外源激素對圓葉牽牛毛狀根生長及次生代謝產(chǎn)物積累的影響

徐大衛(wèi)，王倩倩，王鵬飛，楊世海*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林 長春 130118；2.中國藥科大學(xué)，江蘇 南京 210009)

外源激素對圓葉牽牛毛狀根生長及次生代謝產(chǎn)物積累的影響

徐大衛(wèi)1，王倩倩1，王鵬飛2，楊世海1*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林 長春 130118；2.中國藥科大學(xué)，江蘇 南京 210009)

目的探討不同外源激素對圓葉牽牛毛狀根生長及次生代謝產(chǎn)物咖啡酸、咖啡酸乙酯含量的影響。方法利用增殖倍數(shù)法及高效液相色譜法測定毛狀根的生長及其咖啡酸、咖啡酸乙酯的含量，從而明確各外源激素對圓葉牽牛毛狀根的影響。結(jié)果2，4-D和6-BA不適合圓葉牽牛毛狀根的培養(yǎng)。NAA、KT對毛狀根有一定的促進(jìn)作用，NAA最適宜的濃度為0.5 mg·L-1，KT最適宜的濃度為1.0 mg·L-1～1.5 mg·L-1。結(jié)論為圓葉牽牛毛狀根大規(guī)模培養(yǎng)和調(diào)控次生代謝產(chǎn)物機理的研究奠定了基礎(chǔ)。

外源激素；圓葉牽牛；毛狀根；咖啡酸；咖啡酸乙酯

圓葉牽牛(Pharbitispurpurea(L.)Voigt)是旋花科一年生草本植物，種子可入藥，稱牽牛子。具有泄水通便，消痰滌飲，殺蟲攻積的功能。用于水腫脹滿，二便不通，痰飲積聚，氣逆喘咳，蟲積腹痛[1]?？Х人?、咖啡酸乙酯是牽牛子的有效成分[2]。其中咖啡酸是重要的天然抗氧化劑[3]，咖啡酸乙酯具有一定的抗炎作用[4]。在《中國藥典》2005版中規(guī)定了牽牛子中咖啡酸、咖啡酸乙酯的總量不得低于0.2%，在《中國藥典》2010版中取消了對牽牛子中咖啡酸、咖啡酸乙酯的含量要求。潘海峰等[5]測試了10批牽牛子，咖啡酸、咖啡酸乙酯的含量測定結(jié)果總低于0.20%，含量最多的只有0.026%。田連起等[6]研究發(fā)現(xiàn)生白丑、生黑丑、炒白丑、炒黑丑咖啡酸含量分別為0.016%、0.010%、0.0015%、0.0012%。可見牽牛子中咖啡酸，咖啡酸乙酯的含量非常低。然而利用毛狀根技術(shù)可以生產(chǎn)植物次生代謝產(chǎn)物咖啡酸、咖啡酸乙酯，外源激素又對毛狀根中次生代謝產(chǎn)物的的合成有不同程度的影響[7-13]。所以為了獲取高產(chǎn)量的圓葉牽牛毛狀根，并為以后的大規(guī)模培養(yǎng)和調(diào)控次生代謝產(chǎn)物機理的研究打下基礎(chǔ)，本文探討了不同激素對圓葉牽牛毛狀根的影響。

1 儀器、試劑與材料

1.1 儀器與試劑

Agilent1100系列高效液相色譜儀(G1322A DEGASSER；G1311A QuatPump；G1318A COLCOM；G1314A VWD，chemistation system工作站)；色譜柱：色譜柱為Agilent ZORBAX-C18(250 mm×4.6 mm，0.45 μm)；咖啡酸、咖啡酸乙酯對照品購于中國藥品生物制品鑒定所；甲醇為TEDIA公司產(chǎn)品，色譜級；純凈水為娃哈哈公司產(chǎn)品；其他試劑為分析純。

1.2 材料

圓葉牽牛毛狀根，由本實驗室誘導(dǎo)，經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院楊世海教授鑒定。

2 方法

2.1 毛狀根的培養(yǎng)

取0.1 g除菌完全、生長速度快的毛狀根分別在含不同濃度的NAA、2，4-D、6-BA、KT的1/2 MS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)24 d，每個100 mL三角瓶中裝培養(yǎng)液50 mL，溫度為(27±2)℃，搖床轉(zhuǎn)速為80 r·min-1，全部在暗條件下培養(yǎng)。以不加任何激素的1/2 MS液體培養(yǎng)基作為對照，考察各激素對毛狀根的生長及次生代謝產(chǎn)物咖啡酸、咖啡酸乙酯含量的影響。

2.2 毛狀根生長的測定

將收獲的毛狀根用蒸餾水清洗和過濾3遍，然后以布氏漏斗抽慮至無水滴下，稱其鮮重(Fresh Weight,FW)；再放入溫度為45～50 ℃的烘箱中干燥直至其重量恒定，測其干重(Dry Weight,DW)。每次測定3瓶，取平均值，保存?zhèn)溆谩Ｓ嬎愎綖槿缦拢?/p>

增殖倍數(shù)=(收獲后鮮重-接種鮮重)/接種鮮重

2.3 毛狀根中咖啡酸，咖啡酸乙酯的測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Agilent ZORBAX-C18(250 mm×4.6 mm，0.45 μm)，以甲醇為流動相A，0.04%磷酸(含2%異丙醇)為流動相B，按表1進(jìn)行梯度洗脫，流速為1.0 mL·min-1，檢測波長為325 nm?？Х人岷涂Х人嵋阴サ睦碚撍鍞?shù)均不少于3 000。

表1 梯度洗脫

2.3.2 對照品溶液的制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取咖啡酸對照品2.13 mg、咖啡酸乙酯對照品1.98 mg于100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，即得。分別精密吸取1，2，4，8，12，16，20 μL注入液相色譜儀，按上述條件進(jìn)行檢測，記錄峰面積。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程，咖啡酸的回歸方程為Y=2 713 282.7X-1 982.8,r=0.999 3；咖啡酸乙酯的回歸方程為Y=2 464 375.4X-2 011.8,r=0.999 6。

2.3.3供試品溶液的制備 取本品粉末(過四號篩)約2 g，精密稱定，置索氏提取器中，用石油醚(60～90 ℃)回流提取2 h，棄去石油醚液，藥渣揮干溶劑，加入三氯甲烷-甲醇(3∶1)混合溶液提取6 h，提取液回收溶劑至少量，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，用同一溶劑洗滌容器至同一量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻即得。

2.3.4 供試品含量測定 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，在上述色譜條件下測定，記錄峰面積，根據(jù)回歸方程計算即得。

咖啡酸(咖啡酸乙酯)總產(chǎn)量(g)=干重(g)×咖啡酸(咖啡酸乙酯)含量

2.3.5 數(shù)據(jù)處理 本實驗的測定數(shù)值均利用DPS軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析[14]。

3 結(jié)果與討論

3.1 2,4-D對圓葉牽牛毛狀根的影響

將毛狀根接種在含有不同濃度2,4-D的1/2 MS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，24 d后測定鮮重，干重，結(jié)果如表2所示。以2,4-D的濃度為橫坐標(biāo)，咖啡酸、咖啡酸乙酯的總產(chǎn)量為縱坐標(biāo)做曲線如圖1所示。

表2 2，4-D對圓葉牽牛毛狀根的影響

注：不同小寫字母表示彼此之間存在顯著性差異(P<0.05)，不同大寫字母表示彼此之間存在極顯著性差異(P<0.01)，統(tǒng)計分析方法為單因素統(tǒng)計分析。下同。

圖1 2，4-D對圓葉牽牛毛狀根中咖啡酸咖啡酸乙酯總產(chǎn)量的影響

表2中數(shù)據(jù)顯示，在培養(yǎng)基中加入不同濃度的2，4-D時，圓葉牽牛毛狀根的生長受到不同程度的影響。隨著2，4-D濃度的增加，毛狀根的增殖倍數(shù)減小，生長趨于緩慢，顏色也逐漸加深，愈傷化加劇。雖然2，4-D抑制毛狀根的生長，但是高濃度的2，4-D明顯促進(jìn)咖啡酸、咖啡酸乙酯的合成。由圖1中曲線也可以看出，隨著2，4-D的濃度增加，咖啡酸，咖啡酸乙酯的總產(chǎn)量降低。綜合考慮，2，4-D不適合圓葉牽牛毛狀根的培養(yǎng)。

3.26-BA對圓葉牽牛毛狀根的生長及次生代謝產(chǎn)物的影響

將毛狀根接種在含有不同濃度的6-BA的1/2 MS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，24 d后測定鮮重，結(jié)果如表3所示。

由表3中數(shù)據(jù)可以看出，6-BA對圓葉牽牛毛狀根的生長有輕微的抑制作用，隨著6-BA的濃度的增加，抑制作用漸強。6-BA對圓葉牽牛毛狀根的干重及其咖啡酸、咖啡酸乙酯的含量沒有明顯的影響(P>0.05)。綜上所述，6-BA不適合圓葉牽牛毛狀根的培養(yǎng)。

表3 6-BA對圓葉牽牛毛狀根的影響

3.3 NAA對圓葉牽牛毛狀根的生長及次生代謝產(chǎn)物的影響

將毛狀根接種在含有不同濃度的NAA的1/2 MS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，24 d后測定鮮重，干重，結(jié)果如表4所示。以NAA的濃度為橫坐標(biāo)，咖啡酸、咖啡酸乙酯的總產(chǎn)量為縱坐標(biāo)做曲線如圖2所示。

在培養(yǎng)基中加入NAA時，低濃度NAA對毛狀根的生長有促進(jìn)作用，當(dāng)濃度達(dá)到0.5 mg·L-1時，毛狀根的生長最旺盛，生物量積累最大；當(dāng)濃度高于1.5 mg·L-1時對毛狀根的生長有抑制作用，但隨著NAA濃度的增加，對咖啡酸、咖啡酸乙酯的積累有一定的促進(jìn)作用。

表4 NAA對圓葉牽牛毛狀根的影響

圖2 NAA對圓葉牽牛毛狀根中咖啡酸、咖啡酸乙酯總產(chǎn)量的影響

由圖2可以看出，毛狀根中咖啡酸、咖啡酸乙酯的總產(chǎn)量隨著NAA濃度的增加而增加，當(dāng)濃度為0.5 mg·L-1時，含量達(dá)到最大，濃度高于0.5 mg·L-1時，含量逐漸減小，但均高于未加NAA的產(chǎn)量高。綜上所述，NAA對圓葉牽牛毛狀根的生長及其咖啡酸、咖啡酸乙酯均有促進(jìn)作用，最適宜的濃度為0.5 mg·L-1。

3.4 KT對圓葉牽牛毛狀根的生長及次生代謝產(chǎn)物的影響

將發(fā)根接種在含有不同濃度的KT的1/2 MS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，24 d后測定鮮重，結(jié)果如表5所示。

表5中數(shù)據(jù)顯示，在培養(yǎng)基中加入不同濃度的KT，無論毛狀根的生長還是毛狀根中咖啡酸、咖啡酸乙酯的含量均存在差異。均呈現(xiàn)低濃度促進(jìn)，高濃度抑制的現(xiàn)象。但是毛狀根的增殖倍數(shù)和干重均在KT濃度為1.5 mg·L-1時達(dá)到最大值，分別為203.07倍，1.98 g，低于或高于1.5 mg·L-1時，促進(jìn)作用逐漸減弱。但毛狀根中咖啡酸、咖啡酸乙酯的含量均是在KT濃度為1.0 mg·L-1時達(dá)到最大，分別為0.023 7%、0.003 2%，分別是未加激素的1.27倍、1.28 倍。由圖3曲線可以看出毛狀根中咖啡酸、咖啡酸乙酯的總產(chǎn)量分別在1.5 mg·L-1，1.0 mg·L-1時含量最高434.492 1 μg、58.665 6 μg。綜上所述，1.0 mg·L-1～ 1.5 mg·L-1的KT最適合圓葉牽牛毛狀根的培養(yǎng)。

表5 KT對圓葉牽牛毛狀根的影響

圖3 KT對圓葉牽牛毛狀根中咖啡酸、咖啡酸乙酯總產(chǎn)量的影響

4 小結(jié)

盡管植物的毛狀根具有激素自主性，能在無激素的培養(yǎng)基上正常生長，但適當(dāng)?shù)募尤爰に厝阅艽龠M(jìn)毛狀根中次生代謝產(chǎn)物的合成。然而，激素種類，濃度不同對毛狀根的作用也不同。

2，4-D、6-BA、NAA、KT均能不同程度地影響圓葉牽牛毛狀根的生長及其咖啡酸、咖啡酸乙酯的積累，但是毛狀根的生長和咖啡酸、咖啡酸乙酯的含量增長倍數(shù)并不同步。其中2，4-D明顯抑制圓葉牽牛毛狀根的生長，高濃度明顯促進(jìn)咖啡酸、咖啡酸乙酯的合成，但咖啡酸，咖啡酸乙酯的總產(chǎn)量逐漸降低；6-BA輕微抑制毛狀根的生長，對毛狀根的干重及其咖啡酸、咖啡酸乙酯的含量沒有明顯影響；NAA、KT對圓葉牽牛毛狀根的生長及其咖啡酸、咖啡酸乙酯均有促進(jìn)作用，最適宜毛狀根的培養(yǎng)濃度分別為0.5、1.0～1.5 mg·L-1。

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EffectofExogenousHormonesonGrowthofHairyRootandAccumulationofSecondaryMetabolitesinPharbitispurpurea

XU Da-wei1，WANG Qian-qian1， WANG Peng-fei2， YANG Shi-hai1

(1.JilinAgriculturalUniversity，Changchun130118，China；2.ChinaPharmaceuticalUniversity，Nanjing210009，China)

Objective:To explore the effects of different exogenous hormones on the growth of hairy root and the content of caffeic acid and ethyl caffeate inPharbitispurpurea.MethodsProliferation multiple and high performance liquid chromatography(HPLC) were used to measure the growth of hairy root and the content of caffeic acid and ethyl caffeate，thus make clear the effect of exogenous hormones on hairy root inPharbitispurpurea.ResultsThe exogenous of 2,4-D and 6-BA were unsuited as basic medium for hairy root inPharbitispurpurea，the exogenous of NAA and KT had certain promotion effect on hairy root.The optimum concentration of NAA was 0.5 mg·L-1，and that of KT was 1.0 mg·L-1～ 1.5 mg·L-1.ConclusionThis paper established the foundation for large-scale culture of hairy root inPharbitispurpureaand the mechanism of secondary metabolites’ regulation.

Exogenous hormones；Pharbitispurpurea；Hairy root；Caffeic acid；Ethyl caffeate

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楊世海 ，E-mail：jlyangs@163.com

2012-04-28)