Smad7反義寡核苷酸對(duì)人胰腺癌SW1990細(xì)胞MMP-2和TIMP-2表達(dá)及細(xì)胞增殖的影響

于鴻 黃俊星 王朝夫 施達(dá)仁

·論著·

Smad7反義寡核苷酸對(duì)人胰腺癌SW1990細(xì)胞MMP-2和TIMP-2表達(dá)及細(xì)胞增殖的影響

于鴻 黃俊星 王朝夫 施達(dá)仁

目的研究Smad7反義寡核苷酸(ASODN)轉(zhuǎn)染后人胰腺癌SW1990細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-2(TIMP-2)表達(dá)及細(xì)胞增殖的變化，探討Smad7在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制。方法經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)將Smad7 ASODN轉(zhuǎn)染人胰腺癌細(xì)胞株SW1990。以無義寡核苷酸(NSODN)轉(zhuǎn)染、單加ASODN、單加脂質(zhì)體作為對(duì)照。熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率； RT-PCR、蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞Smad7、MMP-2和TIMP-2表達(dá)；噻唑藍(lán)(MTT)比色法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的增殖。結(jié)果Smad7 ASODN轉(zhuǎn)染SW1990細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率為81.2%，轉(zhuǎn)染24 h后，轉(zhuǎn)染組、ASODN組和脂質(zhì)體組細(xì)胞Smad7 mRNA表達(dá)量分別為0.34±0.06、0.95±0.07、1.03±0.11；MMP-2 mRNA表達(dá)量為0.54±0.08、1.15±0.13、1.27±0.16； TIMP-2 mRNA表達(dá)量為0.26±0.07、0.72±0.13、0.78±0.17；Smad7蛋白表達(dá)量為0.14±0.03、0.29±0.05、0.28±0.07； MMP-2蛋白表達(dá)量為0.17±0.02、0.29±0.05、0.31±0.04；TIMP-2蛋白表達(dá)量為0.20±0.03、0.41±0.11、0.43±0.09。轉(zhuǎn)染組均較其他各組的表達(dá)顯著減少(P值均<0.01)。轉(zhuǎn)染組、ASODN組、脂質(zhì)體組細(xì)胞的增殖活性分別為0.83±0.03、1.02±0.02、0.99±0.02，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的增殖活性較其他各組顯著被抑制(P值均<0.01)。結(jié)論Smad7 ASODN轉(zhuǎn)染可有效抑制SW1990細(xì)胞Smad7基因的表達(dá)，并抑制MMP-2、TIMP-2表達(dá)及細(xì)胞增殖活性。

胰腺腫瘤； Smad7； 反義寡核苷酸； 基質(zhì)金屬蛋白酶-2； 基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-2； 細(xì)胞增殖

研究表明，TGF-β/Samds信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常在胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用。半數(shù)以上的胰腺癌有TGF-β/Samds信號(hào)通路異常，其發(fā)生機(jī)制主要包括Samds基因家族突變和表達(dá)異常，也涉及TGF-β超家族及其受體的改變[1]。然而，作為TGF-β/Samds信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因子Smad7基因在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用研究甚少。本實(shí)驗(yàn)將Smad7反義寡核苷酸(ASODN)轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞株SW1990，觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)及基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-2(tissue inhibitor of metalloproteinase-2，TIMP-2)表達(dá)及細(xì)胞增殖的變化，進(jìn)一步闡明Smad7在胰腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用。

材料和方法

一、細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

人胰腺癌細(xì)胞株SW1990由復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科劉魯明教授饋贈(zèng)，常規(guī)培養(yǎng)、傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以5×105個(gè)/孔密度接種于6孔板。待細(xì)胞生長(zhǎng)至60%～70%融合時(shí)，采用脂質(zhì)體法將Smad7 ASODN、無義寡核苷酸(NSODN)轉(zhuǎn)染SW1990細(xì)胞。ASODN序列為5′-AAGATAATTCGTTCCCCCTGTCCTGTCTC-3′,NSODN序列為5′-CATTTCTTGCTCTCCACGTGGTGTAGACA-3′，首尾3個(gè)磷酸鍵硫化修飾，5′端標(biāo)記異硫氰酸熒光素(FITC)，均由上海生工有限公司合成，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司，按說明書操作。以單加ASODN、單加脂質(zhì)體、單加培養(yǎng)液作為對(duì)照。轉(zhuǎn)染24 h后收集各組細(xì)胞，部分行細(xì)胞爬片后甲醛固定，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)帶熒光的ASODN的分布。部分細(xì)胞重懸后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

二、Smad7、MMP-2、TIMP-2 mRNA及蛋白檢測(cè)

取轉(zhuǎn)染24、48 h細(xì)胞，用Trizol抽提總RNA，應(yīng)用Advantage cDNA PCR試劑盒(Gibco公司)行RT-PCR。Smad7序列上游5′-CCCATCTTCATCAAGTCCG-3′，下游5′-GCTGTAGGCTTTCTCATAGTCA-3′，擴(kuò)增片段335 bp；MMP-2上游5′-CTCAGCGGCTCATGGTCC-GGCC-3′，下游5′-CATGGTCCGGCCCCCGCCCCCA-3′，擴(kuò)增片段278 bp；TIMP-2上游5′-CTGTCC-CCTCBCCTCTTCGC-3′，下游5′-TCCACCTCCTTC-TCGCTCACTG-3′，擴(kuò)增片段303 bp；內(nèi)參GAPDH上游5′-ACCACAGTCCATGCCATG-CCATCAC-3′，下游5′-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′，擴(kuò)增片段450 bp，均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)條件：94℃ 5或7 min，94℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 1 min，共33個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，Kodak Digital Science 1D掃描，以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度比值表示mRNA表達(dá)量。

取各組標(biāo)本，按本實(shí)驗(yàn)室方法提取蛋白[2]，常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法。以β-actin為內(nèi)參。兔抗人Smad7、鼠抗人MMP-2及TIMP-2多抗均購(gòu)于DAKO公司。以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度比值表示蛋白表達(dá)量。

三、細(xì)胞增殖活性檢測(cè)

取各組指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以1×104個(gè)細(xì)胞數(shù)接種于96孔板中，每組6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24、48、72 h后分別每孔加入噻唑藍(lán)(MTT，5 mg/ml)20 μl再培養(yǎng)4 h，加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)震蕩10 min，測(cè)各孔490 nm處吸光值(A)，取均值。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、轉(zhuǎn)染效率

轉(zhuǎn)染24 h后，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)可見大量綠色熒光，呈離散型、點(diǎn)狀分布，轉(zhuǎn)染效率為81.2%；ASODN組僅少量細(xì)胞見微弱熒光，轉(zhuǎn)染效率為3.1%；NSODN組及脂質(zhì)體組細(xì)胞內(nèi)均未見熒光(圖1)，故以下實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)省略NSODN組。

圖1轉(zhuǎn)染組(a)、ASODN組(b)、脂質(zhì)體組(c)轉(zhuǎn)染效率 上圖：熒光顯微鏡檢(×200) 下圖：流式細(xì)胞儀檢測(cè)

二、細(xì)胞Smad7 mRNA及蛋白表達(dá)

轉(zhuǎn)染組細(xì)胞Smad7 mRNA及蛋白表達(dá)均顯著低于ASODN組，但轉(zhuǎn)染24 h和48 h組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；ASODN組和脂質(zhì)體組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2，表1)。

圖2各組細(xì)胞的Smad7 mRNA(上)及蛋白(下)表達(dá)

表1 各組細(xì)胞Smad7 mRNA及蛋白表達(dá)的變化

注：轉(zhuǎn)染24、48 h組與ASODN組比較，t值分別為：24.287、 16.572、13.141、15.833，aP<0.05

三、細(xì)胞MMP-2、TIMP mRNA及蛋白表達(dá)

轉(zhuǎn)染24 h組細(xì)胞MMP-2、TIMP mRNA及蛋白表達(dá)均顯著低于ASODN組，ASODN組和脂質(zhì)體組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2，圖3、4)。

組 別MMP?2mRNAMMP?2蛋白轉(zhuǎn)染24h組0．54±0．08a0．17±0．02aASODN組1．15±0．130．29±0．05脂質(zhì)體組1．27±0．160．31±0．04組 別TIMP?2mRNATIMP?2蛋白轉(zhuǎn)染24h組0．26±0．07a0．20±0．03aASODN組0．72±0．130．41±0．11脂質(zhì)體組0．78±0．170．43±0．09

注：轉(zhuǎn)染24 h組與ASODN組比較，t值分別為11.308、7.262、 18.733、10.465，aP<0.05

圖3 各組細(xì)胞MMP2 mRNA(上)及蛋白(下)表達(dá)

四、細(xì)胞增殖活性

轉(zhuǎn)染24、48、72 h后，細(xì)胞的增殖活性均較ASODN組降低，以轉(zhuǎn)染后24 h最為明顯，ASODN組和脂質(zhì)體組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。

表3 各組細(xì)胞的增殖活性(A490值

注：轉(zhuǎn)染組與ASODN組比較，t值分別為9.832、9.758、9.549，aP<0.05

討 論

TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是由TGF-β超家族、TGF-β受體、Smad蛋白家族及其核內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子組成的腫瘤抑制通路，該通路的異?？墒辜?xì)胞逃避TGF-β介導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)，導(dǎo)致多種腫瘤發(fā)生[3-4]。不同類型的細(xì)胞TGF-β誘導(dǎo)產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)不同，可刺激或抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，可作為腫瘤抑制基因和癌基因的雙重角色存在[5]。作為Smad家族中的抑制性成員，Smad7不僅可阻斷Smad2和Smad3與Ⅰ型TGFβ-R的結(jié)合及其磷酸化，還可通過直接與活化的TGFβ-R及細(xì)胞內(nèi)各轉(zhuǎn)錄因子組氨酸去乙?；附Y(jié)合而抑制TGF-β的信號(hào)通路[6]。研究表明，胰腺癌組織Smad7表達(dá)增高；轉(zhuǎn)染Smad7基因的胰腺癌細(xì)胞在裸鼠中成瘤能力增強(qiáng)，表明Smad7表達(dá)的異常將有助于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[7]。Kleeff等[8]通過顯微注射技術(shù)獲得轉(zhuǎn)Smad7基因小鼠，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠胰腺的導(dǎo)管上皮發(fā)生了惡性轉(zhuǎn)變。

基質(zhì)金屬蛋白酶系統(tǒng)，包括MMPs及相應(yīng)的TIMPs。其中MMPs的表達(dá)增加與多種惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移關(guān)系極為密切，而TIMPs的表達(dá)增加往往與腫瘤侵襲能力下降及患者的預(yù)后較好相關(guān)[9]。

本研究成功地將Smad7基因轉(zhuǎn)染入SW1990細(xì)胞，轉(zhuǎn)染率高達(dá)81.2%，有效地抑制Smad7表達(dá)，并顯著地抑制了細(xì)胞的增殖。同時(shí)細(xì)胞MMP-2及TIMP-2表達(dá)均顯著降低，表明Smad7也參與細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶系統(tǒng)的代謝過程。至于轉(zhuǎn)染后SW1990細(xì)胞MMP-2與TIMP-2表達(dá)共同降低，可能它們之間還存在一定反饋機(jī)制，有待今后進(jìn)一步深入研究。

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EffectofSmad7antisenseoligodeoxynucleotideontheexpressionofMMP-2,TIMP-2andproliferationinhumanpancreaticcancercellsSW1990

YUHong,HUANGJun-xing,WANGChao-fu,SHIDa-ren.
DepartmentofPathology,TaizhouPeople′sHospital,Taizhou225300,China

HUANGJun-xing,Email:huangjunxing@yahoo.com.cn

ObjectiveTo investigate the effect of Smad7 antisense oligodeoxynucleotide (ASODN) on proliferation in human pancreatic cancer cell line SW1990, with a focus on the expression of matrix metalloproteinase-2(MMP-2) and tissue inhibitor of metalloproteinase-2(TIMP-2). To explore the underlying mechanism of the role of Smad7 in the pathogenesis and development of pancreatic cancer.MethodsSmad7 ASODN was transfected into SW1990 cells through lipofectamine. Nosense oligodeoxynucleotide (NSODN), ASODN and lipofectamine was used as control. The transfection efficiency was assessed by fluorescence microscopy and flow cytometry. The expressions of Smad7, MMP-2 and TIMP-2 in transfected cells were detected by RT-PCR and Western blot. Cell viability was assessed by dimethyl thiazoldiphenyltetrazoliumbromide (MTT) method.ResultsSmad7 was expressed in SW1990 cells. The transfection efficiency of SW1990 was 81.2%. The expressions of Smad7 mRNA were 0.34±0.06, 0.95±0.07, 1.03±0.11 in transfected group, ASODN and lipofectamine group; and the expressions of MMP-2 mRNA were 0.54±0.08, 1.15±0.13, 1.27±0.16; and the expressions of TIMP-2 mRNA were 0.26±0.07, 0.72±0.13, 0.78±0.17, the mRNA expressions were significantly reduced in Smad7 ASODN transfected group, compared with other two groups (P<0.01). The expressions of Smad7 protein were 0.14±0.03, 0.29±0.05, 0.28±0.07 in transfected group, ASODN and lipofectamine group; the expressions of MMP-2 protein were 0.17±0.02, 0.29±0.05, 0.31±0.04, and the expressions of TIMP-2 protein were 0.20±0.03, 0.41±0.11, 0.43±0.09, the protein expressions were significantly reduced in Smad7 ASODN transfected group, compared with other two groups (P<0.01). TheA490values of proliferation were 0.83±0.03, 1.02±0.02, 0.99±0.02 in transfected group, ASODN and lipofectamine group, the proliferation were significantly reduced in Smad7 ASODN transfected group, compared with other two groups (P<0.01).ConclusionsSmad7 ASODN could effectively inhibit the expressions of Smad7, therefore decrease the expressions of MMP-2, TIMP-2 and reduce the proliferation.

Pancreatic neoplasms; Smad7； Antisense oligodeoxynucleotide； Matrix metalloproteinase-2； Tissue inhibitor of metalloproteinase-2; Cell proliferation

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.01.008

江蘇省醫(yī)學(xué)重點(diǎn)人才基金(RC2007036)

225300 江蘇泰州，江蘇省泰州市人民醫(yī)院病理科(于鴻)，腫瘤科(黃俊星)；復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科(王朝夫、施達(dá)仁)

黃俊星，Email:huangjunxing@yahoo.com.cn

2011-06-16)

(本文編輯：呂芳萍)