不同濃度腫瘤壞死因子對人牙周膜細胞增殖和堿性磷酸酶活性的影響

郝立輝

(邢臺醫(yī)學高等專科學?？谇幌担颖毙吓_ 054000)

牙周膜細胞是一組由成纖維細胞、成骨細胞、成牙骨質(zhì)細胞和未分化的間充質(zhì)干細胞等多種細胞成分組成的異質(zhì)性細胞群，具有合成新生牙周組織的潛能［1］。在正常條件下牙周膜細胞具有一定的增殖和分化能力，對牙周支持組織的發(fā)育、功能維持和再生發(fā)揮重要作用。

牙周炎是通過多種炎性因子和細胞毒性作用對牙周組織產(chǎn)生的破壞性影響，造成膠原纖維降解、牙槽骨吸收等病理性變化，細菌等外界刺激造成炎性因子如IL－1β、TNF－α等在局部產(chǎn)生，活化T、B淋巴細胞和巨噬細胞產(chǎn)生破壞作用，導致牙周組織中的RANKL/RANK/OPG調(diào)節(jié)系統(tǒng)失衡，最終造成牙周膜、牙槽骨破壞［2］。有研究報道:炎癥因子可影響細胞的增殖和分化［3］，本研究將著重研究不同濃度TNF－α對人牙周膜細胞增殖和分化的影響，以探討炎癥因子在牙周組織再生中發(fā)揮的作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

胎牛血清(FBS)、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、膠原酶、Dispase酶、谷氨酰胺、青鏈霉素(Gibco，美國);外源腫瘤壞死性因子(TNF－α，Peprotech，美國);兔抗人波形絲蛋白和角蛋白、羊抗兔熒光二抗(Abcam，美國);免疫組化試劑盒 (生物晶美公司);MTT(Sigma公司 ，美國);二甲基亞砜(DMSO，天津匯英化學試劑有限公司);酶聯(lián)免疫檢測儀(Bio Tek公司，美國);堿磷酶試劑盒(南京建成);實時定量PCR檢測儀和熒光染料(Toyobo Co.，LTD.Osaka)。

1.2 人牙周膜細胞(HPLCs)的體外培養(yǎng)和鑒定

取因阻生或正畸需要拔除的前磨牙，在超凈工作臺中用0.01 mol/L PBS沖洗5～7次后，刮取根中/下1/3的牙周膜，剪成 1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，Ⅰ型膠原酶消化 15 min，置離心管內(nèi)800 r/min離心5 min棄上清后，重懸并放置在6孔板中(含 150 mL/L FBS、100μmol/L 抗壞血酸、0.292 mg/mL谷氨酰胺、100 units/mL 青霉素/鏈霉素的 α－MEM 培養(yǎng)基)。在37℃、50 mL/mL CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)3～7 d，待細胞從組織塊邊緣爬出并生長達80%匯合時，用胰蛋白酶/EDTA(2.5 g/L，pH=6.4)消化傳代。

取第2代生長良好的HPDLCs胰酶消化后，以2×104/孔的密度接種于24孔培養(yǎng)板，待細胞貼壁24 h后，用40 g/L多聚甲醛室溫下固定20 min后進行免疫熒光染色鑒定。兔抗人波形絲蛋白一抗?jié)舛葹?∶200;角蛋白濃度為1∶150，避光滴加FITC標記的羊抗兔(1∶200)，孵育完成后，Hoechst 33342(50 g/mL，Sigma)襯染細胞核15 min。熒光顯微鏡下觀察，用 DP controller(Olympus)和 DP manager軟件處理圖像。

1.3 不同濃度腫瘤壞死因子(TNF－α)對人牙周膜細胞增殖的影響

取第4代HPDLCs，待細胞貼壁后PBS沖洗細胞3遍，在常規(guī)培養(yǎng)液中分別加入TNF－α(1、5、10、20 ng/mL)，PDLCs加入等量PBS作為對照組(0 ng/mL)，每2 d半量換液。

1.3.1 MTT 法檢測 HPDLCS活性

取第4代對數(shù)生長期HPDLCs，經(jīng)胰蛋白酶消化后離心，用含10 mL/L FBS的α－MEM制成細胞懸液，以5×103/孔接種于96孔培養(yǎng)板，標準條件下進行培養(yǎng)。棄原培養(yǎng)液，將細胞隨機分為5組(1個對照組和4個實驗組)，每組復3孔。4個實驗組分別加入含 TNF－α 終末濃度為 1、5、10、20 ng/mL的α－MEM培養(yǎng)液;對照組加入等量不含TNF－α的α－MEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，每2 d半量換液 1 次。分別于培養(yǎng)后 0、1、2、3、4、5、6、7 d 各時間點，用MTT法測定 HPDLCs的增殖能力。每孔加入100 μL 5 mg/mL MTT液，置50 mL/L CO2孵箱中，37℃孵育4 h后，吸凈孔內(nèi)液體，加入500 μL二甲基亞砜振蕩器震蕩15 min，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測量波長490 nm的光密度(OD)值。

1.3.2 實時定量PCR檢測HPDLCs周期蛋白D1(Cyclin D1)mRNA的表達

取第4代 PDLCs以1×104/mL密度接種于T25 cm 培養(yǎng)瓶，分別用0、1、5、10、20 ng/mL 不同濃度TNF－α刺激72 h后提取 RNA，進行逆轉錄反應。逆轉錄所得 cDNA進行熒光定量 PCR檢測，目的基因及管家基因在不同的反應管中進行擴增，反應體系均為20 μL。Cyclin D1上游引物序列:5'－TGATGCTGGGCACTTCATCTG －3';Cyclin D1 下游引物序列:5'－TCCAATCATCCCGAATGAGAGTC－3';ACTIN上游引物序列:5'－TGGCACCCAGCACAATGAA－3';ACTIN下游引物序列:5'－CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA－3'。反應條件:95℃變性20 min，95℃ 30 s，60℃ 1 min，40個循環(huán)。T7500型實時熒光定量 PCR儀檢測記錄數(shù)據(jù)，結果根據(jù)標準曲線由軟件自動計算后得出。實驗進行3次重復。

1.4 不同濃度 TNF－α 對 HPDLCs堿性磷酸酶(ALP)活性的影響

取第4代 PDLCs以2×103/孔的密度接種于96孔板，加入含100 mL/L FBS的α－MEM培養(yǎng)液(200 μL/孔)，于37 ℃、5 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁伸展后，棄原液，將細胞隨機分為5組，分別加入含 TNF－α 終末濃度為 0、1、5、10、20 ng/mL的α－MEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，用堿性磷酸酶試劑盒進行ALP活性的分析。具體方法如下:①吸去培養(yǎng)液，細胞用0.01 mol/L的PBS洗滌3次;②吸干，每孔加入50 μL的2 g/L的TritonX－100，37℃，30 min，裂解細胞;③每孔加入ALP 試劑盒標準液50 μL，底物緩沖液50 μL，37 ℃30 min;④每孔加入底物終止液150 μL，用酶聯(lián)儀檢測520 nm的光密度(OD)值。時間為橫座標，吸光度值為縱座標，繪制ALP變化曲線。本研究進行3次重復。

1.5 統(tǒng)計學分析

分析SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，兩組間比較用獨立樣本t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 人牙周膜細胞原代培養(yǎng)和鑒定

采用組織塊培養(yǎng)法原代培養(yǎng)48 h后，可見細胞從組織塊邊緣爬出，細胞呈長梭形、橢圓形及鋪路石樣(圖1)。傳至第3代時細胞生長旺盛，形態(tài)為紡錘形或成纖維細胞樣，細胞直徑約100 μm左右，胞漿透明，整體呈旋渦狀生長(圖2)。對第2代牙周膜細胞進行免疫熒光染色鑒定，抗波形蛋白染色后可見胞漿內(nèi)綠色熒光表達，說明波形絲蛋白染色呈陽性陽性(圖3);抗角蛋白染色呈陰性(圖4)，符合間葉來源細胞特征。

圖1 牙周膜細胞原代培養(yǎng)(×40)

圖2 第3代細胞呈長梭形旋渦狀生長(×40)

圖3 波形絲蛋白染色陽性(×40)

圖4 角蛋白染色陰性(×40)

2.2 不同濃度TNF－α對HPDLCs細胞增殖的影響

培養(yǎng)0～2 d各濃度TNF－α刺激組與對照組細胞增殖活性無顯著差別(P＞0.05)，3～7 d時，1 ng/mL和5 ng/mL TNF－α對HPDLCs增殖均有一定促進作用，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05);在10 ng/mL和20 ng/mL TNF－α 刺激下，HPDLCs增殖活性明顯降低，與對照組相比，3～7d各時間點差異均有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)(圖5)。

2.3 不同濃度TNF－α對HPDLCs周期蛋白D1表達的影響

1、5、10、20 ng/mL TNF－α 刺激 HPDLCs 72 h后，其Cyclin D1的表達均發(fā)生變化，與對照組相比1、5 ng/mL濃度Cyclin D1 mRNA表達水平顯著增高(P＜0.05)，其中5 ng/mL組升高最明顯，約為對照組的1.73倍;隨著 TNF－α 濃度的增加，Cyclin D1mRNA的表達呈降低趨勢，10 ng/mL、20 ng/mL組cyclin D1 mRNA表達量較對照組顯著降低(P＜0.05)，其中20 ng/mL組降低幅度最大(圖6)。

2.4 不同濃度TNF－α對HPDLCs ALP活性的影響

低濃度(1、5 ng/mL)TNF－α刺激 HPDLCs 72 h后，細胞 ALP活性均較對照組明顯增高(P＜0.05)，其中5ng/mL組升高最顯著;10 ng/mL及20 ng/mL組細胞ALP活性均較對照組明顯降低(P＜0.05)，其中20 ng/mL組降低幅度最大(圖7)。

圖5 不同濃度TNF－α對 HPDLCs細胞增殖活性的影響

圖6 不同濃度TNF－α對HPDLCs周期蛋白D1mRNA表達的影響

圖7 不同濃度TNF－α對HPDLCs ALP活性的影響

3 討論

牙周膜細胞是具有多種生物學功能和分化潛能的細胞群，是牙周組織再生修復的重要細胞。大量研究表明，在牙周炎造成的組織損傷過程中，TNFα和IL－1β作為主要炎癥因子影響組織的再生［4］。牙周組織包括牙齦、牙周膜、牙槽骨等多種軟硬組織在炎癥因子(TNFα、IL－1β)作用下均可造成損傷。有研究表明，用LPS體外刺激牙周膜細胞后可誘導牙周膜細胞分泌TNFα和IL－1β，同時這兩種炎癥因子的基因表達也顯著升高［5］。Rossa等［6］報道，利用炎癥因子可以體外模擬牙周炎導致的炎癥微環(huán)境，在炎癥微環(huán)境中牙周膜細胞表達MMP－13，同時p38 MAPK可負向調(diào)控MMP13的表達［6］。

近期相關研究表明，炎癥微環(huán)境可以改變細胞的功能［7］，牙周膜細胞是牙周組織再生的關鍵細胞，不同的炎癥因子對其刺激后可以導致細胞增殖、分化或引起細胞凋亡。本研究采用不同濃度的TNF－α對牙周膜細胞進行刺激結果顯示，TNF－α在一定濃度范圍內(nèi)可提高牙周膜細胞增殖活性，但是當濃度增加至10 ng/mL及20 ng/mL時細胞的增殖活性受到了顯著抑制，其中以20 ng/L效果最為顯著。Cyclin D1是一種重要的細胞周期蛋白，在細胞增殖中起正性調(diào)控作用，Cyclin D1通過與CDK4和CDK6形成復合體，而使Rb蛋白磷酸化 ，促進 G1/S期轉移，當Cyclin D1蛋白高表達時，就會導致細胞增殖［8］。本結果顯示，低濃度TNF－α刺激可促進牙周膜細胞增殖。其原因可能是，當細胞受到炎癥刺激時可激活調(diào)控細胞增殖的Wnt信號通路［9］;另外牙周膜細胞群具有一定的免疫調(diào)節(jié)能力，炎癥刺激可啟動其免疫調(diào)節(jié)機制也可以導致細胞增殖［10］。但是隨著TNF－α濃度的增高，HPDLCs增殖活性和細胞周期蛋白表達都受到了不同程度的抑制，可能是由于TNF－α刺激后部分TNF－α與其在細胞膜上的受體結合轉移到細胞內(nèi)，從而以活化NFk－β信號通路，導致細胞的凋亡。

牙周膜細胞的成骨表型特點包括表達高水平的堿性磷酸酶、轉化生長因子β1、降鈣素、細胞外基質(zhì)蛋白以及形成礦化結節(jié)等。Fujita等［11］發(fā)現(xiàn)外源性炎癥因子能顯著降低牙周膜細胞ALP活性，并影響牙周膜細胞的分化、增殖和相關基質(zhì)蛋白的形成，認為炎癥微環(huán)境中的關鍵炎癥因子可能通過抑制牙周膜細胞的增殖、分化和合成基質(zhì)蛋白等在牙周組織的修復和損傷中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)10、20 ng/mL濃度的TNF－α刺激后HPDLCs ALP表達顯著降低，提示在牙周炎的發(fā)展過程中，炎癥因子的分泌增加也可直接影響ALP的合成，從而影響礦化基質(zhì)的形成，可能是導致牙周病引起軟硬組織損傷的關鍵因素。

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