RP-HPLC同時(shí)測(cè)定維吾爾藥材無(wú)花果葉中蘆丁和補(bǔ)骨脂素含量△

尼加提·沙吾提，魚洋，蘇來(lái)曼·哈力克*

(1.新疆維吾爾自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所，新疆 烏魯木齊 830002；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 藥學(xué)部，新疆 烏魯木齊 830011)

RP-HPLC同時(shí)測(cè)定維吾爾藥材無(wú)花果葉中蘆丁和補(bǔ)骨脂素含量△

尼加提·沙吾提1，魚洋2，蘇來(lái)曼·哈力克1*

(1.新疆維吾爾自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所，新疆 烏魯木齊 830002；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 藥學(xué)部，新疆 烏魯木齊 830011)

目的建立維吾爾藥材無(wú)花果葉薄層色譜鑒別及HPLC含量測(cè)定方法。方法采用薄層色譜法鑒別無(wú)花果葉；使用Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm),流動(dòng)相：甲醇-0.4%磷酸(40∶60)；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：245 nm;柱溫：25 ℃；同時(shí)測(cè)定無(wú)花果葉中蘆丁和補(bǔ)骨脂素含量。結(jié)果薄層色譜法鑒別色譜斑點(diǎn)清晰，專屬性強(qiáng)；蘆丁和補(bǔ)骨脂素含量測(cè)定線性范圍分別為0.102 4～1.024 μg，r=0.999 8,n=5；0.041～0.717 5 μg，r=0.999 9,n=5。蘆丁平均回收率為103.7%(RSD=0.89%，n=6)，補(bǔ)骨脂素平均回收率為90.9%(RSD=1.67%，n=6)。結(jié)論該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，專屬性強(qiáng)，可用于無(wú)花果葉藥材的質(zhì)量控制。

維吾爾藥材；無(wú)花果葉；蘆??；補(bǔ)骨脂素；HPLC

無(wú)花果葉為?？崎艑僦参餆o(wú)花果FicuscaricaL.的干燥葉片[1]。無(wú)花果樹(shù)是古老的樹(shù)種，《圣經(jīng)》和《古蘭經(jīng)》里就有記載。國(guó)外主要分布于地中海沿岸，上至土耳其下至阿富汗。我國(guó)唐代由波斯(伊朗)傳入，新疆南疆地區(qū)廣泛栽培，全國(guó)其他省份有少量栽培，資源豐富[2-3]。無(wú)花果全身是寶，維吾爾語(yǔ)稱“Anjur”，音譯為“安居爾”，阿拉伯語(yǔ)和波斯語(yǔ)也稱“Anjur”。無(wú)花果樹(shù)是維吾爾人庭院綠化的重要樹(shù)種，鮮果是新疆常食的一種珍貴水果，而無(wú)花果干和無(wú)花果葉則為傳統(tǒng)維吾爾藥材。無(wú)花果葉在維吾爾醫(yī)臨床主要用于治療白癜風(fēng)、痔瘡、小兒腹瀉等癥[4]。近年來(lái)對(duì)于無(wú)花果及其葉的化學(xué)成分的研究正在逐步深入，無(wú)花果作為藥食兼優(yōu)的植物，尤其是它的抗白癜風(fēng)、抗腫瘤、抗氧化、降血脂、降血糖等作用令人關(guān)注[5-8]。無(wú)花果葉中含有補(bǔ)骨脂素、香檸檬內(nèi)酯、佛手柑內(nèi)酯、β-谷甾醇、β-香樹(shù)脂醇、蛇麻脂醇、棕櫚酸、頡草酸、愈創(chuàng)木酚、二十八烷、蘆丁等多種化學(xué)成分，另含揮發(fā)油，鍶、錳、鐵、銅、鋅、鉻、鎳、硒、鈷、鎂、鈣等微量元素[5,9-11]。目前《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·維吾爾藥分冊(cè)》中收載的“消白白熱斯酊劑”處方中的君藥就是無(wú)花果葉。目前未見(jiàn)無(wú)花果葉質(zhì)量分析的報(bào)道。因此，本文對(duì)不同產(chǎn)地?zé)o花果葉進(jìn)行薄層色譜鑒別；以無(wú)花果葉中蘆丁與補(bǔ)骨脂素為指標(biāo)性成分，采用高效液相色譜法同時(shí)對(duì)其進(jìn)行測(cè)定，為建立無(wú)花果葉藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)，從而進(jìn)一步推動(dòng)新疆維吾爾藥無(wú)花果葉相關(guān)藥品的研究、開(kāi)發(fā)和利用。

1 材料與儀器

1.1 供試品

10批不同產(chǎn)地的無(wú)花果葉：(1)阿圖什松塔鄉(xiāng)(2004年7月采集)；(2)和田市醫(yī)藥?？茖W(xué)校(2006年10月采集)；(3)喀什白什克拉木鄉(xiāng)(2006年8月采集)；(4)喀什庭院(2006年8月采集)；(5)阿圖什(2006年9月采集)；(6)新和縣(2006年10月采集)；(7)吐魯番(2006年10月采集)；(8)烏魯木齊盆栽(2006年9月采集)；(9)湖北武漢(2007年4月采集)；(10)江西都昌(2007年4月采集)。上述樣品經(jīng)蘇來(lái)曼·哈力克主任藥師鑒定為桑科植物無(wú)花果FicuscaricaL.的干燥葉。

蘆丁對(duì)照品(批號(hào)：0880-9504，含量測(cè)定用)、補(bǔ)骨脂素對(duì)照品(批號(hào)：110739-200310，含量測(cè)定用)購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑為分析純。

1.2 儀器

Waters高效液相色譜儀(USA)；2487 DualλAbsorbance Detector,1525 Binary HPLC Pump,717 Autosampler; Nextpure Ultra Pure Water System(Korea); KUDOS SK7210LHC超聲儀(59 kHz,350 W)。

2 方法與結(jié)果

2.1 無(wú)花果葉的薄層色譜鑒別

2.1.1 供試品溶液的制備 分別稱取8個(gè)不同產(chǎn)地的無(wú)花果葉0.5 g置5 mL具塞試管中，加入甲醇1 mL超聲10 min，取上清液作為供試品溶液。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 分別取蘆丁和補(bǔ)骨脂素對(duì)照品加甲醇制成每1 mL各含4 mg蘆丁和2 mg補(bǔ)骨脂素的溶液作為對(duì)照品溶液。

2.1.3 薄層色譜試驗(yàn) 分別吸取上述溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以醋酸丁酯-甲酸-水(10∶2.5∶2.5)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈下(365 nm)檢視。供試品色譜中，在與蘆丁和補(bǔ)骨脂素對(duì)照品色譜相對(duì)應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。見(jiàn)圖1。

圖1 無(wú)花果葉薄層色譜圖

2.2 HPLC測(cè)定無(wú)花果葉中蘆丁和補(bǔ)骨脂素的含量

2.2.1 色譜柱和流動(dòng)相的選擇 選用KromasiL C18柱，流動(dòng)相：甲醇-0.4%磷酸(40∶60)；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：245 nm。在選定的色譜條件下，蘆丁、補(bǔ)骨脂素和供試品中其他組分色譜峰可達(dá)到基線分離，蘆丁、補(bǔ)骨脂素與其相鄰色譜峰的分離度符合要求。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取105 ℃干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品2.56 mg，置25 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得(0.102 4 mg·mL-1)。精密稱取置五氧化二磷干燥的補(bǔ)骨脂素對(duì)照品2.05 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得(0.041 0 mg·mL-1)。分別進(jìn)樣10 μL,即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取無(wú)花果葉適量，研細(xì)，精密稱取0.5 g，置50 mL量瓶中，加50%甲醇約40 mL,超聲處理30 min，放置至室溫，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液，進(jìn)樣10 μL,以外標(biāo)法計(jì)算含量。

2.2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 按上述色譜條件，精密稱取無(wú)花果葉0.500 7g，照供試品制備方法制備供試品溶液，注入液相色譜儀10 μL，記錄色譜圖，蘆丁和補(bǔ)骨脂素的保留時(shí)間分別為11.6 min 和21.9 min，蘆丁和補(bǔ)骨脂素與其相鄰色譜峰的分離度符合要求，理論版數(shù)按蘆丁峰計(jì)算不得低于6 000。供試品與對(duì)照品色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 對(duì)照品與無(wú)花果葉樣品HPLC圖

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

2.2.5.1 補(bǔ)骨脂素標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密稱取補(bǔ)骨脂素對(duì)照品2.05 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得0.020 5 mg·mL-1的溶液，即20.5 μg·mL-1的溶液。分別取1,2,5,15,25,35 μL進(jìn)樣，以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積(Au)為縱坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=8 772 431.4X-8 356.1，r=0.999 9。結(jié)果表明補(bǔ)骨脂素進(jìn)樣量在0.041～0.717 5 μg線性關(guān)系良好。

2.2.5.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密稱取蘆丁對(duì)照品2.56 mg，置25 mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，即得0.102 4 mg·mL-1的溶液，即102.4 μg·mL-1的溶液。分別取1,2,5,7,10 μL進(jìn)樣，以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積(Au)為縱坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=1 580 896.5X-46 208.6，r=0.999 8；結(jié)果表明蘆丁在0.102 4～1.024 μg有較好的線性關(guān)系。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 取無(wú)花果葉樣品(產(chǎn)地阿圖什)1份，精密稱取0.505 1g，按上述方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下，連續(xù)進(jìn)6針，每針10 μL，記錄峰面積，計(jì)算，結(jié)果蘆丁和補(bǔ)骨脂素的RSD分別為2.10%和0.29%，結(jié)果儀器精密度良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取無(wú)花果葉樣品(產(chǎn)地阿圖什)0.5 g，精密稱取6份，按上述方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下，每份進(jìn)針10 μL，記錄峰面積，計(jì)算，結(jié)果蘆丁和補(bǔ)骨脂素的RSD分別為2.30%和1.27%，說(shuō)明方法重復(fù)性良好。

2.2.8 穩(wěn)定性考察 取新制備的同一份供試品溶液，分別在室溫放置0，1，2，4，12，24 h時(shí)進(jìn)樣，記錄色譜圖，測(cè)得蘆丁和補(bǔ)骨脂素峰面積的RSD分別為1.4%和1.1%(n=6),結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的無(wú)花果葉樣品(和田)6份，每份0.25 g，精密稱定，分別置50 mL量瓶中，分別精密加入濃度為0.400 8 mg·mL-1補(bǔ)骨脂素對(duì)照品溶液0.8,0.8,1.0,1.0,1.5,1.5 mL,再分別加入濃度為0.630 8 mg·mL-1的蘆丁對(duì)照品溶液1.5,1.5,2.0,2.0,2.5,2.5 mL，按上述供試品制備方法操作，在上述色譜條件下進(jìn)行分析，并根據(jù)加入量計(jì)算回收率。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1、2。

表1 蘆丁回收率試驗(yàn)結(jié)果

表2 補(bǔ)骨脂素回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2.10 樣品的測(cè)定 分別取不同產(chǎn)地的無(wú)花果葉樣品，按上述方法制備供試品溶液，緊密吸取供試品溶液10 μL，在上述色譜條件下進(jìn)樣，以外標(biāo)法計(jì)算蘆丁和補(bǔ)骨脂素含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3可以看出無(wú)花果葉中蘆丁和補(bǔ)骨脂素含量分別為0.055 6%～0.716%、0.090 6%～0.624%。其中湖北和江西產(chǎn)的蘆丁含量低，吐魯番產(chǎn)的蘆丁和補(bǔ)骨脂素含量都低，喀什庭院栽培的補(bǔ)骨脂素含量低，當(dāng)年產(chǎn)的新貨和放置兩年的陳貨含量有差異。

表3 不同產(chǎn)地?zé)o花果葉含量測(cè)定結(jié)果(n=2) /%

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

文獻(xiàn)報(bào)道補(bǔ)骨脂素HPLC法測(cè)定多用245 nm或340 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，蘆丁則為340 nm或360 nm[12-13]。通過(guò)預(yù)試驗(yàn)證明選用245 nm為蘆丁和補(bǔ)骨脂素同一檢測(cè)波長(zhǎng)，此波長(zhǎng)下兩者的峰面積值最大，蘆丁與補(bǔ)骨脂素得到基線分離。

3.2 提取溶劑的確定

分別用50%、70%、100%的甲醇提取同一產(chǎn)地的無(wú)花果葉，結(jié)果用50%的甲醇提取溶液，蘆丁與補(bǔ)骨脂素的峰面積最大且經(jīng)濟(jì)。

3.3 提取時(shí)間的確定

用50%甲醇作為溶劑提取同一產(chǎn)地的無(wú)花果葉，分別超聲10，20，30 min，結(jié)果提取30 min的蘆丁和補(bǔ)骨脂素的峰面積最大。

3.4 實(shí)驗(yàn)方法評(píng)價(jià)

實(shí)驗(yàn)建立的維吾爾藥材無(wú)花果葉薄層色譜鑒別及HPLC含量測(cè)定方法，簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，專屬性強(qiáng)，可用于無(wú)花果葉藥材的質(zhì)量控制。

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RP-HPLCDeterminationofRutinandPsoraleninLeavesofFicuscaricaL.

Nijat SAWUT1, YU Yang2, Suleyman HALIK1

(1.XinjiangUygurAutonomousRegionInstitueforFoodandDrugControl，Urumqi830002,China; 2.ThePhamacySectionofTheFirstTeachingHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

Objective: To establish a HPLC method for determination of rutin and psoralen in Leaves ofFicuscaricaL..MethodsFig Leaves were identified by TLC; The separation was performed on Kromasil C18column (250 mm×4.6 mm，5 μm), with methaonl-0.4% phosphoric acid (40∶60) as mobile phase， a flow rate of 1.0 mL·min-1. The UV detection wavelength was 245 nm. The column temperature was 25 ℃.ResultsThe calibration curves of rutin were linear in the ranges of 0.102 4～1.024 μg(r=0.999 8,n=5). The calibration curves of psoralen were linear in the ranges of 0.041～0.717 5 μg(r=0.999 9,n=5). The average recoveries of rutin and psoralen were 103.7% and 90.9%, respectively.ConclusionThe method is simple, accurate and sensitive. It can be used for quality control of fig leaves.

Fig Leaves;FicuscaricaL.; Rutin; Psoralen; HPLC

新疆維吾爾自治區(qū)科學(xué)研究和技術(shù)開(kāi)發(fā)(含攻關(guān))項(xiàng)目(200633127)

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蘇來(lái)曼·哈力克，Tel:(0991)2305956，E-mail:suleyman@sina.cn

2012-09-10)