新疆伽師瓜采后貯藏中病原菌的篩選與初步鑒定

王堅，單春會，童軍茂，唐鳳仙，謝龍

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，石河子832003）

伽師瓜是新疆特色資源，深受消費者青睞［1］，但致腐病原菌作為影響伽師瓜貯藏品質(zhì)的主要因素正受到人們?nèi)找骊P(guān)注［2］。采后伽師瓜腐爛的主要病原菌的確定可以為采用生物防治及其它方法更有效地抑制新疆伽師瓜的腐敗變質(zhì)，延長伽師瓜的貯藏保鮮期，提高伽師瓜的經(jīng)濟(jì)價值提供參考依據(jù)和理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1原料

伽師瓜采摘于新疆阿勒泰地區(qū)。

1.1.2試劑與儀器

主要試劑：氫氧化鈉（分析純），過氧化氫，乳酸－石碳酸棉藍(lán)染色試劑等。

主要儀器設(shè)備：數(shù)顯不銹鋼電熱培養(yǎng)箱，生化培養(yǎng)箱，顯微鏡，電熱恒溫干燥箱，冰箱，移液器，紫外可見分光光度計，超凈工作臺等。

1.2 方法

1.2.1培養(yǎng)基

采用PDA培養(yǎng)基［3］：馬鈴薯200g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20g，蒸餾水1000mL，自然pH，121℃，滅菌20min。

1.2.2病原菌的分離純化

參照文獻(xiàn)［4］選取。伽師瓜腐爛組織。在無菌條件下，切取約1cm3的腐爛果肉，放入裝有濃度為0.85%的生理鹽水中，于常溫下進(jìn)行搖床處理使微生物細(xì)胞分散均勻。用無菌移液器吸取菌懸液制成10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6、10－7、10－8等一系列樣品稀釋液［5］。

用無菌移液器吸取0.1mL不同稀釋濃度的菌懸液接種在培養(yǎng)基中，每個稀釋度設(shè)3個重復(fù)。待長出菌落后，進(jìn)行劃線分離，直至獲得特性穩(wěn)定的單菌落。根據(jù)形態(tài)進(jìn)行初步分類、編號。

1.2.3主要致病菌的確定

于無菌操作間，將新鮮新疆伽師瓜用打孔器在伽師瓜腰部對稱打出若干小孔。在打孔處分別接入濃度為10－5、10－6、10－7所篩選的病原菌孢子懸浮液。用PE保鮮袋將接病原菌的新疆伽師瓜包裹，并于28℃下恒溫放置，24h后開始觀察結(jié)果。每組設(shè)2個平行，根據(jù)腐爛情況最終確定該菌是否為主要致病菌。

1.2.4主要致病菌的初步鑒定

1.2.4.1 菌落形態(tài)觀察 觀察菌落的形狀、大小、顏色、邊緣、表面結(jié)構(gòu)、透明度等性狀。菌落特征的描述參照《真菌鑒定手冊》［6］。

1.2.4.2 顯微鏡下形態(tài)觀察 霉菌進(jìn)行乳酸－石碳酸染色后進(jìn)行鏡檢。

2 結(jié)果與分析

2.1 致病菌的分離篩選

伽師瓜主要有4種腐爛類型［7］。

分別選取上述4種腐爛類型的新疆伽師瓜，進(jìn)行致病菌的篩選分離、純化，最終得到14株具有不同特征的微生物，符合4種腐爛類型的菌株數(shù)目依次為2、4、2、6株。

2.2 主要致病菌的確定

將篩選所得的14株微生物作為對象菌進(jìn)行致病性檢測，同時以不接菌和無菌水清洗伽師瓜表皮所得到的溶液（簡稱洗瓜原液）作為對照。實驗結(jié)果見表2。

表2 致病性檢測結(jié)果Tab.2 Test results of pathogenesis

根據(jù)觀察結(jié)果（圖1）可以看出：接入P4、P5、P6、P7、P8以及洗瓜原液均能引起伽師瓜的腐爛，其中以接入P7菌腐爛速度最快，腐爛情況最為嚴(yán)重。初步判斷P4、P5、P6、P7、P8有可能是采后引起伽師瓜腐爛的主要致病菌。

與自然狀態(tài)下腐敗伽師瓜表面菌落比較，發(fā)現(xiàn)篩選出的菌種可以使新疆伽師瓜致病致腐，見圖1。

根據(jù)以上實驗結(jié)果，最終確定P4、P5、P6、P7、P8為引起伽師瓜采后腐爛的主要致病菌。

圖1 菌株P(guān)4、P5、P6、P7、P8在瓜體上形態(tài)Fig.1 Forms of Srain P4、P5、P6、P7、P8on melon

2.3 主要致病菌形態(tài)特征

2.3.1菌株P(guān)4的初步鑒定

結(jié)果見圖2。圖2顯示：菌株P(guān)4表面為青色，菌落成片生長，菌落呈粉末狀，無菌絲，有明顯的霉味，28℃培養(yǎng)48h菌落直徑為15.3mm，經(jīng)乳酸－石碳酸染色后經(jīng)過鏡檢發(fā)現(xiàn)，分生孢子梗的頂端并不膨大，有指狀分枝，且有可以再分的分枝，查詢相關(guān)鑒定手冊［7］可知P4為一種擴(kuò)張青霉，屬于曲霉科青霉屬。

圖2 菌種P4菌落形態(tài)（A）和光學(xué)顯微鏡鏡檢圖（B）Fig.2 Colony morphology（A）and Optical microscope diagram （B）of Srain P4

2.3.2 菌株P(guān)5的初步鑒定

結(jié)果見圖3。圖3顯示：菌株P(guān)5從培養(yǎng)基背面觀察中心為粉紅色，菌落呈圓形，菌落表面為絨狀，菌絲緊密隆起，表面有2～3mm長菌絲，菌絲為白色，霉味不明顯，28℃培養(yǎng)48h菌落直徑為21.4 mm，基本不產(chǎn)生分生無孢子，查詢相關(guān)鑒定手冊可知P5屬于毛霉屬。

圖3 菌種P5的菌落形態(tài)正面（A）背面（B）和光學(xué)顯微鏡鏡檢圖（C）Fig.3 Both sides of colony morphology（A，B）and Optical microscope diagram （C）of Srain P5

2.3.3 菌株P(guān)6的初步鑒定

結(jié)果見圖4。圖4顯示：菌株P(guān)6，表面為綠色的顆粒，菌落為青綠色，菌落表面為絨狀，菌絲疏松隆起，霉味不明顯，28℃培養(yǎng)48h菌落直徑為11.3 mm，24h產(chǎn)生大量綠色分生孢子，經(jīng)乳酸－石碳酸染色后經(jīng)過鏡檢發(fā)現(xiàn)，孢子梗頂端膨大成圓形或者是橢圓形，經(jīng)過查詢相關(guān)鑒定手冊可知P6屬于曲霉科曲霉屬。

圖4 菌種P6的菌落形態(tài)（A）及光學(xué)顯微鏡鏡檢圖（B）Fig.4 Colony morphology（A）and optical microscope diagram（B）of Srain P6

2.3.4菌株P(guān)7初步鑒定

結(jié)果見圖5。圖5顯示：菌株P(guān)7菌落呈圓形，黑色的菌落，菌落表面為絨狀，菌絲疏松隆起，有約1mm長菌絲，菌絲為黑色，霉味不明顯，28℃培養(yǎng)48h菌落直徑為10.3mm，24h產(chǎn)生黑色孢子，由形態(tài)將其歸類為曲霉科曲霉屬［9］。

圖5 菌種P7的菌落形態(tài)（A）和光學(xué)顯微鏡鏡檢圖（B）Fig.5 Colony morphology（A）and optical microscope diagram（B）of Srain P7

2.3.5菌株P(guān)8的初步鑒定

結(jié)果見圖6。圖6顯示：P8菌落呈圓形，白色的菌落，菌落表面為絨狀，菌絲緊密隆起，有約3～4 mm長菌絲，菌絲為白色，霉味不明顯，28℃培養(yǎng)48 h菌落直徑為20.6mm，基本不產(chǎn)生分生孢子，孢子囊梗為單生，菌絲發(fā)達(dá)，查詢相關(guān)鑒定手冊可知P8屬于毛霉屬。

圖6 菌種P8的菌落形態(tài)正面（A）背面（B）和光學(xué)顯微鏡鏡檢圖（C）Fig.6 Both sides of colony morphology（A，B）and Optical microscope diagram （C）of Srain P8

3 結(jié)論

對新疆伽師瓜樣品腐敗組織進(jìn)行梯度稀釋后，分離純化，最終確定5株為主要致病菌，分別為P4、P5、P6、P7、P8。經(jīng)乳酸－石碳酸染色后進(jìn)行鏡檢，初步確定P4為擴(kuò)張青霉，屬于曲霉科青霉屬；P5屬于毛霉屬；P6屬于曲霉科曲霉屬；P7為曲霉科曲霉屬；P8屬于毛霉屬。

［1］姜海榮，尹琳琳，陳計巒.新鮮哈密瓜汁中芽胞菌的分離鑒定及超高壓對其致死效應(yīng)研究［J］.石河子大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2010，28（1）：91－95.

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