固相萃取高效液相色譜法測(cè)定康復(fù)新液中有效成分KFX-4

王光強(qiáng)，陳鑒東，徐小軍，胡禮勇

（浙江京新藥業(yè)股份有限公司 ，浙江 新昌 312500）

康復(fù)新液的主要成分為美洲大蠊（蟑螂）的提取物。功能主治為通利血脈，養(yǎng)陰生肌[1]?？祻?fù)新液所含成分復(fù)雜，真正的活性物質(zhì)基礎(chǔ)不夠明確。有關(guān)美洲大蠊中藥效活性成分的報(bào)導(dǎo)較少。隨著科技的進(jìn)步和研究手段的不斷完善，為了深入了解康復(fù)新液中主要藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，以及從分子水平基礎(chǔ)上闡明康復(fù)新液的藥效活性成分。我們對(duì)美洲大蠊乙醇提取物進(jìn)行了深入的化學(xué)成分研究，并通過(guò)活性跟蹤篩選，成功地分離到了一種具有顯著的抗炎、促進(jìn)肉芽組織增生、創(chuàng)傷愈合等活性作用的化合物單體成分（簡(jiǎn)稱 KFX-4）[2]，經(jīng)確證，其化學(xué)名為（3R）-3-甲基-7-羥甲基-8-羥基-3，4-二氫異香豆素-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，結(jié)構(gòu)式為：

該化合物的檢測(cè)方法未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。為了了解康復(fù)新液中KFX-4的含量水平，我們對(duì)康復(fù)新液中KFX-4的測(cè)定方法進(jìn)行了詳細(xì)的研究，并建立了檢測(cè)方法。

1 儀器與試藥

Agilent 1200series高效液相色譜儀（DAD檢測(cè)器）；色譜柱（Waters Symmetry C18柱4.6mm×150mm，5μm），Waters公司；固相萃取小柱：Strata-X（60mg／3mL，Phenomenex公司）；康復(fù)新液由內(nèi)蒙古京新藥業(yè)有限公司提供；KFX-4對(duì)照品：含量：97.7%，浙江京新藥業(yè)股份有限公司提供。

2 色譜條件

用甲醇－水（20∶80）為流動(dòng)相，流速：0.8mL·min－1，色譜柱：Waters symmetry C18柱 （4.6mm×150mm，5μm），柱溫：30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：265nm，進(jìn)樣量：5μL。按外標(biāo)法計(jì)算。在選定的色譜條件下，測(cè)得的色譜見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)，KFX-4峰形良好，且與相鄰雜質(zhì)峰分離完全。KFX-4峰的DAD全波長(zhǎng)紫外掃描，見(jiàn)圖2，顯示最大吸收波長(zhǎng)220nm與265nm，由于220nm接近末端吸收，故可選擇265nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3 對(duì)照品溶液配制

精密稱定KFX-4對(duì)照品，用40%甲醇溶解并稀釋制成約20μg·mL－1溶液，即得。

圖1 康復(fù)新液中KFX-4的HPLC

圖2 KFX-4紫外吸收?qǐng)D譜

4 康復(fù)新液的預(yù)處理

精密移取康復(fù)新液10mL，10000rpm，離心10min，取離心清液過(guò)反相固相萃取小柱（固相萃取小柱使用前依次用1mL甲醇、1mL水活化），用水2mL洗脫兩次，去除雜質(zhì)，再用40%甲醇1mL洗脫并收集洗脫液作為供試品溶液。

5 結(jié)果

5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

配制KFX-4對(duì)照品溶液貯備液，并分別稀釋制成0.618、1.844、3.688、9.220、18.44、27.66、46.10與92.20μg·mL－1，取上述濃度的溶液注入液相色譜儀，記錄色譜圖，得 KFX-4峰面積分別為7.7、20.5、42.38、106.04、211.66、311.01、528.60與1060.15。以 KFX-4對(duì)照品的峰面積（A）和KFX-4濃度（X））為X軸進(jìn)行線性回歸，得線性方程為A＝11.498X－0.883，相關(guān)系數(shù)r＝0.99998。表明在0.618～92.2μg·mL－1范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

5.2 定量限

逐步稀釋KFX-4對(duì)照品溶液并注入液相色譜儀，記錄色譜圖，當(dāng)信噪比約等于10∶1時(shí)，此時(shí)濃度為0.618μg·mL－1。

5.3 儀器精密度

取濃度21.74μg·mL－1的 KFX-4對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算RSD為0.3%。

5.4 準(zhǔn)確度

采用加樣回收率試驗(yàn)：精密移取090807批康復(fù)新液離心清液5mL，分別加入加樣對(duì)照品溶液（19.6μg·mL－1）0.4、0.5、0.6mL，每個(gè)濃度3份，共9份，按測(cè)定法制成樣品溶液進(jìn)樣分析，記錄峰面積并計(jì)算回收率。

表1 康復(fù)新液中KFX-4含量回收率檢測(cè)結(jié)果（n＝3）

結(jié)果表明，該法回收率良好。

5.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取090807批康復(fù)新液，按測(cè)定法測(cè)定6次，結(jié)果分別為2.03、2.19、2.14、2.06、2.12與 2.07μg·mL－1，平均值2.10 μg·mL－1，RSD為2.7%。

5.6 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

取康復(fù)新液制成的供試品溶液，分別在0、2.5、7.5、13.5、26、38、136h進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。7次的 RSD為1.1%。

5.7 方法的耐用性

5.7.1 流速影響

在色譜條件中，改變流速為0.7mL·min－1與0.9mL·min－1，其它條件不變，按規(guī)定方法檢測(cè)供試品溶液，并與正常檢測(cè)0.8mL·min－1的數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比。三組數(shù)據(jù)的總RSD為1.7%。

5.7.2 柱溫影響

在色譜條件中，改變柱溫為25℃與35℃，其它條件不變，按方法檢測(cè)樣品溶液，并與正常檢測(cè)30℃的數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比。三組數(shù)據(jù)的總RSD為1.9%。

5.7.3 流動(dòng)相比例調(diào)整

在色譜條件中，改變流動(dòng)相比例為甲醇∶水＝18∶82或22∶78，其它條件不變，按方法檢測(cè)樣品溶液，并與正常檢測(cè)（甲醇∶水＝20∶80）的數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比。三組數(shù)據(jù)的總RSD為1.9%。

5.8 取康復(fù)新液樣品

批號(hào)為091101、091103與091201的樣品按規(guī)定方法進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果 KFX-4含量分別為：1.44、1.37和1.35μg·mL－1。

6 討論

曾嘗試直接離心后的上清液進(jìn)樣，結(jié)果峰面積非常小且雜質(zhì)干擾很大。嘗試用傳統(tǒng)液－液萃取法將KFX-4從康復(fù)新液中提取出來(lái)，用正丁醇與氯仿均未能獲得滿意效果，而使用固相萃取技術(shù)大大提高了萃取回收率（大于90%），且樣品的凈化效果極佳，洗脫后的樣品液直接進(jìn)樣，康復(fù)新液中雜質(zhì)對(duì)KFX-4無(wú)干擾。曾選用D101大孔樹(shù)脂柱，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)較多，且基線易漂移。比較而言，Strata-X固相小柱的實(shí)驗(yàn)結(jié)果最為滿意。通過(guò)對(duì)KFX-4含量測(cè)定方法的驗(yàn)證，確定了專屬性、重復(fù)性、中間精密度、準(zhǔn)確度和線性與范圍等符合規(guī)定，根據(jù)數(shù)批樣品檢測(cè)結(jié)果，本方法可以用于康復(fù)新液中KFX-4的控制。

[1]徐小軍.一種二氫異香豆素葡萄糖苷化合物及其制備[J].中國(guó)藥物學(xué)，2009，12（7）：23.