HPLC法測定氧化型和還原型谷光甘肽

孫偉張，于波濤 ，蔣 燕，周毛仔

(成都軍區(qū)總醫(yī)院,a.ET-CT中心;b.藥劑科,四川 成都 610083)

HPLC法測定氧化型和還原型谷光甘肽

孫偉張a，于波濤b，蔣 燕b，周毛仔a

(成都軍區(qū)總醫(yī)院,a.ET-CT中心;b.藥劑科,四川 成都 610083)

目的建立同時測定谷光甘肽原料及制劑中氧化型和還原型谷光甘肽的反相高效液相色譜法。方法采用外標(biāo)法，以Hypersil C18為色譜柱， 25 mmol/L KH2PO4(pH2.5) :四氫呋喃(100:1)為流動相，流速為1.0 ml/min，柱溫為30 ℃，檢測波長230 nm，進(jìn)行分離測定。結(jié)果在3.12～2 490.0 μg/ml間，GSH線性關(guān)系良好(r=0.999 9)，測得回收率為101.84%。在3.25～975.0 μg/ml間，GSSG線性關(guān)系良好(r=0.999 9)，測得回收率為97.84%。結(jié)論所用方法準(zhǔn)確可靠、專屬性強(qiáng)，可用于GSH和GSSG的同時測定。

還原型谷胱甘肽；氧化型谷胱甘肽；高效液相色譜法；含量測定

谷胱甘肽(glutathion)是由谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸組成的三肽，是體內(nèi)最重要的抗氧化劑和自由基清除劑。糖尿病、愛滋病、青光眼以及各種肝臟疾病都與體內(nèi)GSH缺乏有關(guān)，因此，補(bǔ)充外源性GSH，提高GSH血清水平，從而增加細(xì)胞內(nèi)GSH量，具有十分重要的臨床意義。谷胱甘肽極易被氧化，因此，本文建立了同時測定還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)的HPLC，用于谷胱甘肽制劑的工藝研究和質(zhì)量評價。

1 儀器和試藥

1500型高效液相色譜儀(美國Alltech))；HA-202型電子天平(日本A&D)；還原型谷胱甘肽對照品(Sigma,北京百靈威公司)；氧化型谷胱甘肽對照品(Boliman，迪馬公司)；其余試劑均為AR級。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 采用外標(biāo)法，以Hypersil C18為色譜柱，25 mmol/L KH2PO4(pH2.5)-四氫呋喃(100:1)為流動相，流速為1.0 ml/min，柱溫為30 ℃，檢測波長230 nm，進(jìn)行分離測定。在上述色譜條件下GSH保留時間約2.8 min，理論塔板數(shù)2 260，GSSG保留時間約4.8 min，理論塔板數(shù)3 070，二者的分離度R為2.1。在選定的色譜條件下，GSH和GSSG可得到較好的峰形且分離完全(圖1)。

圖1 GSH(A)和GSSG(B)對照品溶液HPLC色譜圖

2.2線性關(guān)系的考察

2.2.1GSH線性關(guān)系的考察 取GSH對照品適量，精密稱定，置25ml量瓶中，用蒸餾水溶解、稀釋至刻度，搖勻，得濃度為2.49mg/mlGSH對照品貯備液,精密量取GSH對照品貯備液適量，以蒸餾水稀釋成濃度為2 490.0、1 245.0、249.0、49.8、24.9、12.45、6.23、3.12μg/ml的GSH對照品溶液。取上述不同濃度GSH對照品溶液，進(jìn)樣20μl，在選定的色譜條件下進(jìn)行分離測定，記錄色譜圖和GSH峰面積A，以濃度C值為橫坐標(biāo)，A為縱坐標(biāo)，直線回歸，得GSH線性方程，A=1 225.58C-26.525 1,r=0.999 9。

2.2.2GSSG線性關(guān)系的考察 取GSSG對照品適量，精密稱定，置25ml容量瓶中，用蒸餾水溶解、稀釋至刻度，搖勻，得濃度為1.95mg/mlGSSG對照品貯備液,精密量取貯備液適量，以蒸餾水稀釋成濃度為975.0、312.01、156.0、78.0、39.0、13.0、6.5、3.25μg/ml的GSSG對照品溶液。取上述GSSG對照品溶液，進(jìn)樣20μl，在選定的色譜條件下分離測定，記錄色譜圖和GSSG峰面積A，以濃度C為橫坐標(biāo)，A值為縱坐標(biāo)，直線回歸，得GSSG線性方程：A=1 955.04C+2 737.48，r=0.999 9。

2.3回收率實驗

2.3.1GSH回收率實驗 精密量取GSH對照品貯備液適量，用蒸餾水稀釋成高、中、低3種不同濃度的GSH對照品溶液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法進(jìn)樣，測定5次，記錄GSH色譜峰面積A，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，以測得量與加入量之比計算回收率，結(jié)果見表1。

表2 GSH回收率試驗結(jié)果(n=15)

2.3.2GSSG回收率實驗 精密量取GSSG對照品貯備液適量，用蒸餾水稀釋成高、中、低三種不同濃度的GSSG對照品溶液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法進(jìn)樣，測定5次，記錄GSSG色譜峰面積A，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，以測得量與加入量之比計算回收率，結(jié)果見表2。

表2 GSSG回收率試驗結(jié)果(n=15)

2.4精密度測定

2.4.1GSH測定的日內(nèi)和日間精密度 按回收率試驗項下方法，測定GSH高、中、低三種不同濃度對照品溶液，以一天內(nèi)5次測定結(jié)果計算日內(nèi)RSD，以3天內(nèi)15次測定結(jié)果計算日間RSD，結(jié)果見表3。GSH日內(nèi)RSD≤3.91 ，日間RSD≤5.12。

2.4.2GSSG日內(nèi)和日間精密度測定 按回收率試驗項下方法，測定GSSG高、中、低三種不同濃度對照品溶液，以一天內(nèi)3次測定結(jié)果計算日內(nèi)RSD，以5天內(nèi)15次測定結(jié)果計算日間RSD,結(jié)果見表4。GSSG日內(nèi)RSD≤5.53%，日間RSD≤4.23%。

表3 GSH 精密度實驗結(jié)果

表4 GSSG 精密度實驗結(jié)果

2.5GSH對照品溶液穩(wěn)定性考察 取谷胱甘肽(GSH)對照品適量，精密稱定，用水溶解稀釋成濃度為498.0 μg/ml谷胱甘肽對照品溶液。置冰箱4 ℃放置，在不同時間取出測定其濃度，結(jié)果見表5。由表5可見，谷胱甘肽對照品溶液宜臨用新配。

表5 谷胱甘肽對照品溶液4 ℃貯存的穩(wěn)定性結(jié)果

3 討論

GSH 含量測定方法的文獻(xiàn)報道主要有酶免疫測定法和HPLC法。由于GSH紫外吸收較弱，文獻(xiàn)報道的方法多采用柱前衍生化后以紫外或熒光檢測器進(jìn)行測定。為考察GSH的穩(wěn)定性，需同時測定GSH和GSSG，而GSSG是兩GSH分子的-SH鍵脫氫縮合而成，衍生化試劑如OPA試劑、Ellman′s試劑等與GSH和GSSG均發(fā)生反應(yīng)，不能區(qū)分二者，因此不宜選用柱前衍生化法。研究中曾采用多種流動相進(jìn)行考察，如0.01 mol/L磷酸溶液-乙腈；0.02 mol/L醋酸鈉溶液-乙腈；磷酸鈉緩沖液(pH6.5)-乙腈，均未有效的分離GSH和GSSG。最后確定以0.025 mol/L磷酸二氫鉀溶液(pH2.5)-四氫呋喃(100:1)作流動相，GSH和GSSG可較好的分離，測定峰形和保留時間均較好。目前同時分離測定GSH和GSSG的方法尚未見報道。該方法的建立為谷胱甘肽制劑的質(zhì)量評價、穩(wěn)定性考察和胃腸道生物模型研究的進(jìn)行奠定了基礎(chǔ)，試驗證明，該方法簡便、可靠。

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DeterminationofglutathioneandoxidizedglutathionebyHPLC

SUN Wei-zhanga,YU Bo-taob,JIANG Yanb,ZHOU Mao-zaia

(General Hospital of Chengdu Military Command, a.PET-CT center; b.Department of Pharmacy, Chengdu 610083,China)

ObjectiveTo establish a method to determine GSH and GSSG by HPLC.MethodThe analytical column was Hypersil C18.The mobile phase consisted of 25m mol/L KH2PO4(pH2.5): tetrahydrofuran(100: 1).The flow rate was 1.0 ml/min. Column temperature was 30 ℃ and the detective wavelength was 230 nm.ResultThe calibration curve of GSH was linear within the range of 3.12 μg/ml～2490.0 μg/ml(r=0.999 9)and the average recovery was 101.84%. The calibration curve of GSSG was linear within the range of 3.25 μg/ml～975.0 μg/ml(r=0.999 9)and the average recovery was 97.84%.ConclusionThe method was proved to be reliable and accurate, which could be used to determinate GSH and GSSG simultaneously.

GSH; GSSG; HPLC; Determination

孫偉張(1965-)，男，副主任藥師.E-mail:sunwz@msn.com.

R917

A

1006-0111(2012)04-0305-03

10.3969/j.issn.1006-0111.2012.04.018

2012-03-12

2012-05-21