護色處理對凍藏香蕉片多酚氧化酶活性的影響

莊遠紅，劉靜娜，林嬌芬，莊小河，吳艷輝，黃 捷

（1.漳州師范學院生物科學與技術系，福建漳州363000；2.福建農(nóng)林大學食品科學學院，福建福州350002）

護色處理對凍藏香蕉片多酚氧化酶活性的影響

莊遠紅1，劉靜娜1，林嬌芬1，莊小河2，吳艷輝1，黃 捷1

（1.漳州師范學院生物科學與技術系，福建漳州363000；2.福建農(nóng)林大學食品科學學院，福建福州350002）

通過設計單一護色劑、不同濃度L-半胱氨酸、不同熱處理時間及多因子護色處理四個實驗研究其對凍藏香蕉片多酚氧化酶（PPO）活性的影響，結果表明，5種護色劑均能有效地抑制凍藏香蕉片PPO活性，但L-半胱氨酸對其抑制效果更佳；隨著護色液中Cys濃度的增加，殘余PPO活力呈下降趨勢，表現(xiàn)為CK>0.05%Cys>0.1%Cys>0.2%Cys；熱處理能有效地抑制凍藏香蕉片PPO活性，PPO活性隨著熱處理時間的增加而降低，但熱處理卻大大降低了凍藏香蕉片的品質(zhì)；0.1%L-半胱氨酸、0.05%異抗壞血酸、0.1%蔗糖和0.1%氯化鈣構成的護色劑組合能有效地抑制PPO活性，并起到良好的保質(zhì)增脆效果。

凍藏，香蕉片，酶促褐變，護色，多酚氧化酶

香蕉（Musa nanalour）是世界“四大水果”之一，富含有糖類、果膠、K、Ca、Mg、維生素C、維生素E和β-胡蘿卜素等營養(yǎng)成分以及黃酮類化合物、多酚氧化酶、揮發(fā)油等多種活性成分，具有較高的營養(yǎng)價值和保健作用。但香蕉是一種典型的呼吸躍變型水果，不耐貯藏，極易變質(zhì)，運輸比較困難，稍遇旺產(chǎn)滯銷，損失便十分嚴重，解決這一問題最好辦法就是大力發(fā)展香蕉產(chǎn)后加工。然而，在香蕉加工過程中，褐變一直是制約香蕉加工業(yè)發(fā)展的一個重要因素。前人研究表明，香蕉加工過程中的褐變主要是由多酚氧化酶（Polyphenol Oxidase，PPO）引起的酶促褐變[1]，酶促褐變是香蕉受到損傷時，其組織暴露在空氣中，所含的酚類化合物在PPO的催化條件下進行氧化還原反應而醌式化，再通過一系列的反應而聚合成黑色素[2]，這給香蕉的貯藏與加工帶來十分不利的影響。本文設計單一護色劑、不同濃度L-半胱氨酸、不同熱處理時間及多因子正交護色處理研究凍藏香蕉片的PPO活性，以期為防止香蕉褐變和保鮮提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

香蕉（品種為“天寶香蕉”，福建漳州天寶產(chǎn)） 市售，新鮮、九成熟，果皮金黃、無黑斑，外形飽滿，無機械損傷。

756PC型紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；TGL-20M-B型臺式高速凍藏離心機 湖南賽特湘儀離心機儀器有限公司。

1.2 工藝流程

香蕉→去皮、去絡等→切片（厚度為5～7mm）→浸泡護色（護色劑浸漬3min→85℃熱水浴浸漬）→瀝水→裝袋→冷藏

選用大小、成熟度基本一致，外表無任何缺陷的香蕉果實，去皮及絲絡后用不銹鋼刀縱切成5～7mm厚的香蕉片，在護色液（液料比5∶1）中浸漬3min，瀝水后裝于自封袋中，密封，標記，在-18℃下貯藏。

1.3 實驗設計

本文設以下四個實驗研究護色處理對凍藏香蕉片PPO活性的影響。

1.3.1 單一護色劑對凍藏香蕉片PPO活性的影響 實驗設6個處理，以去離子水為對照，分別配制質(zhì)量分數(shù)均為0.1%的檸檬酸（L0.1）、抗壞血酸（VC0.1）、異抗壞血酸（SVc0.1）、NaHSO3（NaHSO30.1）、L-半胱氨酸（Cys0.1）溶液為護色液。

1.3.2 不同濃度L-半胱氨酸對凍藏香蕉片PPO活性的影響 實驗設4個處理，以去離子水為對照，分別配制濃度為0.05%、0.1%、0.2%的L-半胱氨酸溶液為護色液，用CK、Cys0.05、Cys0.1、Cys0.2表示。

1.3.3 不同熱處理時間對凍藏香蕉片PPO活性的影響 實驗設3個處理，香蕉片經(jīng)0.1%L-半胱氨酸浸漬3min后，分別在85℃熱水中浸泡0、1、2min后，迅速瀝水，于-18℃下貯藏。用Cys0.1∶H0、Cys0.1∶H1、Cys0.1∶H2表示。

1.3.4 多因子護色處理對凍藏香蕉片PPO活性的影響 選取L-半胱氨酸、異抗壞血酸、蔗糖、氯化鈣組成復合護色劑，設置3個濃度水平，采用L9（34）進行正交實驗（如表1），選出最佳護色劑組合。

表1 正交實驗因素水平設計表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

1.4 實驗方法[3]

1.4.1 PPO酶的提取 取樣品3g，加入0.2mol/L pH6.5磷酸鹽緩沖液9mL，快速冰浴勻漿，將勻漿液全部轉入離心管，在0℃，12000r/min下凍藏離心10min，上清液轉入25mL刻度試管，用0.2mol/L pH6.5磷酸鹽緩沖液定容，4℃保存至PPO活性測定。

1.4.2 PPO酶活力測定 在比色杯中迅速加入2.8mL 0.05mol/L兒茶酚（用0.05mol/L pH6.5磷酸鹽緩沖液配制）和0.2mL酶液，搖勻后，以0.05mol/L pH6.5磷酸鹽緩沖液為對照，在420nm波長下比色測定，酶液加入后開始計時，記錄反應5min內(nèi)的吸光值A，每1min

式中：△A420為反應時間內(nèi)吸光度的變化：W為鮮重，g；t為反應時間，min；Vt為提取酶液總體積，mL；VS為測定時取用酶液體積，mL。1.4.3 品質(zhì)測定 VC用2，6-二氯靛酚滴定法[4]；可溶性固形物用折光法[4]；可溶性總糖用苯酚-硫酸法[5]；酸度用酸堿滴定法[4]。記錄一次，酶活性以1min增加吸光值0.01為一個酶活力單位U，計算公式如下：

2 結果與分析

2.1 單一護色劑對凍藏香蕉片PPO活性的影響

經(jīng)單一護色劑浸漬處理后，凍藏香蕉片PPO殘余活力如圖1所示。從圖中可以看出，凍藏香蕉片PPO殘余活力隨酶體系反應時間的延長呈不同程度的下降趨勢，酶體系反應過程中，凍藏香蕉片PPO活性大致趨勢為CK＞NaHSO30.1＞L0.1＞VC0.1＞SVc0.1＞Cys0.1，說明與對照相比，5種護色劑均能有效地抑制凍藏香蕉片PPO活性，從PPO殘余活力值大小來看，Cys對PPO活性抑制效果更佳。

圖1 單一護色劑對凍藏香蕉PPO酶活性的影響Fig.1 Effect of single color-protecting solution on frozen banana PPO enzyme activity

2.2 不同濃度L-半胱氨酸對凍藏香蕉片PPO活性及品質(zhì)的影響

表2 不同濃度L-Cys護色處理后凍藏香蕉片的品質(zhì)狀況Table 2 Quality status of different concentration of L-cysteine on frozen banana slices

由圖2可知，經(jīng)不同濃度的Cys處理后，凍藏香蕉片PPO活性隨酶體系反應時間的延長呈下降趨勢，且變化趨勢逐漸減弱。隨著護色液中Cys濃度的增加，殘余PPO活力逐漸減小，表現(xiàn)為CK＞Cys0.05＞Cys0.1＞Cys0.2，說明Cys濃度越高，越能有效地抑制PPO活性。由表2可以看出，護色處理后VC含量和可溶性固形物兩項指標表現(xiàn)出CK＜Cys0.05＜Cys0.2＜Cys0.1，而CK的可溶性糖含量最大，說明Cys降低了果實的甜度，酸度則表現(xiàn)出Cys0.2≥CK＞Cys0.05＞Cys0.1，雖然Cys降低了果實的甜度，但是從另外3個指標來看，Cys在一定程度上可以提高凍藏香蕉片的品質(zhì)，但并非Cys濃度越高，對提高凍藏香蕉片的品質(zhì)越好。因此，在實際生產(chǎn)應用上必須綜合考慮增大Cys添加量帶來的生產(chǎn)成本提高、產(chǎn)品品質(zhì)下降等因素，所以并不是Cys添加量越多越好。

圖2 不同濃度L-半胱氨酸對凍藏香蕉片PPO活性的影響Fig.2 Effect of different concentration of L-cysteine on frozen banana PPO enzyme activity

2.3 不同熱處理時間對凍藏香蕉片PPO活性及品質(zhì)的影響

表3 不同熱處理時間凍藏香蕉片的品質(zhì)狀況Table 3 Quality status of different heat treatment time on frozen banana slices

圖3 不同熱處理時間對凍藏香蕉PPO酶活性的影響Fig.3 Effect of different heat treatment time on frozen banana PPO enzyme activity

從圖3可以看出，與未經(jīng)熱燙的處理相比，熱處理能有效地抑制凍藏香蕉片PPO活性，其活力大小隨著熱處理時間的增加而降低，表現(xiàn)為Cys0.1∶H0＞Cys0.1∶H1＞Cys0.1∶H2，說明熱處理可以使PPO失活，并且熱燙時間越長，PPO失活越明顯。雖然熱處理可以鈍化PPO活性，但從表3可以看出，熱處理大大降低了凍藏香蕉片的品質(zhì)。VC含量、可溶性固形物、可溶性糖含量、酸度四項指標都表現(xiàn)為Cys0.1∶H2＜Cys0.1∶H1＜Cys0.1∶H0，說明熱處理時間越長，凍藏香蕉片的品質(zhì)越差。

2.4 多因子護色處理對凍藏香蕉片PPO活性的影響

由于半胱氨酸和異抗壞血酸是良好的酶抑制劑，對PPO活性具有較好的抑制作用，并有效地降低香蕉片褐變程度；蔗糖和氯化鈣能有效提高香蕉片的品質(zhì)和風味，而且鈣可同香蕉中的氨基酸結合，生成的不溶性化合物可以控制非酶褐變[6]，因此護色處理中添加氯化鈣在一定程度上可以抑制產(chǎn)品褐變，且氯化鈣可明顯降低果實的膜脂過氧化水平，保持果肉細胞膜的相對穩(wěn)定性，從而減輕腐爛，延長保鮮時間[7]。以控制褐變，保質(zhì)增脆為目的，選取L-半胱氨酸、異抗壞血酸、蔗糖和氯化鈣組成復合護色劑，采用正交實驗對凍藏香蕉片進行護色處理，研究其對PPO活性的影響，PPO活性越低，說明抑制效果越好，酶活性降低越多。由表4中的R值大小及表5方差分析可以看出，L-半胱氨酸對凍藏香蕉片PPO活性具有極顯著影響（F=99.45**），而異抗壞血酸、蔗糖和氯化鈣對凍藏香蕉片PPO活性的影響不明顯，4個因子對凍藏香蕉片PPO活性的影響大小為：L-半胱氨酸（A）＞氯化鈣（D）＞異抗壞血酸（B）＞蔗糖（C）。對因素A，通過比較k1、k2、k3的大小，確定最優(yōu)水平A2，因素B、C、D對實驗結果影響較小，從經(jīng)濟角度考慮選擇B1、C1和D1，故本實驗的最優(yōu)化組合為：A2B1C1D1，即0.1%L-半胱氨酸，0.05%異抗壞血酸，0.1%蔗糖和0.1%氯化鈣。

表4 正交實驗方案與結果Table 4 Results of orthogonal experiments

表5 正交實驗方差分析Table 5 Analysis results of variance

2.5 最優(yōu)組合的品質(zhì)驗證

表6 最優(yōu)化組合與未經(jīng)處理的凍藏香蕉片品質(zhì)對照Table 6 Comparison of optimization combination and untreated freezing-stored banana slice quality

對正交實驗所確定的最優(yōu)組合進行品質(zhì)測定，結果如表6所示，與未護色處理相比，最優(yōu)組合護色處理的凍藏香蕉片VC和可溶性固形物含量均有較大提高，可溶性糖和酸度變化不大，而脆性也有較大提高，這可能是氯化鈣作用的結果。品質(zhì)分析表明，最優(yōu)護色劑組合既能夠保持香蕉片原有的風味和品質(zhì)，并且能起到增加凍藏品脆度的作用。

3 結論與討論

研究表明，L-半胱氨酸對凍藏香蕉片具有很好的抑制效果，這可能是因為L-半胱氨酸是一種具有生理功能的含硫氨基酸，其側鏈上含有一個巰基（-SH）的緣故[8]，而且L-半胱氨酸是組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸之一，是一種高效安全的PPO抑制劑，其在食品保鮮中的應用已有一些研究[9-11]。L-半胱氨酸對PPO活性的抑制作用表現(xiàn)為與酶促褐變反應的中間產(chǎn)物醌生成穩(wěn)定的無色物質(zhì)，抑制了次級氧化和聚合反應，阻止了黑色素的生成[12]。有關半胱氨酸對PPO的抑制作用機理的研究仍存在爭論，目前有以下兩種解釋：第一種是硫醇類化合物可以結合酶活性中心的銅離子從而抑制酶的活力；第二種是硫醇類化合物可以在酶促反應過程中與生成的產(chǎn)物醌發(fā)生快速的非酶催化反應而結合形成一種穩(wěn)定的無色化合物。通常認為起主要作用的是第二種可能[13]。Richard等[14]認為，L-半胱氨酸與酶促反應生成的產(chǎn)物結合生成的無色物質(zhì)是PPO的競爭性抑制劑；Christine等[13]的研究也肯定了L-Cys與酶蛋白發(fā)生結合的可能。

實驗表明，熱處理能夠降低酶活性，處理時間越長，PPO失活越明顯。陳乃富[15]、田金輝[16]研究也得到了相同結果。前人研究表明，PPO屬非耐熱酶，通常在60～70℃下很短時間內(nèi)就會發(fā)生不可逆失活[16]。李勝等[17]研究表明，香蕉醬在80℃加熱10s后，PPO活性損失50%，在90℃下加熱10s后，PPO所?；钚圆坏?%，張勇等[12]采用了沸水浴鈍化處理對香蕉PPO褐變性質(zhì)進行研究，發(fā)現(xiàn)熱處理前5s及10～15s酶鈍化較緩，5～10s較快，15～20s又減緩，過了20s基本沒有PPO。由此可見，不同的熱處理溫度鈍化PPO活性的所需的時間不同，即使是在100℃下也需要一段時間才能將PPO活性完全鈍化。熱處理溫度和熱處理時間的選擇對鈍化PPO活性起著至關重要的作用，本實驗設置85℃熱燙，發(fā)現(xiàn)熱處理時間越長，凍藏香蕉片的品質(zhì)越差。因此，在運用熱處理方法鈍化PPO活性時應根據(jù)保持果品原有風味和品質(zhì)的要求對熱處理溫度和時間進行篩選，使熱處理后的凍藏香蕉片在加工、凍藏及解凍過程的較長一段時間內(nèi)不褐變，并保持理想的產(chǎn)品色澤、外觀和口味。

正交實驗結果表明，半胱氨酸對PPO活性的抑制效果具有極顯著影響，其次是氯化鈣。有研究表明，果實組織中維持較高的鈣水平可以更長保持果實硬度，降低呼吸速率，抑制乙烯產(chǎn)生，促進蛋白質(zhì)合成，減少冷害發(fā)生，從而延長果實貯藏壽命，提高果實商品價值。鈣也影響果實的其他性質(zhì)，如VC含量、香味物質(zhì)的產(chǎn)生等[18]。通過正交實驗最終選取能夠控制凍藏香蕉片褐變，并且能夠保質(zhì)增脆的最優(yōu)化組合為：0.1%L-半胱氨酸，0.05%異抗壞血酸，0.1%蔗糖和0.1%氯化鈣。

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Effect of color retention treatments on the polyphenol oxidase activity in freezing-stored banana slices

ZHUANG Yuan-hong1，LIU Jing-na1，LIN Jiao-fen1，ZHUANG Xiao-he2，WU Yan-hui1，HUANG Jie1
（1.Department of Biology Science and Technology，Zhangzhou Normal University，Zhangzhou 363000，China；2.College of Food Science，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou 350002，China）

Four experiments included different single color-protecting solutions，different concentration of L-cysteine，different heat treatment time and multi-factor color retention treatments were designed to study the polyphenol oxidase（PPO）activity in freezing-stored banana slices.The results showed that five color-protecting solutions could inhibit the activity of PPO effectively in freezing-stored banana slices，and L-cysteine was best of them；the activity of PPO decreased with the concentration of L-cysteine increased，the order was：CK> 0.05%Cys>0.1%Cys>0.2%Cys.Heat treatment could inhibit PPO activity effectively in freezing-stored banana slices，the activity of PPO decreased with the heat treatment time increased，but the heat treatment had greatly reduced the quality of the freezing-stored banana slices.The color-protecting solution compounded with 0.1%L-cysteine，0.05%erythorbic acid，0.1%sucrose and 0.1%calcium chloride could inhibit PPO activity effectively and play an important role in improving quality and increasing brittleness of banana slices.

freezing-stored；banana slices；enzymatic browning；color-protecting；polyphenol oxidase

TS255.1

A

1002-0306（2012）03-0077-04

2010－12－22

莊遠紅（1981-），女，碩士，講師，研究方向：食品加工與質(zhì)量安全。

福建省教學質(zhì)量與教學改革工程項目（閩教高[2011]69號）；漳州師范學院院級教改資助項目（JG200835）。