慢性牙周炎病人基礎(chǔ)治療前后Th17型細胞因子及RORC的表達變化

周 艷，徐 艷

(1.市口腔醫(yī)院，江蘇南通 226001;2.南京醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)研究所，江蘇南京 210029;3.南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙周科，江蘇南京 210029)

在牙周炎病變過程中，牙周支持組織的喪失一方面是由于致病菌產(chǎn)生的酶和毒素造成的直接損害，另一方面是過度的宿主免疫反應(yīng)造成繼發(fā)性損傷。病原微生物作用于牙周組織單核巨噬細胞，可分泌出多種細胞因子，這些細胞因子與牙槽骨破壞吸收有著密切關(guān)系，其中 IL-1、IL-4、IL-6、IL-8、IL-11、TNF-α、HGF等細胞因子在牙周炎病變中的作用已經(jīng)被廣泛研究與證實［1-2］。Th17型細胞因子是一類新近發(fā)現(xiàn)的前炎癥因子功能家族，包括IL-17、IL-21、IL-22等，以往的研究已證實，這些細胞因子在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、炎癥性腸病等炎癥和自身免疫性疾病中，起到關(guān)鍵和重要的致病作用［3-7］，但在CP的炎性免疫反應(yīng)中的研究尚未深入。本實驗通過檢測CP病人牙周基礎(chǔ)治療前后齦溝液中Th17型細胞因子(IL-17、IL-21)的濃度變化，以及外周血CD4+T細胞中Th17的特異性轉(zhuǎn)錄因子RORC的表達水平，以期探討Th17型細胞因子在CP發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

2008-10—2009-03從南通市口腔醫(yī)院牙周科診斷為牙周炎的病人中選擇受試者30例，其中男性19例，女性11例，年齡30～61歲，每例病人均選擇1個第一磨牙作為研究牙(個別第一磨牙不符合納入標準者用相鄰的第二磨牙代替)。所有受試者均知情同意。納入標準:①身體健康，無全身性疾病;②無吸煙史;③口內(nèi)余留牙不少于20個;④過去6個月內(nèi)無牙周治療史;⑤過去3個月內(nèi)無抗生素、非甾體類抗炎藥及免疫抑制劑應(yīng)用史;⑥婦女未妊娠。研究牙納入標準:①無牙髓及根尖周病變;②無咬合創(chuàng)傷;③無不良修復(fù)體;④無Ⅱ度以上根分叉病變;⑤3 mm≤牙周探診深度(PD)≤8 mm。

1.2 臨床指標檢查和基礎(chǔ)治療

采用L?e和Silness法檢查研究牙位的菌斑指數(shù)(PLI)、牙齦指數(shù)(GI)、探診深度(PD)和臨床附著水平(CAL)等牙周臨床指標。然后根據(jù)牙周基礎(chǔ)治療計劃接受詳細的口腔衛(wèi)生指導(dǎo)、全口齦上潔治、齦下刮治和根面平整。治療結(jié)束后6周復(fù)查，再次并作牙周臨床指標檢查。

1.3 齦溝液中Th17型細胞因子濃度檢測

分別于基礎(chǔ)治療前和治療后6周，早餐后2～3 h，采集所有病人研究牙的齦溝液。研究牙以棉卷隔濕，輕吹牙齦 1 min后，將消毒的濾紙條(2 mm×20 mm)輕輕插入齦溝或牙周袋內(nèi)，遇阻力即止，停留30 s取出(如被血污染則棄除)，用Sartorius BS124S分析天平(誤差d=0.0001 g)稱重，按比重為1換算成體積。稱重后樣本立即放入200 μL磷酸鹽緩沖液(PBS)中，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測齦溝液中的IL-17、IL-21，操作按R＆D的Human ELISA Kit說明書進行。

1.4 外周血CD4+T細胞中轉(zhuǎn)錄因子RORC表達水平檢測

分別于基礎(chǔ)治療前和治療后6周采集所有病人外周血，以密度梯度離心法進行單核細胞分離;吸取單核細胞層，根據(jù)MACS CD4+T MicroBeads(Militenyi Biotec公司)操作說明，對外周血CD4+T細胞進行免疫磁珠分選;采用試劑盒(Rneasy Mini Kit，Qiagen公司)進行RNA的抽提及逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA;采用熒光定量PCR法檢測外周血CD4+T細胞中轉(zhuǎn)錄因子RORC表達水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，牙周基礎(chǔ)治療前后齦溝液中細胞因子水平及外周血轉(zhuǎn)錄因子水平比較用配對t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 基礎(chǔ)治療前后牙周臨床指標的變化

基礎(chǔ)治療后，所有牙周臨床指標(PLI、GI、PD、AL)均較治療前顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，表明牙周臨床癥狀明顯改善(表1)。

表1 牙周基礎(chǔ)治療前后各臨床指標比較()

*與治療前相比P＜0.05

PLI GI PD CAL組別 牙數(shù)治療前30 2.66 ±0.37 1.98 ±0.08 4.73 ±0.84 5.73 ±1.47治療后 30 0.43 ±0.24*0.51 ±0.27*3.25 ±0.67*4.52 ±1.17*

2.2 牙周基礎(chǔ)治療前后齦溝液中Th17型細胞因子(IL-17、IL-21)水平變化

牙周基礎(chǔ)治療后齦溝液中IL-17和IL-21水平均較治療前顯著下降(P＜0.05)，其中IL-17從治療前的(63.4731±19.4746)ng/mL降至(40.0069±10.9361)ng/mL。IL-21 從治療前的(80.4143 ± 39.4763)ng/mL 降 至 (31.6151 ±13.1908)ng/mL(圖1)。

2.3 牙周基礎(chǔ)治療前后外周血CD4+T細胞中轉(zhuǎn)錄因子表達變化

利用MACS免疫磁珠分選技術(shù)將CD4+T細胞分選出后，抽提RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再行Realtime PCR，發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)治療后外周血CD4+T中Th17特異性轉(zhuǎn)錄因子RORC表達水平從治療前的0.7099±0.1455下降至 0.3661 ± 0.1308，兩者相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)(圖2)。

圖2 牙周基礎(chǔ)治療前后外周血CD4+T細胞中轉(zhuǎn)錄因子RORC的表達的比較(*與治療前相比P＜0.05)

3 討論

機體的免疫防御系統(tǒng)在牙周炎的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，在過去的二十年中，一直運用Th1/Th2理論體系來解釋牙周炎的免疫學(xué)機制，然而Th1/Th2在慢性牙周炎發(fā)病機制中誰占主導(dǎo)地位一直存在爭論［8-9］，直到Th17型細胞因子的發(fā)現(xiàn)和確立，才補充了牙周炎發(fā)病機制中缺失的重要一環(huán)。Thl7型細胞因子包括 IL-17、IL-21、IL-22、IL-6、TNF-α等，是一類新近發(fā)現(xiàn)的前炎癥因子功能家族，其中IL-17是Th17型細胞因子中的一個最關(guān)鍵的促炎癥性細胞因子［10］，具有強大的招募中性粒細胞的作用，調(diào)節(jié)并促進多種炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，參與機體多種炎性疾病，與感染、腫瘤、過敏、移植及自身免疫性疾病均有密切關(guān)系［11-12］。

IL-17受體(IL-17R)屬于I型跨膜蛋白，分布廣泛，幾乎所有類型的細胞均有表達。IL-17具有強大的致炎性，作用十分廣泛。大量實驗證據(jù)表明，IL-17在局部組織炎癥中的作用主要通過誘導(dǎo)細胞釋放前炎癥因子及動員中性粒細胞的細胞因子而發(fā)揮作用［13］。而且，它還可引起中性粒細胞蛋白酶和髓過氧化物酶等蛋白水解酶活性增高，提高CXC趨化因子等細胞因子的表達，進一步促進中性粒細胞的聚集。IL-21作為Th17細胞的一種自分泌調(diào)節(jié)因子，在誘導(dǎo)Th17細胞分化、抑制Th1、Treg功能方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。

盡管以IL-17為代表的Th17型細胞因子在牙周疾病免疫機制中作用的研究剛剛開始，仍然不斷有增加的證據(jù)支持Th17型細胞因子在慢性牙周炎發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。如 Cardoso等［14］在慢性牙周炎牙周組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)有Th17細胞的浸潤。Johnson等［15］研究發(fā)現(xiàn)，在治療前，慢性牙周炎病人齦溝液中IL-17的水平較正常人明顯上升。Oda等［16］實驗證實，慢性牙周炎的主要致病菌牙齦卟啉單胞菌能夠促進CD4+T細胞分泌IL-17，從而誘導(dǎo)CD4+T細胞向Th17細胞分化。本實驗通過對CP病人牙周基礎(chǔ)治療前后齦溝液中Th17型細胞因子(IL-17、IL-21)濃度變化的研究發(fā)現(xiàn)，炎癥牙位治療后的齦溝液中Th17型細胞因子(IL-17、IL-21)濃度較治療前明顯下降，此結(jié)果與上述學(xué)者的研究結(jié)論一致。

Th17的分化前體細胞為初始CD4+T祖細胞——ThP細胞，ThP細胞在特定環(huán)境中向不同細胞亞群分化，轉(zhuǎn)錄因子在CD4+T輔助細胞的分化過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，RORC為Th17細胞分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子。為了進一步闡明Th17型細胞因子在CP病人治療前后的變化規(guī)律，我們利用Real-time PCR檢測該實驗中CP病人外周血CD4+T細胞中 RORC轉(zhuǎn)錄水平的變化，發(fā)現(xiàn)RORC在牙周基礎(chǔ)治療前后表達水平發(fā)生了顯著下降，這與齦溝液中 Th17型細胞因子(IL-17、IL-21)在治療前后的變化相一致。

牙周基礎(chǔ)治療是對每個牙周炎病人都適用的最基本的治療方法［17］，也是最有效的治療方法。經(jīng)基礎(chǔ)治療后6周復(fù)查，所有研究牙位的牙周臨床指數(shù)(PLI、GI、PD、CAL)均較治療前顯著下降，表明牙周臨床癥狀明顯改善。本研究采用CP病人牙周基礎(chǔ)治療前后的牙位作為研究對象，排除了全身免疫因素的影響，同一牙位治療前后齦溝液中IL-17濃度的顯著下降有力的支持了IL-17在牙周組織炎癥中的作用［15］。

本結(jié)果表明:慢性牙周炎病人齦溝液中Th17型細胞因子IL-17、IL-21在炎癥期水平上調(diào)，在治療后隨著牙周臨床指標顯著好轉(zhuǎn)，炎癥明顯消退，濃度水平顯著下降;慢性牙周炎外周血CD4+T細胞中Th17轉(zhuǎn)錄因子RORC在基礎(chǔ)治療后呈現(xiàn)下降趨勢，這與慢性牙周炎病人齦溝液中Th17型細胞因子(IL-17、IL-21)在牙周基礎(chǔ)治療前后的變化相一致。提示Th17型細胞因子具有重要的致炎作用，并參與了慢性牙周炎病變的發(fā)生發(fā)展。

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