正交試驗(yàn)法優(yōu)選抗疲勞組方提取工藝

于海斌,鄭海云*,龔衛(wèi)紅

(1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 中醫(yī)藥科技合作中心,北京 100700;2.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院,北京 100102)

正交試驗(yàn)法優(yōu)選抗疲勞組方提取工藝

于海斌1,鄭海云1*,龔衛(wèi)紅2

(1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 中醫(yī)藥科技合作中心,北京 100700;2.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院,北京 100102)

目的通過(guò)正交試驗(yàn)，優(yōu)選抗疲勞組方的最佳提取工藝。方法采用水提取方式，以水為溶劑進(jìn)行提取，選擇加水倍數(shù)、提取時(shí)間、提取次數(shù)3個(gè)因素，按照正交試驗(yàn)L9(34)表進(jìn)行試驗(yàn)。以粗多糖作為指標(biāo)，綜合考慮，選定最優(yōu)提取工藝。結(jié)果提取的最佳工藝條件為加6倍量水，提取2次，每次2 h。結(jié)論優(yōu)選得到的提取工藝簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、可行。

正交試驗(yàn)；粗多糖

抗疲勞組方含有熟地黃、淫羊藿、枸杞子、西洋參、巴戟天，主要針對(duì)肝脾腎虧虛、精氣不足所致容易疲勞人群所設(shè)。方中熟地黃補(bǔ)血滋陰，益精填髓[1]。主要含有多糖、5-羥甲基糠醛、氨基酸等[2]。淫羊藿補(bǔ)腎陽(yáng)，強(qiáng)筋骨，祛風(fēng)濕[1]，主要含有淫羊藿總黃酮、多糖類(lèi)成分，傳統(tǒng)工藝多采用水提。枸杞子滋補(bǔ)肝腎，益精明目[1]，含有枸杞多糖(LBP)、氨基酸、微量元素、維生素等多種化學(xué)成分[3]，一般采用水提。西洋參補(bǔ)氣養(yǎng)陰，清熱生津[1]，其活性成分為總皂苷類(lèi)、多糖類(lèi)化合物，西洋參可以水提。巴戟天補(bǔ)腎陽(yáng)，強(qiáng)筋骨，祛風(fēng)濕[1]，主要含有糖類(lèi)、蒽醌類(lèi)、香豆素類(lèi)、氨基酸、蛋白質(zhì)、有機(jī)酸、黃酮類(lèi)、揮發(fā)油、甾體、酚類(lèi)等成分，其提取工藝以水提為佳[4]。以上5味藥材均可以水提，主要成分為粗多糖。為了保證制劑質(zhì)量，用正交設(shè)計(jì)法研究其最佳提取工藝，分析加水倍數(shù)，提取時(shí)間，提取次數(shù)對(duì)粗多糖含量的影響，優(yōu)選出最佳提取條件。

1 儀器和材料

1.1 儀器

UV-2800H型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)[尤尼柯(上海)儀器有限公司]；BP-211D型十萬(wàn)分之一分析天平(德國(guó)Sartorius公司)；KQ5200DA型超聲波清洗機(jī)(張家港市海納超聲電器有限公司)。

1.2 材料

熟地黃、淫羊藿、枸杞子、西洋參、巴戟天飲片均購(gòu)于北京本草方源藥業(yè)有限公司。D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110833-200904)；所用試劑均為分析純。

2 方法和結(jié)果

2.1 樣品的制備

按處方投料，加規(guī)定量的水，煎煮規(guī)定的時(shí)間和次數(shù)，濾過(guò)，濾液濃縮至稠膏，放入真空干燥箱，干燥得干膏作為樣品，進(jìn)行測(cè)定。

2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選用L9(34)正交試驗(yàn)，結(jié)合影響該藥材提取效率的主要因素，考察藥材加水量、提取時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)粗多糖含量的影響，同時(shí)考慮生產(chǎn)實(shí)際，選取3個(gè)水平，因素水平見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

表1 抗疲勞組方提取工藝因素水平

2.3 粗多糖含量的測(cè)定

參考《保健食品功效成分檢測(cè)方法》中“粗多糖的測(cè)定方法”[5]，檢出限為5.0 mg·L-1，線性范圍：0～0.2 mg·mL-1。

2.3.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取105 ℃干燥至恒重的D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品2 mg，加水溶解并定容至10 mL，即得0.2 mg·mL-1。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品溶液0,0.10,0.20,0.40,0.60,0.80,1.00 mL，分別置于25 mL比色管中，準(zhǔn)確補(bǔ)充水至2.0 mL，加入50 g·L-1苯酚溶液1.0 mL，混勻，小心加入濃硫酸10.0 mL，混勻，置沸水浴中煮沸2 min，冷卻后用分光光度計(jì)在485 nm波長(zhǎng)處以試劑空白溶液為參比，1 cm比色皿測(cè)定吸光度值。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。求得回歸方程Y=7.784 8X+0.058 2,r=0.999 8，計(jì)算試樣中粗多糖的含量。

2.3.2 供試品溶液的制備

2.3.2.1 樣品提取 取本品適量研細(xì)，取約0.2 g，精密稱(chēng)定，置于100 mL容量瓶中，加水80 mL左右，于沸水浴上加熱2 h，冷卻至室溫后補(bǔ)加水至刻度，混勻，過(guò)濾，棄去初濾液，續(xù)濾液備用。

2.3.2.2 沉淀粗多糖 精密吸取續(xù)濾液50 mL，水浴蒸干，以水5.0 mL溶解，置于50 mL離心管中，加入無(wú)水乙醇20 mL，混勻后以3 000 r·min-1離心10 min，棄去上清液。殘?jiān)?0%乙醇溶液數(shù)毫升洗滌，離心后棄去上清液，反復(fù)3次操作。殘?jiān)┏恋砥暇厶怯谩?/p>

2.3.2.3 沉淀葡聚糖 取2.3.2.2項(xiàng)下殘?jiān)?，用?.0 mL溶解并轉(zhuǎn)移至20mL離心管中，加入100 g·L-1氫氧化鈉溶液2.0 mL，銅試劑溶液2.0 mL，沸水浴中煮沸2 min，冷卻后以3 000 r·min-1離心10 min，棄去上清液。殘?jiān)孟礈煲簲?shù)毫升洗滌，離心后棄去上清液，反復(fù)3次操作后，殘?jiān)?00 mL·L-1硫酸溶液2.0 mL溶解并轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。此溶液為樣品測(cè)定液。

2.3.3 樣品測(cè)定 精密吸取樣品測(cè)定液2.0 mL置于25 mL比色管中，加入50 g·L-1苯酚溶液1.0 mL，混勻，小心加入濃硫酸10.0 mL，小心混勻，置沸水浴中煮沸2 min，冷卻至室溫后用分光光度計(jì)在485 nm波長(zhǎng)處，以試劑空白為參比，1 cm比色皿測(cè)定吸光度值。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出葡萄糖質(zhì)量，計(jì)算樣品中粗多糖的含量。同時(shí)作樣品空白試驗(yàn)。

2.3.4 各組樣品測(cè)定結(jié)果，見(jiàn)表2。

表2 粗多糖提取工藝正交試驗(yàn)結(jié)果

注：Yi=Y1+Y2

表3 粗多糖提取工藝方差分析表

注：F0.05(2，11)=3.98；F0.01(2，11)=7.21

2.3.5 結(jié)果分析

以粗多糖含量為考察指標(biāo)，各因素作用的主次為：C﹥B﹥A，方差分析結(jié)果表明：B(提取時(shí)間)、C(提取次數(shù))影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.01)；在B因素中B3﹥B2﹥B1，故選擇B3；在C因素中，C2﹥C3﹥C1，故選擇C2水平，因素A對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，從節(jié)約成本角度，選擇A1。故水平故最佳工藝為A1B3C2。即6倍量提取2次，每次2 h。

3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)篩選得到最佳提取工藝A1B3C2提取3次，進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果如下。

表4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果 /mg·g-1

4 討論

中藥復(fù)方常含多種飲片，若以某個(gè)飲片的成分為標(biāo)準(zhǔn)考察提取工藝則不能反映全面，故多選用總成分作為標(biāo)準(zhǔn)。熟地黃、枸杞子、西洋參、巴戟天主要含有多糖類(lèi)成分，本實(shí)驗(yàn)采用比色法進(jìn)行檢驗(yàn)。本方法為保健食品審評(píng)專(zhuān)家認(rèn)可的粗多糖測(cè)定方法。但由于方法較為繁瑣，在測(cè)定過(guò)程中，需要操作者仔細(xì)認(rèn)真，確保得到可靠的數(shù)據(jù)，減少誤差。

本實(shí)驗(yàn)篩選的工藝，在實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，充分考慮了實(shí)際生產(chǎn)的需要，篩選的工藝經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，證實(shí)穩(wěn)定可行，可作為抗疲勞組方的提取工藝。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[S].一部.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：116，308，233，123，76.

[2] 朱妍,徐暢.熟地黃活性成分藥理作用研究進(jìn)展[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥雜志,2011,7(11):173-175.

[3] 王金童,王秀娟.枸杞子的化學(xué)成分和藥理研究概況[J].天津藥學(xué),1999,11(3):14-16.

[4] 沈英超.巴戟天活性物質(zhì)的研究[D].南京:南京林業(yè)大學(xué),2008:1-71.

[5] 王光亞.保健食品功效成分檢測(cè)方法[M].北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社：2002.

OptimizationofExtractionTechnologyofAnti-physicalFatigueFormulabyOrthogonalTest

YU Hai-bin1, ZHENG Hai-yun1, GONG Wei-hong2

(1.CollaboratingCenterforTCMandScientificTechnology，ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100700,China; 2.SchoolofChineseMateriaMedica,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100102,China)

Objective: To select the best extraction prescription of Anti-physical Fatigue Formula.MethodsThe water extraction method, water as solvent extraction, multiple choice with water, extraction time and number of the three factors, each of the three levels of design, factor levels in Table 1, in accordance with the orthogonal L9(34) Table experiment. Crude polysaccharide considered as the symbol of the selected optimal extraction.ResultsFactors related to RC>RB>RA，extraction times (C) as the main factor. The optimum extraction conditions for 6 times the amount of water, extraction time 2 h, twice.ConclusionThe optimized extraction process is simple, stable and feasible.

Orthogonal extraction；Crude polysaccharide

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鄭海云，E-mail:jenny0113@126.com

2012-06-12)