人腫瘤干細(xì)胞異種移植模型進(jìn)展

余 飛，丁利軍

（南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院，南京 210008）

自從腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells，CSCs）是腫瘤發(fā)生與發(fā)展之源這一觀點(diǎn)被提出，人們對(duì)腫瘤有了更加深刻的認(rèn)識(shí)。建立篩查腫瘤干細(xì)胞的臨床方法以及尋找以腫瘤干細(xì)胞為靶點(diǎn)的新藥成為腫瘤研究的新熱點(diǎn)。但是，目前鑒別和評(píng)價(jià)腫瘤干細(xì)胞特性的唯一工具是CSCs異種移植至免疫缺陷小鼠后的成瘤模型［1］。完善CSCs異種移植小鼠模型并利用這一模型篩選新的 CSCs是藥物篩查的前提，其需要考慮移植免疫和微環(huán)境等相關(guān)問題。本文就人CSCs異種移植模型的新進(jìn)展及面臨的問題等作簡(jiǎn)要綜述。

1 腫瘤干細(xì)胞概念

早在19世紀(jì)，研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)腫瘤具有明確的組織學(xué)異質(zhì)性。1937年，F(xiàn)urth和 Kahn［2］的實(shí)驗(yàn)證實(shí)來自小鼠腫瘤的單個(gè)細(xì)胞可以在受體鼠體內(nèi)誘發(fā)形成新的腫瘤。在白血病和實(shí)體瘤的研究中也發(fā)現(xiàn)能夠誘發(fā)形成腫瘤的細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞中比率很低，僅103～107的腫瘤誘發(fā)細(xì)胞即可在受體鼠內(nèi)形成新的繼代腫瘤［3-5］。

隨后Pierce［6］的研究證實(shí)惡性畸胎瘤中含有高致瘤性細(xì)胞，這些高致瘤性細(xì)胞作為單個(gè)細(xì)胞可以分化成多個(gè)不同類型的非致瘤性細(xì)胞。在此之前，Leblond等［7-8］已結(jié)合放射自顯影技術(shù)，完成了組織內(nèi)的細(xì)胞增殖、存活期和細(xì)胞構(gòu)成檢測(cè)。1971年P(guān)ierce［9］在鼠鱗狀細(xì)胞癌研究中采用這種方法獲得重要發(fā)現(xiàn)：早期，放射性標(biāo)記幾乎全部出現(xiàn)在未分化區(qū)域；隨后，這些標(biāo)記出現(xiàn)在分化良好區(qū)域。這證實(shí)未分化的細(xì)胞經(jīng)過衍生形成不同的分化細(xì)胞。與未分化的高致瘤性細(xì)胞不同，分化的細(xì)胞移植到合適的宿主體內(nèi)并未形成腫瘤。通過上述實(shí)驗(yàn)，Pierce［10］提出了腫瘤干細(xì)胞概念：“基于發(fā)育生物學(xué)和腫瘤學(xué)規(guī)律的腫瘤概念，其本質(zhì)是組織自我更新的紊亂，它由在正常穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境下具有顯著增殖能力和有限分化能力的腫瘤干細(xì)胞以及分化的腫瘤細(xì)胞后代組成?！?/p>

CSCs概念的核心是腫瘤中并非所有的細(xì)胞都是均等的。它假定腫瘤生長(zhǎng)與正常增生組織如骨髓、皮膚或腸上皮的生長(zhǎng)類似，是通過能夠自我更新、數(shù)量有限的專一干細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)的。一個(gè)腫瘤主要由快速增殖的腫瘤干細(xì)胞以及干細(xì)胞有絲分裂、分化衍生的細(xì)胞構(gòu)成。分化細(xì)胞沒有自我更新能力，對(duì)腫瘤的長(zhǎng)期維持作用可以忽略。CSCs具有正常干細(xì)胞的特征：可以自我更新，一生維持，抵御放射和化學(xué)損傷，能夠長(zhǎng)時(shí)期休眠或是遷移至身體其他部位［11］。

2 腫瘤干細(xì)胞與腫瘤治療

由于腫瘤具有難以根治及復(fù)發(fā)率高等特點(diǎn)，CSCs概念自提出以來，作為抗癌戰(zhàn)略的新靶點(diǎn)受到關(guān)注。腫瘤細(xì)胞株的皮下移植幾十年來被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞毒素和抗增殖藥物以及復(fù)方藥物的臨床前篩選。盡管在腫瘤靶向藥物開發(fā)及靶向藥物載體研究方面取得許多進(jìn)展，但經(jīng)典化療藥物在愈后不復(fù)發(fā)方面的效果有限以及能夠揭示自發(fā)腫瘤進(jìn)展的細(xì)胞株不足這些都限制了腫瘤治療的進(jìn)展。腫瘤干細(xì)胞概念的出現(xiàn)是一種新的模式，它為藥物發(fā)現(xiàn)和臨床前篩查提供了新的思路［12］。

與普通腫瘤細(xì)胞相比，CSCs表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞毒性藥物［13-15］和輻射［16］有更高的抗性。經(jīng)典的抗癌治療方法是通過優(yōu)先殺死更多的分化細(xì)胞而暫留CSCs來誘發(fā)腫瘤的快速萎縮。然而少數(shù)CSCs的存活隨后就會(huì)導(dǎo)致后續(xù)的腫瘤再生和疾病復(fù)發(fā)。Gleev ec等人臨床實(shí)驗(yàn)的成功給腫瘤-特異性通路靶向治療提供了一個(gè)有力的證據(jù)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了幾種新靶向因子。CSCs的存活、自我更新和/或分化的靶向作用提示了實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)效根除腫瘤所需的策略。近來許多學(xué)者正在開展識(shí)別CSCs并以其作為靶向目標(biāo)的研究［17，18］。此外，已證明靶向因子治療癌癥患者的療效與因子本身靶向腫瘤干細(xì)胞的能力密切相關(guān)［19］。同時(shí)，CSCs具有模仿腫瘤體內(nèi)發(fā)育的獨(dú)特能力，與腫瘤細(xì)胞株相比它是更好的臨床腫瘤模型。

3 人腫瘤干細(xì)胞異種移植模型

CSCs可以誘發(fā)體內(nèi)腫瘤，這些體內(nèi)瘤包括了原發(fā)腫瘤所有分化的細(xì)胞群，它們可以被連續(xù)移植且不損耗致瘤潛力，即 CSCs具有自我更新的潛能。目前，潛在CSCs群的篩選依賴于其在免疫缺陷動(dòng)物體內(nèi)啟動(dòng)腫瘤的能力。如人急性髓性白血病（AML）CSCs的首個(gè)證據(jù)是通過重度聯(lián)合免疫缺陷（SCID）鼠的移植實(shí)驗(yàn)獲得的，其證實(shí)白血病是通過CD34+細(xì)胞而不是CD34-細(xì)胞傳遞給模型鼠的［20］。后續(xù)研究證實(shí)移植 CD34+的白血病細(xì)胞可以導(dǎo)致非肥胖糖尿病重度聯(lián)合免疫缺陷鼠（NOD-SCID）產(chǎn)生一系列不同分化級(jí)別的白血病細(xì)胞［21］。

實(shí)體瘤CSCs的研究由于技術(shù)原因相對(duì)滯后，主要是由于組織解離困難，膜標(biāo)記物缺乏難以分離細(xì)胞核心亞群。近年來，研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌 CSCs是CD44+CD24-的核心細(xì)胞亞群，它們能夠誘發(fā)腫瘤，這些腫瘤在組織學(xué)上與乳腺脂肪墊移植患者相似［22］，而膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的 CSCs能夠在顱內(nèi)注射后誘發(fā)腫瘤，它們表達(dá)CD133［23］。現(xiàn)在通過異種移植已經(jīng)在幾種人實(shí)體瘤內(nèi)發(fā)現(xiàn)了CSCs。人的CSC群如前列腺癌［24］，結(jié)腸癌［25］，腦癌［26］，胰腺癌［27］，肺癌［13］，卵巢癌［28］，膀胱癌［29］等均通過異種移植獲得。結(jié)腸癌 CSCs的鑒定是借助于腎被膜下移植CD133+細(xì)胞實(shí)驗(yàn)完成的［30］，移植效率約比皮下移植的效率高10倍［25］。Morrison等［31，32］研究表明已分選出的一系列標(biāo)記陽(yáng)性和特定標(biāo)記陰性的 CSC可以穩(wěn)定的復(fù)制最初的標(biāo)記表達(dá)模式，即這些標(biāo)記可以在腫瘤干細(xì)胞中穩(wěn)定傳遞。其研究說明，現(xiàn)有的CSC標(biāo)記（表1）是顯著特異的，且異質(zhì)性表達(dá)的流式細(xì)胞技術(shù)（FACS）標(biāo)記，可用于分選標(biāo)記陽(yáng)性和標(biāo)記陰性細(xì)胞群體。

表1 常見CSCs鑒定的表面標(biāo)記Tab.1 Surface markers of the CSCs

CSCs在異種移植模型中顯示了它們獨(dú)特的成瘤能力，并且這些腫瘤和患者體內(nèi)的腫瘤類似。例如結(jié)腸CSCs經(jīng)皮下移植后顯示有腺體的組成，具有伊紅染色陽(yáng)性的散在細(xì)胞，這些細(xì)胞同樣可以分泌粘液［25］。腦CSCs移植后產(chǎn)生了具有扁平上皮特性的移植物，包括發(fā)育成熟的角蛋白-生成細(xì)胞［26］。CSCs異種移植模型的建立利于理解特定腫瘤干細(xì)胞的特性及制訂靶向腫瘤干細(xì)胞的治療策略。

4 異種移植模型建立的影響因素

作為判定人CSCs的金標(biāo)準(zhǔn)，分選的腫瘤干細(xì)胞異種移植到免疫缺陷鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，除了操作引起的細(xì)胞應(yīng)激之外，還有一系列因素制約異種移植模型的成功建立，下面在分析腫瘤干細(xì)胞異種移植模型制作程序的基礎(chǔ)上（圖1），詳述相關(guān)因素。

移植部位CSCs的高可塑性，決定了異種移植后成瘤特性因移植部位的變化而變化。同位和異位移植后CSCs成瘤情況的比較觀察較少。其中卵巢CSCs皮下移植和腹腔移植所產(chǎn)生的腫瘤沒有顯示出明顯的組織學(xué)差異，CSCs腹腔移植后仍產(chǎn)生血性腹水，并經(jīng)腹膜轉(zhuǎn)移至其它器官［28］。結(jié)腸 CSCs注射到結(jié)腸壁的同位移植與異位移植比較，生長(zhǎng)的腫瘤組織學(xué)分析未顯示明顯差異。結(jié)腸移植物快速（約3周）引起肝轉(zhuǎn)移，這是皮下注射結(jié)腸CSCs后未觀察到的現(xiàn)象［25］。前列腺CSCs同位移植后觀察到轉(zhuǎn)移至包括脾、肺和肝等器官，但異位移植后未能觀察到此現(xiàn)象［24］。這些觀察說明CSCs同位移植和異位移植最重要的區(qū)別就是CSCs同位移植具有更好的復(fù)制轉(zhuǎn)移過程的能力。若研究CSCs和癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移啟動(dòng)之間的關(guān)系，必須考慮移植CSCs的部位［36］。不同于卵巢和結(jié)腸腫瘤干細(xì)胞，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中異位移植物具有移植位點(diǎn)依賴的成瘤性差異：CSCs皮下移植引起類似柵欄結(jié)構(gòu)的高度血管化瘤以及組織壞死；顱內(nèi)注射膠質(zhì)母細(xì)胞瘤CSCs后顯示出其擴(kuò)散和滲入腦周組織的能力［37］。通過對(duì)皮下移植物中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤 CSCs的進(jìn)一步鑒定，發(fā)現(xiàn)來源于不同患者的CSC群中部分產(chǎn)生含有軟骨和成骨細(xì)胞的混合性肉瘤［38］。這種間質(zhì)分化潛能僅在基質(zhì)微環(huán)境中顯現(xiàn)，而從未在顱內(nèi)移植中發(fā)現(xiàn)。

圖1 人腫瘤干細(xì)胞異種移植模型程序Fig.1 The operation procedure of human cancer stem cells xenograftmodel

微環(huán)境 微環(huán)境信號(hào)制約人CSCs的發(fā)生和發(fā)展。對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎干細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞在調(diào)節(jié)干細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化方面具有關(guān)鍵作用：從一定比例病人的良性病變區(qū)分離得到的ALDH+細(xì)胞經(jīng)繼代皮下移植至鼠體內(nèi)后漸漸發(fā)展成腺癌； ALDH+細(xì)胞與來自結(jié)腸癌組織的人成纖維細(xì)胞共移植明顯提高腫瘤生長(zhǎng)速率?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)這種過程至少部分是通過IL-6和IL-8介導(dǎo)的，證實(shí)在從潰瘍性結(jié)腸炎向結(jié)腸癌轉(zhuǎn)化過程中炎癥的作用［39］。含有輻照和未輻照的乳腺成纖維細(xì)胞混合物的原位“人化”鼠模型可用來反映清除乳腺脂肪墊的NOD SCID鼠允許正常乳腺干細(xì)胞發(fā)育為完全分化的乳腺組織，ALDH1為正常干細(xì)胞和乳腺癌干細(xì)胞的常用標(biāo)記，可對(duì)患者臨床結(jié)局進(jìn)行預(yù)測(cè)［40］并發(fā)現(xiàn)與CSCs自我更新相關(guān)的 Hedgehog信號(hào)通路［41］。通過抑制repertaxin，IL-8受體CXCR1靶向CSCs可以降低腫瘤生長(zhǎng)和體內(nèi)轉(zhuǎn)移速率［42］?？偠灾@些研究強(qiáng)調(diào)了微環(huán)境因素對(duì)CSCs移植模型的影響。因此在試驗(yàn)規(guī)劃及結(jié)果評(píng)估中必須考慮鼠類模型無法完全復(fù)制特異物種可溶解的、膜結(jié)合的特異細(xì)胞因子對(duì)CSCs生存的影響。

移植動(dòng)物品系由于不同程度的免疫活性殘留，免疫缺陷鼠不同品系的選擇在某些情況下影響CSCs的評(píng)估。在NOD SCID IL2Rγnull鼠中黑素瘤干細(xì)胞的增長(zhǎng)速率比NOD SCID鼠提高104倍［31］。AML的移植實(shí)驗(yàn)顯示 SCID鼠中白血病-誘發(fā)細(xì)胞CD34+/CD38-群體的頻率約為 1：2.5×105，在NOD SCID中提高10～100倍［21］。研究發(fā)現(xiàn)10只PU.1-/-AML（轉(zhuǎn)錄因子 PU.1-/-急性髓細(xì)胞性白血?。┦蟮腃SCs就足夠用于移植白血病至同類動(dòng)物［43］。在小鼠黑色素瘤細(xì)胞中，CD34+p75-和CD34-p75-細(xì)胞群?jiǎn)?dòng)腫瘤至受體鼠，但僅有后者產(chǎn)生了異種移植物，CD34+p75-細(xì)胞進(jìn)行自我更新但無分化。p75+細(xì)胞群很少表現(xiàn)出啟動(dòng)腫瘤能力［44］。因此，在不同的腫瘤中，腫瘤啟動(dòng)細(xì)胞的特性和頻率差異很大。

雖然異種移植至免疫缺陷鼠是CSCs研究的最基本方法，但系統(tǒng)相關(guān)問題需要仔細(xì)評(píng)估以正確的詮釋CSCs的成瘤特性。種屬特異的微環(huán)境因素和不同小鼠品系的免疫缺陷差異直接影響移植實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

5 異種移植模型存在的問題

腫瘤干細(xì)胞分選后，異種移植到免疫缺陷鼠體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果受到實(shí)驗(yàn)操作的影響。移植干細(xì)胞在與原發(fā)腫瘤龕明顯不同的環(huán)境中發(fā)展，要在鼠組織形成克隆，必須具備強(qiáng)大的能力，但是沒有一個(gè)直接的證據(jù)來證明異種移植后的細(xì)胞行為確實(shí)反映了原發(fā)腫瘤內(nèi)同一細(xì)胞的分級(jí)狀態(tài)［11］。除了實(shí)驗(yàn)操作誘發(fā)的細(xì)胞應(yīng)激之外，還有兩個(gè)實(shí)驗(yàn)限制對(duì)于異種移植來說是固有的：物種障礙和移植程序。

物種障礙可能會(huì)阻礙某些重要的龕的功能如粘附分子或生長(zhǎng)因子與其受體間的相互作用。如通過轉(zhuǎn)鐵蛋白-轉(zhuǎn)鐵蛋白受體系統(tǒng)進(jìn)行必要的鐵的傳遞，在跨越鼠-人物種屏障時(shí)效率僅為1％［45］。當(dāng)通過移植鼠腫瘤細(xì)胞至完全組織相容的鼠體內(nèi)克服物種障礙時(shí)，移植物成瘤效率會(huì)得到顯著提高［46-48］。小鼠白血?。?7-49］，小鼠乳腺癌［50-52］和小鼠扁平細(xì)胞［53］的腫瘤干細(xì)胞往往可以比人腫瘤干細(xì)胞較好的優(yōu)先植入?，F(xiàn)在的研究發(fā)現(xiàn)，可以通過提供人生長(zhǎng)因子［54］或人間質(zhì)元件［55］進(jìn)行代償，或者是通過原位移植而不是皮下或腎被膜［56］移植來緩解。

Morrison等［57］指出：干細(xì)胞的移植可以顯示干細(xì)胞在特定實(shí)驗(yàn)條件下的潛力，但不能揭示移植細(xì)胞在其原有組織或腫瘤內(nèi)的命運(yùn)。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細(xì)胞移植后行為發(fā)生很大改變［58］。

現(xiàn)在還沒有直接的證據(jù)證明未經(jīng)處理的實(shí)體瘤含有CSCs。因涉及到人暴露在射線下，臨床不允許使用放射性標(biāo)記技術(shù)在骨髓或白血病內(nèi)示蹤原始腫瘤干細(xì)胞或祖細(xì)胞。為了完善異種移植實(shí)驗(yàn)，必須能夠顯示出原發(fā)腫瘤內(nèi) CSCs功能性的存在，這依賴找到單一、確定的 CSCs標(biāo)記基因。在這些標(biāo)記的基礎(chǔ)上，可以發(fā)展基因敲入小鼠模型或病毒標(biāo)記策略進(jìn)行遺傳譜系追蹤。目前，人 CSCs的原位鑒定還是空白。

總之，來自腫瘤細(xì)胞的CSCs作為干細(xì)胞可以在體外生長(zhǎng)，而且保持在體內(nèi)產(chǎn)生異種腫瘤的能力。結(jié)腸癌和肺癌的CSCs在培養(yǎng)一年多后在異位移植后重現(xiàn)腫瘤特性［13，25］，且蛋白質(zhì)組學(xué)特性保持不變。因此特定腫瘤干細(xì)胞異種移植模型建立需要在改善腫瘤干細(xì)胞移植程序、優(yōu)化腫瘤干細(xì)胞異種移植微環(huán)境以及克服物種障礙等方面進(jìn)行深入而系統(tǒng)的研究，從而為研究腫瘤發(fā)生與發(fā)展、篩選靶向腫瘤干細(xì)胞的新藥提供有力的工具，也為臨床腫瘤治療提供新的線索與路徑。

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