低溫灌腸制品中苦瓜皂甙抑菌模型的建立

王玉田，張麗艷，張國(guó)瑩

（1.遼寧醫(yī)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧錦州121001；2.本溪市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，遼寧本溪117000）

低溫灌腸制品中苦瓜皂甙抑菌模型的建立

王玉田1，張麗艷2，*，張國(guó)瑩2

（1.遼寧醫(yī)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧錦州121001；2.本溪市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，遼寧本溪117000）

用Gompertz方程對(duì)低溫灌腸制品冷藏期的特定菌生長(zhǎng)曲線進(jìn)行擬合，模擬Ratkowsky方程腐敗菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)溫度模型，建立低溫灌腸制品中苦瓜皂甙抑菌模型，對(duì)苦瓜皂甙抑菌模型進(jìn)行數(shù)學(xué)檢驗(yàn)。結(jié)果表明，修正的Gompertz方程對(duì)接種后低溫灌腸制品中特定菌生長(zhǎng)曲線擬合性較好。通過(guò)苦瓜皂甙抑制模型可得大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和生孢梭菌可耐受的苦瓜皂甙最高濃度分別為212.735、186.103、170.251mg/kg。抑菌模型經(jīng)數(shù)學(xué)檢驗(yàn)證明，模型的適用性、準(zhǔn)確性和擬合性均在可接受的范圍內(nèi)，有應(yīng)用價(jià)值。

苦瓜，皂甙，抑菌模型

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮豬肉（肥瘦比1∶3）、豬小腸衣、乳酸鈉、異抗壞血酸鈉、復(fù)合磷酸鹽、食鹽、淀粉、調(diào)味料 均市售；苦瓜皂甙 本實(shí)驗(yàn)室提供；LB營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基；TYGA液體培養(yǎng)基；菌種：埃希氏大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、生孢梭菌 本實(shí)驗(yàn)室提供。

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；熱空氣消毒箱 北京六一儀器廠；超凈工作臺(tái) 上海智城分析儀器制造有限公司；電熱手提式壓力蒸汽消毒器、電熱恒溫水浴鍋 北京瑞幫興業(yè)科技有公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蒸煮香腸制作 將鮮肉去除污物、筋骨后。肥瘦分開，絞碎（絞肉過(guò)程中加入適量的冰屑以降低溫度），瘦肉加入400mg/kg異抗壞血酸鈉以及3.9%的食鹽，肥膘只添加3.0%的食鹽，置于（2±2）℃的范圍內(nèi)腌制24h。腌制完畢進(jìn)行斬拌，同時(shí)加入輔料及規(guī)定量的苦瓜皂甙，灌制后在恒溫爐（65~70℃）中烘烤50min，放入水浴鍋（95℃）內(nèi)，溫度逐漸降至80~85℃后，加熱50min，出鍋后用白砂糖熏制50min后，用市售保鮮膜包裝，另做一個(gè)不加苦瓜皂甙的空白對(duì)照，一同冷藏保存。

1.2.2 細(xì)菌接種 不同苦瓜皂甙添加量的四組蒸煮香腸（0、30、60、120mg/kg）冷藏前每組分為三份，除對(duì)照外分別接種埃希氏大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和生孢梭菌。細(xì)菌接種均采用針管注射法，參照Fenlon[6]等、Desmarcherlier[7]等和Birzele[8]等的方法。樣品接種量均為1.5×103~1.5×104cfu/g。

1.2.3 細(xì)菌計(jì)數(shù) 在蒸煮香腸冷藏期間，每隔3d隨機(jī)取樣，參照GB/T 4789分別測(cè)定菌落總數(shù)、大腸菌群、金黃色葡萄球菌和生孢梭菌（參照Yetim等[9]和高尚先等[10]的方法）的數(shù)量。

1.2.4 細(xì)菌生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)模型和參數(shù)估計(jì)（一級(jí)模型） 將每隔3d取樣得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，分別用修正的Gompertz方程描述生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)，用非線性最小二乘法進(jìn)行擬合。估計(jì)生長(zhǎng)曲線的最大比生長(zhǎng)率（μmax）和遲滯期（λ）。修正的Gompertz方程如下：

式（1）中：t為時(shí)間（d）；N（t）是t時(shí)的微生物數(shù)量[lg（cfu/g）]；N0是t=0時(shí)的初始微生物量[lg（cfu/g）]；Nmax是增加到穩(wěn)定期時(shí)最大微生物數(shù)量[lg（cfu/g）]；μmax是微生物生長(zhǎng)的生長(zhǎng)率（d-1）；λ是微生物生長(zhǎng)的遲滯期（d）；t是時(shí)間。

1.2.5 苦瓜皂甙抑菌模型的建立（二級(jí)模型） 模擬溫度對(duì)微生物生長(zhǎng)影響的動(dòng)力學(xué)模型Ratkowsky方程，建立苦瓜皂甙抑菌模型，用非線性最小二乘法進(jìn)行擬合。Ratkowsky方程如下：

式（2）、（3）中，N是苦瓜皂甙濃度（mg/kg），Nmax和Nmaxλ是一個(gè)假設(shè)概念，指的是微生物沒(méi)有代謝活動(dòng)時(shí)的苦瓜皂甙濃度，即此時(shí)微生物生長(zhǎng)率為零、遲滯期為無(wú)限長(zhǎng)，b為常數(shù)。

1.2.6 苦瓜皂甙抑菌模型的可靠性評(píng)價(jià) 模型的適用性和可靠性需要經(jīng)過(guò)數(shù)學(xué)評(píng)價(jià)才能推廣到實(shí)際應(yīng)用[11]。將建立的苦瓜皂甙抑菌模型對(duì)目標(biāo)菌生長(zhǎng)參數(shù)（μmax和λ）的預(yù)測(cè)值，與蒸煮香腸中目標(biāo)菌生長(zhǎng)曲線的生長(zhǎng)參數(shù)（μmax和λ）的估計(jì)值進(jìn)行比較，應(yīng)用平方根誤差（RMSE）、Baranyi[11]和Ross[12]等報(bào)道的準(zhǔn)確因子（Af）和偏差因子（Bf），進(jìn)行數(shù)學(xué)檢驗(yàn)，評(píng)價(jià)建立的苦瓜皂甙抑菌模型的可靠性。偏差因子用來(lái)檢驗(yàn)預(yù)測(cè)值的上下波動(dòng)幅度，即偏差度；準(zhǔn)確因子用來(lái)衡量預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值之間的差異，即準(zhǔn)確度。

式（4）~式（6）中，obs為用修正的Gompertz方程擬合蒸煮香腸中特定菌生長(zhǎng)曲線的生長(zhǎng)參數(shù)μmax或λ觀測(cè)值（一級(jí)模型）；pred為用建立的苦瓜皂甙抑菌模型對(duì)μmax或λ的預(yù)測(cè)值（二級(jí)模型）。

2 結(jié)果與討論

2.1 細(xì)菌生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)模型和參數(shù)估計(jì)（一級(jí)模型）

圖1 冷藏期間不同苦瓜皂甙添加量的蒸煮香腸中菌落總數(shù)、大腸菌群、金黃色葡萄球菌和生孢梭菌的數(shù)量變化情況Fig.1 The counts of aerobic bacteria，coliform bacteria，Staphylococcus and C.sporogen-es of cooked sausage with different saponins additions during cold storage

不同苦瓜皂甙添加量的香腸在冷藏期間的菌落總數(shù)、大腸菌群、金黃色葡萄球菌和生孢梭菌數(shù)目（如圖1）?？喙显磉暗囊志饔秒S著添加量的增加而增強(qiáng)，在整個(gè)冷藏期間（0～30d）供試菌的生長(zhǎng)均受到抑制。苦瓜皂甙添加量為120mg/kg的處理組與未添加組之間比較，在30d時(shí)，大腸菌群的菌數(shù)差異顯著（p＜0.05），金黃色葡萄球菌和厭氧菌生孢梭菌菌數(shù)差異極顯著（p＜0.01）。

應(yīng)用修正的Gompertz方程對(duì)蒸煮香腸冷藏期間的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和生孢梭菌生長(zhǎng)曲線進(jìn)行擬合，對(duì)生長(zhǎng)曲線的生長(zhǎng)率（μmax）和遲滯期（λ）進(jìn)行參數(shù)估計(jì)見表1。結(jié)果表明苦瓜皂甙的添加量越大，三種菌的生長(zhǎng)率越低、遲滯期越長(zhǎng)，這與用觀測(cè)值繪制的生長(zhǎng)曲線結(jié)果相同，表明苦瓜皂甙的顯著抑菌作用。同時(shí)，修正的Gompertz方程能夠較好的擬合不同條件下生孢梭菌的生長(zhǎng)狀況，這與Graham等[13]的研究結(jié)果一致。

表1 應(yīng)用Gompertz方程擬合求得的特定菌生長(zhǎng)曲線的生長(zhǎng)參數(shù)Table 1 The parameters growth rate（μmax）and lag time（λ）of coliform bacteria，Staphylococcus and C.sporogenes obtained from modified Gompertz function

2.2 苦瓜皂甙抑菌模型的建立（二級(jí)模型）

應(yīng)用式（4）和（5）擬合苦瓜皂甙抑制大腸菌群、金黃色葡萄球菌和生孢梭菌的二級(jí)模型。結(jié)果見圖2、圖3和圖4。得到苦瓜皂甙抑菌的二級(jí)方程：大腸菌群如式（6）和（7），金黃色葡萄球菌如式（8）和（9），生孢梭菌如式（10）和（11）。

圖2 苦瓜皂甙抑制大腸菌群的二級(jí)模型Fig.2 Secondary model of Coliform bacteria inhibition from Momordica saponins

結(jié)果表明，苦瓜皂甙抑菌模型的擬合性高低順序?yàn)椋航瘘S色葡萄球菌＞大腸菌群＞生孢梭菌。Nmax參數(shù)值指微生物沒(méi)有代謝活動(dòng)時(shí)的苦瓜皂甙的濃度，即在此濃度時(shí)生長(zhǎng)率為零、遲滯期為無(wú)限長(zhǎng)，因此三種菌耐受苦瓜皂甙的最高濃度分別為：大腸菌群是212.735mg/kg；金黃色葡萄球菌是186.103mg/kg；生孢梭菌是195.714mg/kg。

圖3 苦瓜皂甙抑制金黃色葡萄球菌的二級(jí)模型Fig.3 Secondary model of Staphylococcus inhibition from Momordica saponins

圖4 苦瓜皂甙抑制生孢梭菌的二級(jí)模型Fig.4 Secondary model of C.sporogenes inhibition from Momordica saponins

2.3 苦瓜皂甙抑菌模型的可靠性評(píng)價(jià)

2.3.1 驗(yàn)證用蒸煮香腸中特定菌的生長(zhǎng)參數(shù)估計(jì)與預(yù)測(cè) 分別制作三組蒸煮香腸（苦瓜皂甙含量45、75、110mg/kg），其主要原輔料組成與建立抑菌模型的實(shí)驗(yàn)樣品一致，每組分為三份，分別接種埃希氏大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和生孢梭菌。接種生孢梭菌的實(shí)驗(yàn)組需經(jīng)過(guò)真空包裝。細(xì)菌接種均采用針管注射法（同方法1.2.2），相同條件下取樣檢測(cè)菌數(shù)（同方法1.2.3），通過(guò)MicroFit軟件擬合生長(zhǎng)曲線，并對(duì)μmax和λ進(jìn)行參數(shù)估計(jì)，結(jié)果見表2。

表2 應(yīng)用修正的Gompertz方程擬合求得的用于驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)樣品中供試菌的生長(zhǎng)參數(shù)Table 2 The parameters growth rate（μmax）and lag time（λ）of coliform bacteria，Staphylococcus and C.sporogenes obtained from modified Gompertz function

用建立的苦瓜皂甙抑菌模型（二級(jí)模型）對(duì)驗(yàn)證用蒸煮香腸中特定菌生長(zhǎng)參數(shù)μmax和λ進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果如表3所示。驗(yàn)證用蒸煮香腸中，觀測(cè)到的特定菌的生長(zhǎng)率（μmax）比抑菌模型預(yù)測(cè)值低，而觀測(cè)到的特定菌的遲滯期（λ）比抑菌模型預(yù)測(cè)值高，這說(shuō)明建立的抑菌模型屬于Fail-safe類型。如果將建立的預(yù)測(cè)模型應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中，將會(huì)出現(xiàn)“預(yù)測(cè)結(jié)果比實(shí)際情況嚴(yán)重”的現(xiàn)象，大大保證了產(chǎn)品的安全性，這樣的模型可以放心使用。

表3 應(yīng)用建立的苦瓜皂甙抑菌模型對(duì)驗(yàn)證用蒸煮香腸的特定菌生長(zhǎng)參數(shù)預(yù)測(cè)Table 3 Predictions of growth rate（μmax）and lag time（λ）of coliform bacteria，Staphylococcus and C.sporogenes obtained from secondary model Momordica saponins inhibition

2.3.2 苦瓜皂甙抑菌模型數(shù)學(xué)檢驗(yàn) 對(duì)苦瓜皂甙抑菌模型進(jìn)行數(shù)學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果見表4，對(duì)生長(zhǎng)率的預(yù)測(cè)RMSE都低于1.0，而遲滯期的RMSE較高，由此說(shuō)明生長(zhǎng)率的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性高。偏差因子（Bf）檢驗(yàn)結(jié)果表明，三種特定菌的Bf值都在1.0左右，可見苦瓜皂甙抑菌模型屬于可接受類型。準(zhǔn)確性因子（Af）值越大表示平均準(zhǔn)確性越低，而Af值等于1表示預(yù)測(cè)值與觀測(cè)值之間完全吻合。結(jié)果顯示，大腸菌群和金黃色葡萄球菌的Af值較低，而生孢梭菌的Af值相對(duì)較高，表明建立的苦瓜皂甙抑菌大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的模型準(zhǔn)確性較高。本文建立的預(yù)測(cè)模型經(jīng)檢驗(yàn)適用性好，擬合性好。食品處于實(shí)際環(huán)境中其結(jié)構(gòu)在某種程度上對(duì)微生物的生長(zhǎng)行為產(chǎn)生影響，環(huán)境的復(fù)雜性遠(yuǎn)高于實(shí)驗(yàn)條件下的研究，因此抑菌模型計(jì)算出來(lái)的值比實(shí)際食品環(huán)境中偏大。

表4 苦瓜皂甙抑菌模型的數(shù)學(xué)檢驗(yàn)Table 4 Mathematical validations of secondary model Momordica saponins inhibition

3 結(jié)論

苦瓜皂甙作為天然植物防腐劑，對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸菌群和生孢梭菌均有明顯抑制作用。修正的Gompertz方程對(duì)香腸冷藏期間的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和生孢梭菌生長(zhǎng)曲線的擬合性較好。通過(guò)Ratkowsky平方根經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛿M合的抑菌模型得到三種菌耐受苦瓜皂甙的最高濃度為212.735、186.103、170.251mg/kg。對(duì)苦瓜皂甙抑菌模型進(jìn)行數(shù)學(xué)檢驗(yàn)，模型的適用性、準(zhǔn)確性和擬合性均在可接受的范圍內(nèi)，苦瓜皂甙抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的模型準(zhǔn)確性較高。

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Establishment of bacteria inhibition model by saponins in lowtemperature sausage

WANG Yu-tian1，ZHANG Li-yan2，*，ZHANG Guo-ying2
（1.Food Science and Technology College，Liaoning Medical University，Jinzhou 121001，China；2.Product Quality Supervision and Inspection Institution of Benxi，Benxi 117000，China）

The growth curves of certain bacteria were fitted by modified Gompertz，then establishment and validation of bacteria inhibition model from saponins in low-temperature enema products by forecast microbiology.The investigation of establishment and validation of bacteria inhibition model from saponins in low-temperature enema products indicated that the growth curves of coliform bacteria.The highest enduring concentrations of Escherichia coli，Staphylococcus aureus and Clostridium sporogenes to saponins were lower than 212.735，186.103，170.251mg/kg，respectively.The result of evaluation of mathematical parameters indicated that root-mean-squares error（RMSE），bias factor（Bf）and accuracy factor（Af）were within acceptable range and bacteria inhibition model was value for application in low-temperature enema products.

Momordica charantia L；saponins；bacteria inhibition model

TS251.6+5

A

1002-0306（2012）03-0117-04

苦瓜（Momordica Charantia L.）為葫蘆科苦瓜屬植物，性味苦寒，具有清熱解毒、滋養(yǎng)強(qiáng)壯等功效[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明，苦瓜具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒等藥理作用。并且苦瓜皂甙對(duì)高血糖有協(xié)同預(yù)防作用[2]。國(guó)內(nèi)外研究[3-5]已證實(shí)，苦瓜汁具有免疫調(diào)節(jié)、廣譜抗菌作用，苦瓜種仁蛋白和苦瓜皂甙對(duì)啤酒酵母菌、米曲霉菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有明顯抑制作用。為進(jìn)一步開發(fā)利用苦瓜資源，本實(shí)驗(yàn)對(duì)苦瓜皂甙在低溫灌腸制品中的防腐作用做了一些研究并建立抑菌模型，以討論其作為天然防腐劑的前景。

2011－03－14 *通訊聯(lián)系人

王玉田（1953-），男，碩士，教授，研究方向：畜產(chǎn)品質(zhì)量與安全工程。

遼寧省工程中心基金項(xiàng)目（2010402004）。