SIVmac239感染恒河猴急性期回腸派氏淋巴結(jié)中淋巴細(xì)胞亞群的變化

劉克劍，叢喆，吳芳新，王衛(wèi)，熊競(jìng)，魏強(qiáng)，秦川

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，北京100021)

SIVmac239感染恒河猴急性期回腸派氏淋巴結(jié)中淋巴細(xì)胞亞群的變化

劉克劍，叢喆，吳芳新，王衛(wèi)，熊競(jìng)，魏強(qiáng)，秦川

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，北京100021)

目的分析SIVmac239感染早期中國(guó)恒河猴回腸派氏淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞數(shù)量及亞群的變化，探討這些變化與疾病進(jìn)展的可能關(guān)系。方法以靜脈注射SIVmac239制備恒河猴AIDS模型，對(duì)回腸派氏淋巴結(jié)進(jìn)行CD4和CD8免疫組化標(biāo)記，分離Peyer’s集合淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞，分別標(biāo)記CD3、CD4、CD8、CD28、CD95單克隆抗體，以流式細(xì)胞儀檢測(cè)T細(xì)胞及其亞群的表達(dá)情況。結(jié)果SIVmac239感染急性期中國(guó)恒河猴Peyer淋巴結(jié)中CD4+/CD8 +比值持續(xù)下降，記憶性細(xì)胞比例升高，但Peyer淋巴結(jié)形態(tài)及CD4+T細(xì)胞數(shù)量未見(jiàn)明顯變化，CD8+T細(xì)胞從第5天開(kāi)始持續(xù)升高。結(jié)論SIVmac239感染急性期，中國(guó)恒河猴回腸派氏淋巴結(jié)形態(tài)及CD4+T細(xì)胞數(shù)量基本維持，向記憶性細(xì)胞的轉(zhuǎn)化增加，但是CD4+/CD8+比值下降。

AIDS;派氏淋巴結(jié);T淋巴細(xì)胞;恒河猴

在我們長(zhǎng)期進(jìn)行的靈長(zhǎng)類艾滋病動(dòng)物模型研究中發(fā)現(xiàn)，不同動(dòng)物疾病進(jìn)程表現(xiàn)不十分一致，除了個(gè)體遺傳差異等因素影響，也可能與病毒早期和機(jī)體相互作用相關(guān)，因此，了解腸道粘膜組織在AIDS發(fā)病過(guò)程中的重要作用對(duì)疾病的發(fā)生、發(fā)展至關(guān)重要。

腸道粘膜組織的免疫系統(tǒng)主要由兩部分構(gòu)成，分別是免疫誘導(dǎo)部位，主要是有結(jié)構(gòu)的淋巴組織，如派氏淋巴結(jié)(peyer’s patch，PP)和免疫效應(yīng)部位，主要是分布在粘膜固有層中彌散的淋巴組織。目前AIDS研究中關(guān)于粘膜部分主要集中在固有層，而派氏淋巴結(jié)的資料相對(duì)較少，缺乏系統(tǒng)性研究。據(jù)文獻(xiàn)推測(cè)艾滋病病毒的宿主侵入、早期控制、疾病轉(zhuǎn)歸等與PP直接相關(guān)。基于此，本文對(duì)SIVmac239感染早期的中國(guó)恒河猴回腸腸道PP中免疫細(xì)胞數(shù)量及分群的變化做初步研究，分析可能的對(duì)疾病進(jìn)程的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與模型制備

健康恒河猴9只，購(gòu)自北京協(xié)爾鑫生物資源研究所(合格證編號(hào):SCXK(京)2005－2005)，實(shí)驗(yàn)前體重為3～5 kg，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在本所P3實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行［SYXK(京)2009－0003］;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)IFA法檢查排除猴免疫缺陷病毒(SIV)、猴逆轉(zhuǎn)錄D型病毒(SRV－1)和猴T淋巴細(xì)胞性I型病毒(STLV－1)的感染。其中猴489、3－2、3－3、3－4、3－5靜脈感染1000 TCID501mL SIVmac239，其余4只作為正常對(duì)照，定期采樣，測(cè)定血漿病毒載量及細(xì)胞變化。

1.2 樣品采集

1．2．1 外周血分別于感染前及感染后第0，7，14，28天采集實(shí)驗(yàn)猴EDTA抗凝血，測(cè)定血漿病毒載量、血常規(guī)及流式檢測(cè)［1］。

1．2．2 腸道組織采集及病理制片分別于第0，1，3，5，7，14天剖腹手術(shù)截取10 cm回腸腸段(0 d取4只動(dòng)物，其余時(shí)間點(diǎn)一只)，分離PP淋巴細(xì)胞，其余經(jīng)4%中性甲醛固定24 h，修塊，4%福爾馬林再固定24 h，包埋、切片。

1．2．3 PP淋巴細(xì)胞分離腸段縱向剖開(kāi)，解剖鏡下用眼科剪剪下派氏淋巴結(jié)［2］，置于預(yù)冷的含5%胎牛血清的PRMI－1640(R－5)培養(yǎng)基中。剪碎，用冷的PBS(不含鈣鎂離子)沖洗兩次。研磨，70 μm孔徑細(xì)胞篩過(guò)濾(BD，Cat#352350)。4℃2000 rpm離心10 min，重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106cell/mL。

1.3 免疫組化

組織切片用抗CD4、CD8抗體進(jìn)行標(biāo)記。具體步驟如下:PBS沖洗，2 min×3次。滴加一抗，37℃孵育2 h，PBS沖洗，2 min×3次。滴加試劑1(中杉金橋，PV－9000)，37℃孵育20 min，PBS沖洗，2 min ×3次。滴加試劑2(中杉金橋，PV－9000)，37℃孵育20 min，PBS沖洗，2 min×3次。DAB溶液顯色。自來(lái)水充分沖洗、復(fù)染、脫水、透明、封片，鏡下觀察，計(jì)數(shù)(每個(gè)樣本取3個(gè)高倍視野，計(jì)算平均值)。

1.4 流式檢測(cè)

取細(xì)胞懸液100 μL，置于流式管中，標(biāo)記抗CD3、CD4、CD8、CD28，CD95抗體，室溫避光作用15 min。用10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基洗2次，懸浮于500 μL的pH7．2 PBS中，BD FACA－CANTO FACS儀上分類計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 SIVmac239感染猴血漿病毒載量結(jié)果

血漿病毒載量結(jié)果顯示，全部攻毒的動(dòng)物在攻毒后第7天可檢測(cè)出血漿病毒載量，載量峰值位于1×105到1×107copies/mL之間，表明這些動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行中的28 d內(nèi)被病毒感染并且病毒能進(jìn)行有效復(fù)制。

圖1 SIVmac239感染猴血漿病毒載量結(jié)果Fig．1The changes of viral loads in plasma of SIVmac239－inoculated rhesus monkeys

2.2 SIVmac239感染猴腸道PP淋巴結(jié)CD4+T淋巴細(xì)胞免疫組化結(jié)果

0 d結(jié)果顯示，健康中國(guó)恒河猴派氏淋巴結(jié)濾泡中心發(fā)育完好，CD4+細(xì)胞主要分布于淋巴鞘，在濾泡中心也有零星分布，大小正常，形態(tài)完整;感染猴在SIVmac239感染后1，3，5 d派氏淋巴結(jié)與正常恒河猴派氏淋巴結(jié)一樣T細(xì)胞分布于淋巴鞘，形態(tài)完整，CD4+T淋巴細(xì)胞在局部細(xì)胞密度與正常對(duì)照組未見(jiàn)明顯區(qū)別(彩插5圖2 A，C)。7，14 d派氏淋巴結(jié)中心區(qū)域淋巴細(xì)胞有所增加，CD4+T淋巴細(xì)胞在局部細(xì)胞密度有所增大(彩插5圖2 A，C)。CD8+細(xì)胞主要分布于淋巴鞘，在濾泡中心也有零星分布，大小正常，形態(tài)完整;數(shù)目隨時(shí)間增加而增多(彩插5圖2 D)。

2.3 SIVmac239感染猴腸道PP淋巴結(jié)CD4+/ CD8+T細(xì)胞比值的變化

在SIVmac239感染后，免疫組化計(jì)數(shù)結(jié)果:動(dòng)物的PP CD4+/CD8+T細(xì)胞比值減少。由感染前的0．90左右降到感染后5 d的0．55，第7天為的0．39，第14天為0．37(彩插5圖2 A)。流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果:動(dòng)物的PP CD4+/CD8+T細(xì)胞比值減少。由感染前的1．00左右降到感染后5 d的0．25，僅為正常值的25%，第7天為正常值的40%，第14天僅為正常值的3%(彩插5圖2 B)。

2.4 SIVmac239感染猴回腸派氏淋巴結(jié)中記憶性T細(xì)胞的變化

恒河猴感染SIVmac239早期PP淋巴結(jié)中Naive CD4+T細(xì)胞所占的比例隨著時(shí)間有所增加，從正常的27%升至第14天的85．5%。同時(shí)伴隨著TCM的持續(xù)下降，從正常恒河猴的71．5%下降至第5天的53．1%，第14天時(shí)更是降至9．5%。

圖3 SIVmac239感染后急性期不同天數(shù)回腸內(nèi)PP CD4+/CD+8比值

圖4 SIVmac239感染急性期恒河猴回腸PP，CD4+/CD8+T Na?ve與記憶性CD4+/CD8+T比例的變化Fig．4The changes of Na?ve，Tcm，Tem，CD4+/CD8+T cells in PP of Chinese－origin rhesus monkeys infected intravenously with SIVmac239

與此相反，正常猴回腸PP淋巴結(jié)中TEM僅占1%左右，感染后略有增加，在5 d、7 d達(dá)到峰值，約為30%到40%，到第14天時(shí)則重新下降至2．3%。

Naive CD8+T比例第3天下降至正常值(22．2%)的一半左右，之后持續(xù)下降，一致維持至14 d均無(wú)明顯變化;TcM與Naive情況相似，感染后3 d即從正常的27．3%降到2．0%，持續(xù)到14 d; TEMCD8+T細(xì)胞在7 d內(nèi)比例逐漸升高(43%－97%)，到14 d一直維持在較高水平。

3 討論

消化道是HIV及其相關(guān)病毒的侵犯目標(biāo)，HIV在消化道粘膜中攻擊目標(biāo)主要是CD4+T淋巴細(xì)胞，在整個(gè)感染過(guò)程中起著重要作用，與外周血液相比，一般認(rèn)為在感染過(guò)程中，粘膜CD4+T淋巴細(xì)胞的損耗出現(xiàn)得更早、更劇烈，腸道中最豐富的CD4 +T淋巴細(xì)胞存在于腸道固有層并且多處于激活狀態(tài)，所以感染及消耗的細(xì)胞也主要在固有層。固有層之外，腸道內(nèi)的效應(yīng)部位，PP由于其結(jié)構(gòu)與功能均與固有層有所不同，所以派氏淋巴結(jié)內(nèi)的CD4 +T細(xì)胞在感染初期的表型與形態(tài)與固有層也是否有所區(qū)別，為本文關(guān)注內(nèi)容之一。

PP是沿小腸縱向分布，位于粘膜下層，肉眼可見(jiàn)的微小的集合淋巴組織［3］。在一般情況下，PP集中于小腸末端部分(特別是回腸)，PP由上皮下圓頂區(qū)、濾泡區(qū)和濾泡旁區(qū)組成。T細(xì)胞位于濾泡旁區(qū)，主要為CD4+T和CD8+T細(xì)胞，表達(dá)T細(xì)胞受體，其中有中心記憶性和初始T淋巴細(xì)胞［4，5］。

在免疫反應(yīng)中，首先，初始T細(xì)胞進(jìn)入PP，成為記憶/效應(yīng)性T細(xì)胞后，從PP粘膜通過(guò)傳出淋巴結(jié)和外周血移植向效應(yīng)部位［6］。HIV優(yōu)先感染激活的CD4+T細(xì)胞，根據(jù)效應(yīng)部位與誘導(dǎo)部位的差異，在感染早期，粘膜CD4+T細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p耗，但本文對(duì)感染早期PP的免疫組化及流式檢測(cè)表明，PP中CD4+T細(xì)胞的減少及破壞在SIVmac239感染的14 d內(nèi)程度是很輕微的，如圖2所示。雖然流式結(jié)果顯示在感染早期PP CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值有所下降，這提示了在CD4+數(shù)目沒(méi)有明顯降低的情況下，CD8+T細(xì)胞的數(shù)目增多，針對(duì)PP CD8+細(xì)胞的免疫組化結(jié)果支持這一推斷，如圖3。所以CD4+T細(xì)胞的穩(wěn)定與CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值的下降不矛盾。某些研究發(fā)現(xiàn)，HIV感染晚期在派氏淋巴結(jié)中有與其他淋巴組織類似的T細(xì)胞變化，主要是CD4+T細(xì)胞數(shù)目的減少。結(jié)合感染初期PP中CD4+T淋巴細(xì)胞相對(duì)完好的狀況，如果能有效減緩PP中CD4+T細(xì)胞的損耗將有助于延緩AIDS的進(jìn)程。

HIV－1感染后的T細(xì)胞免疫應(yīng)答在感染早期，至少在感染之后的10 d內(nèi)，機(jī)體外周血中檢測(cè)不到明顯的T細(xì)胞應(yīng)答，病毒在這段時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增，在不同的靶細(xì)胞中潛伏，為病毒的長(zhǎng)期持續(xù)性感染奠定了基礎(chǔ)。感染10 d后(2～3周)，隨著病毒的進(jìn)一步擴(kuò)增，產(chǎn)生大量的T細(xì)胞免疫反應(yīng)，病毒載量隨著CD8+T細(xì)胞免疫反應(yīng)的出現(xiàn)與升高開(kāi)始下降，并逐步到達(dá)一個(gè)穩(wěn)定點(diǎn)(set point)。與此相似，來(lái)自恒河猴外周血的數(shù)據(jù)也表明，針對(duì)SIV的外周血特異性T細(xì)胞應(yīng)答主要發(fā)生于感染14天以后［7］。但在SIVmac239感染早期的恒河猴回腸PP中，7 d之內(nèi)既能檢測(cè)到活躍的細(xì)胞免疫應(yīng)答，表現(xiàn)為效應(yīng)記憶性CD4+T和CD8+T淋巴細(xì)胞比例的逐步升高，說(shuō)明在感染很早期病毒復(fù)制活躍的部分(比如腸道粘膜)已經(jīng)有活躍的免疫應(yīng)答，血液中檢測(cè)結(jié)果的延遲說(shuō)明血液可能并不是了解病毒感染早期機(jī)體生物事件的有效窗口。目前有關(guān)于粘膜的研究，比如對(duì)粘膜固有層的研究表明，固有層含有各種表型的T細(xì)胞，包括大量的CD4+T細(xì)胞，在正常的人類及非人靈長(zhǎng)類當(dāng)中，固有層CD4+ T細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞的比率與外周血及淋巴結(jié)相似，但粘膜中表達(dá)CCR5的CD4+T細(xì)胞比例更大，擁有記憶表型并表達(dá)細(xì)胞激活的標(biāo)志物，并且大部分CD4+T細(xì)胞也在原位產(chǎn)生細(xì)胞因子，提示這些細(xì)胞是激活的并最終分化的細(xì)胞，也是HIV/SIV感染的極好靶標(biāo)。所以在固有層，感染3～4 d后即可檢出大量的受感染細(xì)胞，并且SIV感染猴的粘膜效應(yīng)位點(diǎn)CD4+T細(xì)胞劇烈而迅速的損耗［3］。作為目前研究AIDS最實(shí)用的模型，SIV感染恒河猴腸道組織中早期T細(xì)胞免疫反應(yīng)的變化為研究HIV感染者疾病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律提供了線索。

而同樣作為粘膜免疫系統(tǒng)的構(gòu)成部分，免疫誘導(dǎo)部位的PP，其CD4+T細(xì)胞數(shù)目變化與固有層相比卻在急性期未見(jiàn)明顯變化。而在免疫表型方面，由于HIV－1可優(yōu)先感染HIV－1特異性CD4+T細(xì)胞，隨著病情的進(jìn)展，HIV－1特異性CD4+T細(xì)胞會(huì)逐漸減少乃至完全耗竭。HIV－1特異性CD4+T細(xì)胞的主要功能在于維護(hù)HIV－1特異性CD8+T細(xì)胞的功能上，而不是在直接抗擊HIV－1中。既往的研究也表明，CD4+T細(xì)胞在CD8+T細(xì)胞免疫反應(yīng)的激活，記憶性CD8+T細(xì)胞的維持以及CD8 +T細(xì)胞的功能成熟等過(guò)程中起重要的作用。相應(yīng)地，HIV－1感染所導(dǎo)致CD4+T細(xì)胞的耗竭，可導(dǎo)致HIV特異性的記憶CD8+T細(xì)胞的成熟障礙以及HIV－1特異性CD8+T細(xì)胞的功能受損［8－9］。如圖3所示，效應(yīng)記憶性CD8+T細(xì)胞在感染14d后在PP中比例的下降與效應(yīng)記憶性CD4+T細(xì)胞的下降趨勢(shì)相同，且效應(yīng)記憶性CD4+T細(xì)胞下降比例更為明顯，從側(cè)面證明，在感染早期的PP效應(yīng)記憶性CD4+T細(xì)胞的丟失可能是導(dǎo)致效應(yīng)記憶性CD8+T細(xì)胞比例下降的原因。

綜上所述，關(guān)于SIV感染急性期不同時(shí)間PP淋巴細(xì)胞的變化，目前尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究中正常對(duì)照組中國(guó)恒河猴PP中CD4/CD8細(xì)胞約等于1。與正常對(duì)照組相比，SIVmac239感染的中國(guó)恒河猴PP中CD4/CD8+T細(xì)胞比值顯著降低，但同時(shí)PP中CD4+T細(xì)胞的數(shù)量及形態(tài)幾乎沒(méi)有變化，而同時(shí)期其它研究表明固有層中的CD4+數(shù)量急劇下降且大量凋亡及壞死，說(shuō)明在感染急性期PP中的CD4+可能得到循環(huán)血中T細(xì)胞的補(bǔ)充，從而維持其形態(tài)及功能。因此PP中CD4+T細(xì)胞數(shù)量和功能在感染早期對(duì)維持粘膜局部的免疫功能發(fā)揮影響。SIVmac239感染急性期PP中CD4+T細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)的維持，以及向記憶性表型的轉(zhuǎn)化提示，PP在感染早期對(duì)補(bǔ)充因感染損失的淋巴細(xì)胞起重要作用，同時(shí)，對(duì)病毒及機(jī)體相互作用后最終造成不同感染程度可能產(chǎn)生一定影響。

［1］叢喆，李兆忠，魏強(qiáng)等．SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量RTPCR測(cè)定猴免疫缺陷病毒(SIV)RNA拷貝數(shù)方法的建立［J］．中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，－2006，14(4):271－275．

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The Changes of Lymphocytes from Ileum Peyers Pacth from Rhesus Monkeys at the Earliest Period with SIVmac239 Infection

LIU Ke－jian，CONG Zhe，WU Fang－xin，WANG Wei，XIONG Jing，WEI Qiang，QIN Chuan
(Key Laboratory of Human Diseases Comparative Medicine，Ministry of Health;Institute of Medical Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences;Key Laboratory of Human Diseases Animal Models，State Administration of Traditional Chinese medicine，Beijing 100021，China)

ObjectiveTo analyze the changes of lymphocytes from ileum Peyers pacth from Chinese rhesus monkeys at acute period with SIVmac239 infection．Methods9 rhesus monkeys were used and 5 were infected with SIVmac239 via intravenous injection．The tissues or lymphocytes from ileum Peyers pacth lymph nodes from rhesus monkeys at acute period were collected and analyszed with CD4+，CD8 immunohistochemistry and flow cytometry T－cell subsets labeling with CD3，CD4，CD8，CD28，CD95 monoclonal antibodies respectively．ResultsObviously declined CD4+/CD8+ratio and increased memory cells(CD4+＆CD8+)ratio and CD8+T cells were detected in Peyers lymph nodes，but CD4 counts had no significant change in Peyers lymph nodes．ConclusionDeclined CD4+/CD8+ ratio and increased memory cells(CD4+＆CD8+)ratio were found in Peyers lymph nodes from rhesus macaques at acute period with SIVmac239 infection，however，the meaning and possible affection to disease need further study．

AIDS;Peyer’s Patch;T cell;Reshus monkeys

R373．33R332

A

1671－7856(2012)06－0025－05

10．3969/j．issn．1671－7856．2012．06．007

2010－08－20

“十二五”國(guó)家科技重大專項(xiàng)課題(2012ZX10004－501);協(xié)和青年基金(SIV感染早期粘膜屏障結(jié)構(gòu)的改變)。

劉克劍，男，博士生，從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病毒學(xué)研究工作。

秦川，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向:重大傳染病發(fā)病機(jī)制。E－mail:qinchuan@pumc．edu．cn。

魏強(qiáng)，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向:艾滋病模型及應(yīng)用。E－mail:weiqiang@cnilas．pumc．edu．cn。