低值淡水魚蛋白酶法水解工藝研究

李丁寧，劉良忠，劉培勇，劉 亮，王 燕

（武漢工業(yè)學院食品科學與工程學院，湖北武漢430023）

低值淡水魚蛋白酶法水解工藝研究

李丁寧，劉良忠*，劉培勇，劉 亮，王 燕

（武漢工業(yè)學院食品科學與工程學院，湖北武漢430023）

以水解度為指標，考察酶解溫度、pH、底物濃度、加酶量等因素對鰱魚蛋白水解度的影響。在單因素實驗基礎上采用中心復合組合設計實驗對酶解溫度、pH和加酶量進行優(yōu)化，以氨基酸態(tài)氮為指標，確定最佳酶解時間。結(jié)果表明：酶解pH9.37，酶解溫度48.33℃，酶與底物比93.87AU/kg，酶解時間6h，在此條件下水解體系水解度為39.54%，氨基酸態(tài)氮含量為2.31g/L，總氮回收率為93.55%，蛋白質(zhì)濃度為3.62%。

白鰱魚，堿性蛋白酶，水解

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白鰱魚 購于武漢工業(yè)學院常青花園菜市場（粗蛋白18.10%，水分72.3%）；木瓜蛋白酶（Papain）、堿性蛋白酶（Alcalase）、中性蛋白酶（Neutrase）、風味蛋白酶 南寧龐博生物技術(shù)責任有限公司；氫氧化鈉、甲醛 分析純。

DF-1數(shù)顯集熱式磁力攪拌器 常州國華電器有限公司；PHS-25 pH計、722S型可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；TDL-80-2B型離心機 上海滬西分析儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 水解液的制備工藝 原料預處理→原料解凍→加水混勻→調(diào)節(jié)溫度→調(diào)節(jié)pH→加酶→控制適宜的溫度和pH進行水解→滅酶（95℃，15min）→冷卻→離心（3500r/min，15min）→取上清液→濃縮→冷凍干燥→低值淡水魚呈味蛋白粉。

原料預處理：將去鱗、去內(nèi)臟的白鰱魚用清水清洗干凈，放入魚肉5倍重量的脫腥液中脫腥10min，用清水沖洗3遍，瀝干后加入一定比例的水，用攪拌器絞成糜狀（為保證原料的均勻一致及絞碎程度，進行了兩次絞碎處理），分裝后置于-18℃的冰柜凍藏備用。

1.2.2 水解條件的優(yōu)化

1.2.2.1 單因素實驗方法 考察酶解溫度、pH、底物濃度、加酶量等因素對鰱魚魚蛋白水解的影響。

1.2.2.2 中心復合實驗設計 根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，以影響白鰱魚蛋白水解度的pH（X1）、溫度（X2）及酶與底物比（X3，[E]/[S]）為3個實驗因子，以白鰱魚蛋白的水解度（Y）為指標，做三因素中心復合響應面設計，共計23個實驗點，確定白鰱魚蛋白水解的最優(yōu)工藝條件。

表1 白鰱魚蛋白水解三因素二次中心復合設計Table 1 Code of central composite design with 3 factors on enzymatic hydrolysis of silver carp protein

1.2.2.3 單因素實驗方法研究水解時間對水解的影響 根據(jù)水解液中氨基酸態(tài)氮含量、水解度等指標綜合研究適宜水解時間。

1.2.3 測定方法 總蛋白質(zhì)含量：凱氏定氮法；氨基態(tài)氮含量：甲醛滴定法[12]；水解度（DH）的測定[13]：pH-stat法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Minitab軟件進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 酶的篩選 選用四種酶分別為：木瓜蛋白酶（最適pH6、最適溫度55℃、[E]/[S]2%）、堿性蛋白酶（最適pH9、最適溫度50℃、[E]/[S]2%）、中性蛋白酶（最適pH7、最適溫度50℃、[E]/[S]2%）、風味蛋白酶（最適pH7、最適溫度50℃、[E]/[S]2%），按照蛋白酶說明書中推薦的最適條件對白鰱魚進行水解，自反應開始每間隔1h測水解度。不同酶制劑對白鰱魚蛋白水解度的影響見圖1。

圖1 酶的種類對蛋白水解度的影響Fig.1 Effect of the enzyme sorts on the DH of silver carp protein

由圖1可知，四種蛋白酶的水解效果由好到差依次為：堿性蛋白酶＞風味蛋白酶＞中性蛋白酶＞木瓜蛋白酶。其原因可能是由于四種蛋白酶具有不同的純度、活性或底物專一性，因此選用堿性蛋白酶水解較為合適。

2.1.2 底物濃度對堿性蛋白酶水解魚蛋白的影響 在pH為9.0、酶與底物比為24AU/kg、水解溫度為50℃，以魚肉濃度為15%、20%、25%和30%的條件下進行酶解，不斷滴加1mol/L氫氧化鈉使pH保持在9.0，記錄不同時間（15、30、60、90、120、150、180min）堿液的消耗量，根據(jù)pH-stat法計算水解度。

圖2 堿性蛋白酶在不同底物濃度時的水解進程曲線Fig.2 Hydrolysis curves for fish protein with alcalase at different substance concentrations

2.1.3 pH對堿性蛋白酶水解魚蛋白的影響 以魚肉濃度為20%、酶與底物比為24AU/kg、水解溫度為50℃，用1mol/L氫氧化鈉調(diào)pH為8、8.5、9、9.5和10。隨著酶解的進行，不斷滴加1mol/L氫氧化鈉使pH保持在8、8.5、9、9.5和10，記錄不同時間（15、30、60、90、120、150、180min）堿液的消耗量，根據(jù)pH-stat法計算水解度。

圖3 堿性蛋白酶在不同pH時的水解進程曲線Fig.3 Hydrolysis curves for fish protein with alcalase at different pH values

由圖3可知，對環(huán)境pH的敏感是堿性蛋白酶的特點之一[14]。當pH在8～9范圍內(nèi)，隨著pH的增加水解度增加，當pH大于9.5時，隨著pH的增加水解度降低。因此，堿性蛋白酶水解鰱魚蛋白時應控制pH在9左右。

2.1.4 水解溫度對堿性蛋白酶水解魚蛋白的影響 在魚肉濃度為20%、酶與底物比為24AU/kg、pH為9，水解溫度分別為40、45、50、55℃的條件下進行酶解，隨著酶解的進行，pH保持在9，記錄不同時間（15、30、 60、90、120、150、180min）堿液的消耗量，根據(jù)pH-stat法計算水解度。

圖4 堿性蛋白酶在不同溫度時的水解進程曲線Fig.4 Hydrolysis curves for fish protein with alcalase at different temperatures

由圖4可知，酶在一定條件下都有其一定的最適溫度[14]。當溫度在40～50℃范圍內(nèi)，隨著溫度的增加水解度增加，當溫度大于50℃時，隨著溫度的增加水解度降低。因此，堿性蛋白酶水解鰱魚蛋白時應控制溫度在50℃左右。

2.1.5 不同酶與底物比對堿性蛋白酶水解魚蛋白的影響 在魚肉濃度為20%、pH為9、水解溫度為50℃的條件下改變酶的添加量，酶與底物比分別為96、72、48、24、12AU/kg。隨著酶解的進行，pH保持在9，記錄不同時間堿液的消耗量（15、30、60、90、120、150、180min），根據(jù)pH-stat法計算水解度。

圖5 堿性蛋白酶在不同酶與底物比時的水解進程曲線Fig.5 Hydrolysis curves for fish protein with alcalase at different[E]/[S]

酶與底物比能在一定值上下自由變動。在此值以下，有些酶將出現(xiàn)特異性變窄現(xiàn)象，即在很低的酶與底物比時，即使反應在適當?shù)乃舛冉K止，但酶的水解作用并不完全；在此值以上，酶與底物比越高反應速度越快，但酶用量增大引起成本增加，因此應控制酶與底物比在可以接受的時間內(nèi)完成反應[15]。

由圖5可知，隨著酶的濃度的增加，堿性蛋白酶水解魚蛋白的速度升高，但水解度的升高并不與加酶量同倍數(shù)增加。考慮到堿性蛋白酶價格較貴，因此選用的酶與底物比為72AU/kg。

2.2 中心復合設計實驗結(jié)果及其模型分析與檢驗

伊犁河谷向來有塞外江南的美譽，“察布查爾”在錫伯語里譯為糧倉，當?shù)爻霎a(chǎn)的有機大米在全國享譽美名，農(nóng)業(yè)發(fā)展在這個地區(qū)經(jīng)濟發(fā)展中占據(jù)著十分重要的地位。伊犁河南岸的孫扎齊鄉(xiāng)也不例外。

在單因素實驗基礎上，以影響白鰱魚蛋白水解度的pH（X1）、溫度（X2）及酶與底物比（X3）為3個實驗因子，以白鰱魚蛋白的水解度（Y）為指標，做三因素中心復合響應面設計，共計23個實驗點，白鰱魚蛋白的水解度見表2。用Minitab軟件進行實驗數(shù)據(jù)處理，建立水解度Y與調(diào)控因子Xi間的回歸方程式為：

表2 三因素中心復合設計結(jié)果Table 2 Results of central composite design tests with 3 factors

對回歸方程進行方差分析，結(jié)果見表3。F回歸= 166.14＞F0.005（9，22）=4.97，P＜0.005表明模型極顯著，失擬項為0.331＞0.05，表明所建立的回歸方程擬合性很好。

表3 回歸方程的方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

由表4可知，回歸方程及回歸系數(shù)的檢驗結(jié)果表明，在本實驗條件下，主因素對水解度影響大小順序為：X1（pH）＞X3（酶與底物的比）＞X2（酶解溫度）。

表4 各因素的方差分析Table 4 Variance analysis of factors

2.2.1 響應面分析 根據(jù)擬合函數(shù)，用Minitab對每兩個因素對水解度繪制出響應面圖，此時考慮到定性分析各因素對水解度的關(guān)系，固定另外兩個因素時，均做“0”水平處。圖6顯示為pH（X1）和酶解溫度（X2）與白鰱魚蛋白水解度的關(guān)系；圖7顯示為pH（X1）和酶與底物比（X3）與白鰱魚蛋白水解度的關(guān)系；圖8顯示為酶解溫度（X2）和酶與底物比（X3）與白鰱魚蛋白水解度的關(guān)系。

2.2.2 數(shù)學模型分析 從響應面圖分析可知，酶解溫度、pH、酶與底物比對白鰱魚蛋白水解度具有一定的影響，同時它們之間在蛋白水解過程相互作用，采用對擬合數(shù)學模型進行定量分析。

圖6 酶解溫度（X1）與pH（X2）的交互作用Fig.6 The interaction between temperature（X1）and pH（X2）

圖7 pH（X2）和酶與底物比（X3）的交互作用Fig.7 The interaction between pH（X2）and[E]/[S（]X3）

圖8 酶解溫度（X1）和酶與底物比（X3）的交互作用Fig.8 The interaction of temperature（X1）and[E]/[S]（X3）

主因素效應分析：為了分析各主因素對魚鱗膠原蛋白水解度的單獨影響，由模型（1）可通過“降維法”把其他2個因素固定在零水平得3個偏子回歸模型：

對其分別求導，可得

令dyi/dxi=0（i=1，2，3）可求出yi極大值時各種因素單獨最適量：X1=0.5941，X2=0.0431，X3=1.8380。由主效應模型得出各因素不同水平下水解度（見表5）可得：a.隨pH的提升蛋白水解度升高，1水平時增幅最高，隨后增幅度變??；b.隨酶解溫度的提升蛋白水解度增高，到0水平時最高，隨后水解度降低；c.隨酶與底物比的升高蛋白水解度增高，到2水平時達到最高。

因素間交互效應分析。固定該模型任何3因素為0水平時可得另2因素交互效應模型：

表5 各因素效應分析（%）Table 5 Effective analysis of single facto（r%）

由表6知，pH（X1）、溫度（X2）的交互效應為水解度隨pH和溫度都是先增大后減??；通過分析可得，當在pH（X1）、溫度（X2）為（1，0）水平時為兩因素最佳水解度組合。同理可分析其他條件下的水解度。

表6 酶解溫度℃（X1）與pH（X2）交互效應下的水解度（%）Table 6 The interplay of hydrolysis temperature（X1）and the pH（X2）

2.2.3 水解度模型優(yōu)化 根據(jù)建立的數(shù)學模型通過計算機進行模擬實驗，可得到116種水解度理論值分布在0%～35%之間組合方案。其中水解度在0%～20%組合方案沒有；20%～25%組合方案有38套；25%～30%組合方案有39套；30%～35%組合方案有39套。通過計算機模擬尋優(yōu)，在水解度最高的30%～35%組合方案39套中，可得最高水解度為30.13%，對應組合方案為（0.733，-0.333，0.911），真實值是pH9.37，酶解溫度48.33℃，酶與底物的比93.87AU/kg。

2.3 水解時間的確定

經(jīng)過中心組實驗，得到堿性蛋白酶水解鰱魚蛋白最佳工藝參數(shù)：pH9.37、酶解溫度48.33℃、酶與底物的比93.87AU/kg、蛋白質(zhì)濃度3.62%，在此條件下進行酶解，每隔1h測定氨基酸態(tài)氮含量、水解度，實驗結(jié)果如表7。

表7 酶解時間對蛋白水解度的影響Table 7 The effect of hydrolysis time on the DH of fish scale collagen

由表7可知，在前6h內(nèi)，水解體系中的氨基酸態(tài)氮含量、水解度不斷增加，當水解時間為6h時，體系的氨基酸態(tài)氮含量達到了2.31g/L。此后，水解度上升緩慢，氨基酸態(tài)氮的含量不再上升。因此，綜合經(jīng)濟利益，水解白鰱魚蛋白時間應控制在6h左右。

3 結(jié)論

用低值淡水魚制備蛋白水解液的最佳工藝參數(shù)為：酶解pH9.37，酶解溫度48.33℃，酶與底物的比93.87AU/kg、酶解時間6h，在此條件下水解體系水解度為39.54%，氨基酸態(tài)氮含量為2.31g/L，總氮回收率為93.55%，蛋白質(zhì)濃度為3.62%。酶解制得的水解液，經(jīng)濃縮、真空冷凍干燥后制得魚粉，便于魚調(diào)味品的研發(fā)。

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Study on the process of hydrolyzing protein by enzyme in low value freshwater fish

LI Ding-ning，LIU Liang-zhong*，LIU Pei-yong，LIU Liang，WANG Yan
（College of Food Science and Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，China）

As an index to the degree of hydrolysis，the influence of factors such as enzymatic hydrolysis temperature，pH value，substrate concentration，and enzyme dosage to the degree of silver carp protein hydrolysis was investigated.The reaction temperature，pH，and enzyme dosage was optimized by a combination of central composite design experiment based on the single-factor experiment and the best enzymatic hydrolysis time was made as an index to amino nitrogen.The best hydrolysis condition was pH 9.37，enzymatic hydrolysis temperature 48.33℃，[E]/[S]93.87AU/kg，reaction time 6h，under the condition，the protein concentration was 3.62%，the degree of hydrolysis 39.54%，amino acid nitrogen content 2.31g/L，and total nitrogen recovery rate was 93.55%.

silver carp；alcalase；hydrolysis

TS254.1

B

1002-0306（2012）03-0232-05

近年來，我國的漁業(yè)生產(chǎn)發(fā)展很快，尤其是淡水魚生產(chǎn)加工的發(fā)展更為迅速。生產(chǎn)成本低廉、高產(chǎn)的低值淡水魚已占到淡水魚生產(chǎn)總量的50%以上。但是除鮮銷極少量冷凍冷藏制品外，淡水魚深加工產(chǎn)品僅占其總產(chǎn)量的3%左右。因此，通過發(fā)展淡水魚精深加工，實現(xiàn)其二次、三次加工增值，使淡水魚加工向系列化、多樣化和高附加值方向發(fā)展，成為淡水魚加工利用的一個重要研究方向[1-2]。利用酶解的方法水解魚蛋白，將低值淡水魚進行精深加工已成為淡水魚加工利用的一個重要研究方向[3-4]。國內(nèi)外對魚蛋白酶解方面及低值魚類綜合利用做了不少的研究[5-8]。但是利用白鰱魚蛋白水解液開發(fā)魚調(diào)味品的研發(fā)尚處于初級階段[9-11]。實驗以去鱗、去內(nèi)臟、脫腥后的鰱魚為原料，采用堿性蛋白酶水解，確定了酶解的最佳工藝條件，從而為后續(xù)魚調(diào)味品的研發(fā)提供科學依據(jù)。

2011-05-09 *通訊聯(lián)系人

李丁寧（1982-），男，碩士研究生，主要從事食品新資源開發(fā)與利用研究。

湖北省教育廳高校產(chǎn)學研合作資助項目（C2010040）。