貯藏“海沃德”獼猴桃中霉菌的分子鑒定及生物學(xué)特性的研究

段愛(ài)莉，雷玉山，高貴田，*，孫翔宇，梁 俊

(1.陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安710062; 2.陜西伯瑞獼猴桃研究院，陜西西安710062)

貯藏“海沃德”獼猴桃中霉菌的分子鑒定及生物學(xué)特性的研究

段愛(ài)莉1，雷玉山2，高貴田1，*，孫翔宇1，梁 俊1

(1.陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安710062; 2.陜西伯瑞獼猴桃研究院，陜西西安710062)

目的:分離與鑒定陜西省周至縣貯藏期腐爛“海沃德”獼猴桃果實(shí)中的霉菌，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行研究，為今后獼猴桃貯藏保鮮的研究提供理論依據(jù);方法:通過(guò)形態(tài)觀察并結(jié)合分子鑒定，確定獼猴桃病原菌的種類;通過(guò)對(duì)其生長(zhǎng)培養(yǎng)基、光照、溫度、pH、致死溫度和抗紫外能力等生物學(xué)特性研究，分析不同病原菌之間的生物學(xué)特性的差異。結(jié)果:從腐爛獼猴桃中共分離出 5株致病菌，鑒定為:Penicillium sp.CLF－S、Penicillium purpurogenum、Penicillium chrysogenum、Penicillium paneum和Trichoderma longibrachiatum。生物學(xué)特性結(jié)果表明:在豆芽汁培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量最大;連續(xù)光照條件下孢子產(chǎn)量最高，并且在溫度為30℃、pH為6.0～7.0時(shí)為產(chǎn)孢量最佳;致死溫度80℃以上且抗紫外能力在72.73%～92.45%之間。結(jié)論:陜西省周至縣“海沃德”獼猴桃貯藏期致病菌主要為青霉菌屬和木霉菌屬，生長(zhǎng)pH和溫度范圍寬、致死溫度高、抗紫外能力較強(qiáng)。

獼猴桃;海沃德;霉菌;ITS;生物學(xué)特性

獼猴桃屬于獼猴桃科(Actinidiaceae)獼猴桃屬(Actinidia)植物，系呼吸躍變性果實(shí)，且為皮薄多汁的漿果，采后在常溫貯藏下極易軟化腐爛，損失率高。貯藏后期腐爛主要是由霉菌侵染而引起的，是影響獼猴桃果實(shí)生產(chǎn)的重要病害之一［1－2］。王雅等［3］通過(guò)對(duì)微生物的形態(tài)、培養(yǎng)特征及生物學(xué)特性的研究，鑒定出蘋果中的霉菌分別為青霉屬(Penicillium)、黑曲霉屬(Aspergillus)。多種水果病原真菌最初的鑒定分類都是從形態(tài)學(xué)上依據(jù)Rifai和Bissett的分類方法來(lái)進(jìn)行，但隨著生物技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，分子生物學(xué)的鑒定方法被越來(lái)越多地應(yīng)用于真菌的鑒定分類中［4－6］。大多數(shù)水果與蔬菜的致病菌在多種環(huán)境條件下生存能力極強(qiáng)，甚至同種菌的不同菌株在不同環(huán)境下所表現(xiàn)出來(lái)的性狀都存在很大的差異，這主要表現(xiàn)在對(duì)培養(yǎng)基的利用、對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境溫度及光照的適應(yīng)性等方面［7］。因此，致病霉菌的生物學(xué)特性的詳細(xì)研究有其現(xiàn)實(shí)的意義。本文通過(guò)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)對(duì)分離出的治病霉菌進(jìn)行鑒定，同時(shí)進(jìn)行生物學(xué)特性的測(cè)定，為今后研究獼猴桃生物保鮮奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

獼猴桃 陜西省周至縣霉?fàn)€“海沃德”獼猴桃;豆芽 陜西省華潤(rùn)萬(wàn)家超市;馬丁氏培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基PDA、察氏瓊脂培養(yǎng)基CA、蔗糖、葡萄糖 中國(guó)進(jìn)出口商品檢驗(yàn)技術(shù)研究所;真菌DNA提取試劑盒、UNIQ－10柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒、100bp plus DNA ladder buffer、2×Taq PCR Master Mix、MgCl2、ITS1、ITS4 上海生工生物工程有限公司。

超凈工作臺(tái)，數(shù)碼生物顯微鏡下電子顯微鏡，電泳儀，凝膠成像儀，梯度PCR儀(美國(guó)伯樂(lè))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分離與純化

1.2.1.1 富集培養(yǎng) 將獼猴桃腐爛部位用無(wú)菌水清洗干凈，用滅菌后的鑷子，對(duì)于每個(gè)品種，分別取不同腐爛部位各5g，總共25g，置于裝有225mL無(wú)菌水的500mL三角瓶中搖勻，振蕩20min，放于含有鏈霉素的馬鈴薯液體培養(yǎng)基中再振蕩搖勻，然后置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d，再進(jìn)行分離與純化。

1.2.1.2 分離與純化［8－11］稀釋平板法:進(jìn)行10倍梯度稀釋，依次稀釋成10－2、10－3、10－4、10－5、10－6mL稀釋液。在28℃，相對(duì)濕度90%恒溫恒濕下倒置培養(yǎng)，3d后觀察菌株的生長(zhǎng)狀況。劃線分離法:觀察菌落形態(tài)，用無(wú)菌接種環(huán)挑取不同形態(tài)霉菌菌株的孢子，在菌種純化培養(yǎng)基上作平板劃線，培養(yǎng)條件同上。經(jīng)一系列的分離、純化、篩選步驟后得到霉菌，然后在4℃冰箱保存。

1.2.1.3 屬的鑒定 將純化后的菌株再次接種培養(yǎng)3d后，用苯酚乳酸染液染色，然后進(jìn)行鏡檢觀察，結(jié)合菌落形態(tài)特征，依據(jù)鑒定手冊(cè)確定屬。

1.2.1.4 種的鑒定 將所純化的青霉菌和木霉菌點(diǎn)接種到PDA、馬丁氏和察氏培養(yǎng)基，在相同條件下培養(yǎng)，記錄不同菌株在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度、菌落顏色、大小以及質(zhì)地等特征。對(duì)純化培養(yǎng)菌株進(jìn)行產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)的觀察，記錄其主要形態(tài)、分生孢子的大小以及形狀等特征。

1.2.2 霉菌的ITS序列測(cè)定［12－14］

1.2.2.1 總DNA的提取 參照FungalDNAkit真菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明操作。

1.2.2.2 ITS區(qū)擴(kuò)增 引物用真菌通用引物正向引物:

ITS1:5'－TCC GTA GGT GAACCT GCG G－3';

ITS4:5'－TCC TCC GCT TA TTGA TA T GC－3'。

PCR反應(yīng)的總體積為25μL，含有 DNA模板1μg、10μmol·L－1的正向引物和反向引物各1μL，12.5μL的2×Master Mix。

PCR擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性5min，94℃變性50s，50℃退火1min，72℃延伸90s，共34個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，并用UVP凝膠成像分析系統(tǒng)分析擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶。

DNA純化:采用小量DNA快速回收試劑盒法。1.2.2.3 霉菌的ITS序列分析 將純化后的DNA由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，將測(cè)得的 ITS區(qū)序列通過(guò)國(guó)際連接直接載入 GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)進(jìn)行同源性搜索，與已報(bào)道真菌菌株的ITS區(qū)序列進(jìn)行同源性比較。

1.2.3 霉菌的生物學(xué)特性的測(cè)定

1.2.3.1 不同培養(yǎng)基對(duì)病原菌產(chǎn)孢量的影響 將PDA培養(yǎng)基、豆芽汁蔗糖培養(yǎng)基、豆芽汁葡萄糖培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基分別調(diào)節(jié)pH=7.0，然后制好平板，將5mm滅菌濾紙片蘸取一定濃度的孢子懸浮液接于平板上，在28℃恒溫條件下黑暗中培養(yǎng)，培養(yǎng)7d后用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定孢子產(chǎn)生數(shù)量。

1.2.3.2 不同光照處理對(duì)病原菌產(chǎn)孢量的影響 分別設(shè)置24h連續(xù)光照、24h連續(xù)黑暗、光照/黑暗各12h交替3個(gè)處理。其中培養(yǎng)基為PDA(pH=7.0)、培養(yǎng)溫度為28℃、培養(yǎng)時(shí)間為7d。

1.2.3.3 不同培養(yǎng)溫度對(duì)病原菌產(chǎn)孢量的影響 分別設(shè)置0、15、20、25、30、35、40℃7個(gè)處理，其中培養(yǎng)基為PDA(pH=7.0)、黑暗中培養(yǎng)、培養(yǎng)時(shí)間為7d。

1.2.3.4 不同pH對(duì)病原菌產(chǎn)孢量的影響 將PDA培養(yǎng)基滅菌后，無(wú)菌條件下用1mol/L的 HCl和1mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0。然后在培養(yǎng)溫度為28℃恒溫條件下黑暗中培養(yǎng)7d。

1.2.3.5 分生孢子致死溫度的測(cè)定 分別設(shè)置40、45、50、55、60、65、70、75、80、85℃恒溫水浴鍋中處理20min，后迅速冷卻，之后用移液槍移取200μL到PDA培養(yǎng)基(pH=7.0)上，然后在培養(yǎng)溫度為28℃恒溫條件下黑暗中培養(yǎng)7d。

1.2.3.6 抗紫外線能力的測(cè)定 分別設(shè)置在紫外線(15W，燈管與培養(yǎng)皿間距52cm)下照射1、3、5、7、9min，以不處理作為對(duì)照，然后在培養(yǎng)溫度為28℃恒溫條件下黑暗中培養(yǎng)7d。計(jì)算致死率。

致死率(%)=(對(duì)照單菌落個(gè)數(shù)－處理單菌落個(gè)數(shù))/對(duì)照單菌落個(gè)數(shù)×100%

2 結(jié)果與討論

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

2.1.1 青霉屬的鑒定 青霉菌在28℃、黑暗條件下，PDA培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)局限，菌落為深綠色，質(zhì)地細(xì)膩，中央稍凸起菌落，邊緣為白色、稠密，背面為黃綠色，見(jiàn)圖1－a。在察氏培養(yǎng)基上菌落顏色為乳白色，質(zhì)地細(xì)膩，中央稍凸起有灰色斑點(diǎn)，菌落邊緣為白色或者綠色，背面無(wú)色，見(jiàn)圖1－b。在查氏培養(yǎng)基上在數(shù)碼顯微鏡下觀察到的帚狀枝對(duì)稱或者不對(duì)稱、緊密，有兩輪分枝，分生孢子呈卵形、橢圓形或近球形，光滑，呈綠色見(jiàn)圖1－c。

2.1.2 木霉屬的鑒定 菌株在PDA培養(yǎng)基平板上，28℃、黑暗條件下菌落生長(zhǎng)速度很快，顏色為深綠色，氣生菌絲體絨狀至粉狀，菌絲為白色，隨著菌落的不斷擴(kuò)大，從中心開(kāi)始出現(xiàn)輪狀的產(chǎn)孢區(qū)，并逐漸向外擴(kuò)展;孢子顏色也由白變綠，呈粉末狀，整個(gè)菌落整齊而扁平。培養(yǎng)7d后，菌落老熟，正面變?yōu)榘稻G色，背面無(wú)色稀疏(圖2－a)。在查氏培養(yǎng)基上菌落顏色為綠色，在培養(yǎng)皿中分布疏散，背面無(wú)色(圖2－b)。在數(shù)碼顯微鏡下觀察到的樹枝狀，疏散，分生孢子呈卵形、橢圓形或近球形，光滑，呈綠色。在PDA培養(yǎng)基和查氏培養(yǎng)基上菌落形態(tài)和顯微鏡下的圖片見(jiàn)圖2。

表1 五種病原菌在不同培養(yǎng)基上生長(zhǎng)特性Table 1 Growth characteristicsofive pathogens in different medium

圖1 青霉菌的形態(tài)特征Fig.1 Morphology of Penicillium

圖2 木霉菌的形態(tài)特征Fig.2 Morphology of Trichoderma

2.2 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

2.2.1 菌株ITS PCR電泳結(jié)果 將5株霉菌基因組DNA稀釋做模板，用引物ITS1和ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到霉菌的ITS1－5.8S rDNA－ITS4片段，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。測(cè)序表明:該霉菌的ITSDNA序列長(zhǎng)度大小為500～750bp。

2.2.2 ITS區(qū)序列測(cè)定 測(cè)定基因序列結(jié)果顯示，序列長(zhǎng)度為579～608bp不等，序列中包含部分18S rRNA、ITS1、5.8S rRNA、ITS2及部份28S rRNA，在GenBank中比對(duì)結(jié)果表明相似度在99%～100%，從而鑒定出這5株致病菌為:Penicillium sp.CLF－S、Penicillium purpurogenum、Penicillium chrysogenum、Penicillium paneum 和 Trichoderma longibrachiatum。并且在 GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄號(hào)分別為: AB505424.1、GU566251.1、AY373902.1、AB479335.1、EU401572.1。

2.3 生物學(xué)特性測(cè)定結(jié)果

2.3.1 不同培養(yǎng)基對(duì)病原菌產(chǎn)孢量的影響 如表1所示，在豆芽汁培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)量較大，菌落最厚，其次為PDA培養(yǎng)基，在察氏培養(yǎng)基上生長(zhǎng)量最小。產(chǎn)孢情況:Penicillium purpurogenum、Penicillium chrysogenum和Penicillium paneum三株青霉菌在豆芽汁葡萄糖培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量最大，察氏培養(yǎng)基產(chǎn)孢量明顯最小;Penicillium sp.CLF－S菌株在PDA培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量最大，察氏培養(yǎng)基產(chǎn)孢量明顯最小; Trichoderma longibrachiatum菌株在豆芽汁蔗糖培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量最大，察氏培養(yǎng)基產(chǎn)孢量明顯最小。菌落顏色:四株青霉菌在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)顏色為灰綠色或黃綠色，在察氏培養(yǎng)基上基本為乳白色或白綠色，而在豆芽汁葡萄糖和豆芽汁蔗糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)顏色為深綠色或黃綠色;木霉菌株在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)顏色為白綠色，在察氏培養(yǎng)基上基本為綠色，而在豆芽汁葡萄糖和豆芽汁蔗糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)顏色為深綠色。

2.3.2 不同光照處理對(duì)病原菌產(chǎn)孢量的影響 如圖3所示，光照、黑暗及光暗交替對(duì)五種菌產(chǎn)孢量有明顯影響，其中光照處理產(chǎn)孢量顯著高于其他兩者(P≤0.05)。

表2 孢子致死溫度的測(cè)定Table 2 Determination of spore lethal temperature

圖3 光照處理對(duì)產(chǎn)孢的影響Fig.3 Effect of illumination on the spore number

2.3.3 不同培養(yǎng)溫度對(duì)病原菌產(chǎn)孢量的影響 如圖4所示，木霉在15～40℃之間均能產(chǎn)孢，但在25～35℃之間產(chǎn)孢量較高。其中30℃產(chǎn)孢量最多，明顯高于20℃時(shí)的產(chǎn)孢量。其它四株青霉菌也在25～35℃產(chǎn)孢量較高，但產(chǎn)孢量明顯低于木霉菌。

圖4 培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)孢量的影響Fig.4 Effect of incubation temperature on the Spore number

2.3.4 不同pH對(duì)病原菌產(chǎn)孢量的影響 如圖5所示，五種霉變微生物都有其相適應(yīng)的生長(zhǎng)pH范圍，并且對(duì)pH的適應(yīng)范圍都比較廣，在pH 2～8范圍內(nèi)均可產(chǎn)孢值，在pH為6～7時(shí)產(chǎn)孢量為最佳，pH＜2及pH＞8時(shí)菌株產(chǎn)孢量明顯下降，且各pH間沒(méi)有明顯差異。

2.3.5 五種病原菌分生孢子致死溫度的測(cè)定 如表2所示，五種病原菌的致死溫度較高，其中Penicillium sp.CLF－S、Penicillium purpurogenum、Penicillium chrysogenum 致 死 溫 度 為 80℃，時(shí) 間 20min; Penicillium paneum和 Trichoderma longibrachiatum致死溫度為 85℃，時(shí)間 20min，這表明 Penicillium paneum和Trichoderma longibrachiatum最耐熱。

2.3.6 抗紫外線能力的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6，從圖6中可知，對(duì)5株菌株分別進(jìn)行1、3、5、7、9min的紫外線輻照處理，不同霉菌致病菌之間的抗紫外能力存在一定的差異。相同時(shí)間的紫外輻照條件下，五種霉菌孢子致死率差異顯著。隨著紫外輻照時(shí)間的延長(zhǎng)，不同病原菌株的致死率逐漸增加，當(dāng)增加到一定程度，病原菌必將完全死亡。其中 Penicillium purpurogenum紫外能力最弱，輻照9min時(shí)致死率為92.45%，而Penicillium chrysogenum抗紫外能力最強(qiáng)，輻照9min的致死率為72.73%。因紫外燈的功率和照射距離固定，所以其殺菌效果只與照射時(shí)間的長(zhǎng)短有關(guān)，呈線性相關(guān)，即照射時(shí)間越長(zhǎng)，其照射范圍內(nèi)霉菌細(xì)胞所接受的輻射劑量越高，殺菌率也越高。

圖5 pH對(duì)產(chǎn)孢量的影響Fig.5 Effect of pH on the spore number

圖6 紫外線照射時(shí)間對(duì)致死率的影響Fig.6 Effect of UV irradiation time on death rate

3 結(jié)論

本研究從腐爛的“海沃德”獼猴桃中分離得到5株致病菌，通過(guò)形態(tài)鑒定確定該5株菌株為木霉屬和青霉屬，并結(jié)合分子生物學(xué)鑒定，確定為: Penicillium sp.CLF－S、Penicillium purpurogenum、Penicillium chrysogenum、Penicillium paneum 和Trichoderma longibrachiatum。然后對(duì)其生長(zhǎng)培養(yǎng)基、光照、溫度、pH、致死溫度和抗紫外能力等生物學(xué)特性進(jìn)行研究，為今后進(jìn)一步研究獼猴桃貯藏生物防治提供依據(jù)。從生物學(xué)特性測(cè)定結(jié)果可以看出，適于菌株產(chǎn)孢的條件范圍較寬，這與已報(bào)道的霉菌特點(diǎn)一致［15－17］。5株菌株在多種培養(yǎng)基上都能正常生長(zhǎng)并產(chǎn)孢，這與報(bào)道的其它青霉與木霉菌相似?？梢?jiàn)光和近紫外光照射可以促進(jìn)很多真菌的孢子產(chǎn)生，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明持續(xù)光照處理時(shí)，5株菌株的孢子產(chǎn)生數(shù)量比黑暗處理明顯高。溫度生長(zhǎng)適應(yīng)范圍較寬，在40℃的較高溫度下也能保持一定的生長(zhǎng)存活能力，且能夠產(chǎn)生少量的分生孢子，這說(shuō)明這5株致病菌有很強(qiáng)的適應(yīng)性。菌株在30℃時(shí)有較大產(chǎn)孢量，而與已報(bào)道的多數(shù)菌株在30℃時(shí)生長(zhǎng)最快、產(chǎn)孢量高相一致［18－20］。而致死溫度也有所差異，其中Penicillium sp.CLF－S、Penicillium purpurogenum 和Penicillium chrysogenum的致死溫度為80℃，與已報(bào)道的產(chǎn)黃青霉致死溫度低相一致。而 Penicillium paneum和 Trichoderma longibrachiatum致死溫度為85℃，這表明 Penicillium paneum 和 Trichoderma longibrachiatum最耐熱。相同時(shí)間的紫外輻照條件下，五種致病菌的致死率差異顯著。隨著紫外輻照時(shí)間的延長(zhǎng)，不同病原菌株的致死率逐漸增加，當(dāng)增加到一定程度，病原菌必將完全死亡。其中產(chǎn)紫青霉抗紫外能力最弱，輻照9min的致死率為92.45%，而長(zhǎng)枝木霉抗紫外能力最強(qiáng)，輻照9min時(shí)致死率高達(dá)72.73%。結(jié)論表明這5株致病菌之間的生物學(xué)特性相比較存在一定差異，因此有必要進(jìn)一步對(duì)其生防效果與作用機(jī)理進(jìn)行研究，為更好研究提高獼猴桃貯藏期提供理論依據(jù)。

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Molecular identification and biological characteristics of mould in storage of“Haiwode”kiwi fruit

DUAN Ai－li1，LEI Yu－shan2，GAO Gui－tian1，*，SUN Xiang－yu1，LIANG Jun1
(1.College of Food Engineering and Nutritional Science，Shannxi Normal University，Xi’an 710062，China; 2.Shaanxi Bairui Kiwi Research Institue Co.，Ltd.，Xi’an 710062，China)

Objective:The mould from storage of“Haiwode”kiwi fruit of Zhouzhi country in Shannxi province were isolated and identified，so as to provide a theoretical basis of fresh kiwi fruit for future research.Method:With the molecular identification and morphological characteristic，the species of pathogens were distinguished.By means of the biological characteristics，the differences of pathogens were analysised.Results:Five strains were identified，such as Penicillium sp.CLF－S，Penicillium purpurogenum，Penicillium chrysogenum，Penicillium paneum and Trichoderma longibrachiatum.The biological characteristics of mould were screened and investigated.Bean sprouts medium was the most favorable medium for the spore.It could produced high spore for the continuous light conditions and 30℃，optimal pH 6.0～7.0.The lethal temperature was 80℃and UV capability was from 72.73%to 92. 45%.Conclusion:The mould from storage of“Haiwode”kiwi fruit of Zhouzhi country in Shannxi province were Penicillium and Trichoderma.While the results revealed that the pH and temperature for spore production ranged，the lethal temperature was high，and the UV resistance ability was strength.

kiwi fruit;Haiwode;mould;ITS;biological characteristics

TS255.3

A

1002－0306(2012)10－0321－05

2011－07－13 *通訊聯(lián)系人

段愛(ài)莉(1986－)，女，在讀研究生，研究方向:食品生物技術(shù)、食品安全。

陜西省“13115”科技創(chuàng)新工程重大科技專項(xiàng)(2009ZDKG－05);獼猴桃質(zhì)量安全技術(shù)研究與示范(771845);陜西師范大學(xué)自然科學(xué)基金優(yōu)秀項(xiàng)目(995828)。