA含量上存在明顯差異(P＜0.05)外，各廠樣品之間在丹參酮ⅡA和丹酚酸B含量上無(wú)明顯不同(P＞0.05)。相同廠家不同批次樣品中丹參酮ⅡA、丹酚酸B含量變異系數(shù)分別為11.9% ～22.9%和13.8% ～26.5%。詳見(jiàn)表2。

表2 3個(gè)廠家不同批次樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

復(fù)方丹參片作為傳統(tǒng)中藥制劑，對(duì)治療心腦血管疾病具有良好療效，臨床應(yīng)用廣泛，但研究表明，不同廠家生產(chǎn)的復(fù)方丹參片制劑質(zhì)量參差不齊，特別是藥典標(biāo)準(zhǔn)未有收載的復(fù)方丹參片制劑質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果不容樂(lè)觀[7-10]。從2005年版《中國(guó)藥典(一部)》開(kāi)始，丹參藥材中脂溶性代表成分丹參酮ⅡA、水溶性代表成分丹酚酸B均作為含量監(jiān)控指標(biāo)納入復(fù)方丹參片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，但均只規(guī)定了控制下限。本研究中，采用自建高效液相色譜法測(cè)定含量[6]，對(duì)不同廠家不同批次的復(fù)方丹參片中有效成分含量進(jìn)行了連續(xù)跟蹤檢測(cè)，3個(gè)廠家生產(chǎn)的共計(jì)18個(gè)批次的市售產(chǎn)品中丹參酮ⅡA和丹酚酸B含量均符合《中國(guó)藥典》限量要求，除B廠和C廠6個(gè)批次的產(chǎn)品在丹參酮ⅡA含量上存在明顯差異外，各廠家6個(gè)批次的產(chǎn)品在有效成分含量上沒(méi)有明顯差別;但同一生產(chǎn)廠家不同批次產(chǎn)品間有效成分的含量卻呈現(xiàn)比較大的差異，丹參酮ⅡA和丹酚酸B的含量最高值與最低值相差1.4～1.8倍，批間含量較穩(wěn)定的是A廠產(chǎn)品，B廠產(chǎn)品批間含量差異最大。批間含量穩(wěn)定性有助于保證臨床用藥安全、有效，醫(yī)療機(jī)構(gòu)在進(jìn)行臨床藥品遴選時(shí)應(yīng)盡可能選擇批間含量穩(wěn)定性好的產(chǎn)品。

復(fù)方丹參片中含有丹參、三七等中藥材，其中丹參藥材經(jīng)過(guò)提取以獲取有效成分，出現(xiàn)不同生產(chǎn)廠家以及同一生產(chǎn)廠家不同批次產(chǎn)品中丹參酮ⅡA和丹酚酸B含量差異較大的原因，可能與丹參藥材的不同來(lái)源、不同產(chǎn)地、不同采收時(shí)間、不同加工方法等有關(guān)[11-12]。如何避免不同生產(chǎn)廠家、不同批次間有效成分含量的大幅波動(dòng)，值得藥品審批監(jiān)管部門(mén)、生產(chǎn)廠家思考。推行中藥材規(guī)范化種植，生產(chǎn)廠家應(yīng)盡量使用GAP基地種植生產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)藥材，可能是減少?gòu)?fù)方丹參片有效成分含量波動(dòng)幅度的有效途徑。

此外，復(fù)方丹參片是一種復(fù)方制劑，臨床藥效的充分發(fā)揮有賴(lài)于各藥材有效成分的綜合作用。雖然我國(guó)藥典收載的復(fù)方丹參片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不斷提高，市售的制劑產(chǎn)品質(zhì)量也有很大提高[13]，但對(duì)其中的三七活性成分皂苷類(lèi)、冰片中的主要成分均僅采用定性檢查的方式，未對(duì)其含量進(jìn)行定量控制。研究表明，不同廠家生產(chǎn)的復(fù)方丹參片中上述兩種成分含量差異更大[8，10]。這不利于對(duì)復(fù)方丹參片的質(zhì)量進(jìn)行全面控制，建議不斷完善、提高藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

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