伏毛鐵棒錘藥材HPLC指紋圖譜研究

馬學琴，康小蘭，王 飛，付雪艷，何志梅

（寧夏醫(yī)科大學 藥學院，寧夏 銀川 750004）

鐵棒錘是毛茛科烏頭屬植物鐵棒錘Aconitum szechenyianumGay.和伏毛鐵棒錘Aconitum Flavum Hand.Mazz.的干燥塊根[1]。2010年版中國藥典未收載品種，為陜、甘、寧等省應用較廣的一種民間草藥[2]。其味苦辛，性熱，有大毒，具“活血祛瘀，祛風濕，止痛”等作用[3]。目前，課題組對其所含的總生物堿以及烏頭堿的含量已有研究[4－5]。本研究繼續(xù)從綜合評價伏毛鐵棒錘質(zhì)量的角度出發(fā)，建立其HPLC指紋圖譜，為伏毛鐵棒錘藥材的鑒定提供實驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

日立LC-2000高效液相色譜儀；島津UV-2550紫外分光光度計；奧豪斯AP210型分析天平。

1.2 藥品與試劑

烏頭堿對照品（批號110720-200409）；甲醇、乙腈（色譜純，美國TEDIA）；娃哈哈純凈水；其它試劑均為分析純。鐵棒錘為自采，來源：固原六盤山（樣品編號S1－S3）、月亮山（樣品編號S4－S5）、種植園（樣品編號S6－S8）、黑城鄉(xiāng)（樣品編號S9－S10）；經(jīng)寧夏醫(yī)科大學藥學院生藥學教研室鑒定為毛茛科烏頭屬植物伏毛鐵棒錘AconitumFlavum Hand.Mazz.的干燥塊根。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：美國 Thermo ODS-2HYPERSIL（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：A-甲醇－乙腈（3∶2），B-醋酸－醋酸鈉（pH＝4.5）緩沖液梯度洗脫：0～10min 1%～5%A，10～30min 5%～15%A，30～40min 15%～25%A，40～50min 25%～80%A，50～60min 80%～100%A，60～70min 100%A；檢測波長：240～280nm，流速0.8mL／min，柱溫：30℃。

2.2 對照品溶液制備

精密稱量烏頭堿對照品5.6mg，置5mL容量瓶中，色譜甲醇溶解，定容，得烏頭堿對照品貯備液。

2.3 供試品溶液制備

取伏毛鐵棒錘藥材，粉碎，過80目篩，60℃干燥至恒重。精密稱取適量（相當生藥1g），置200mL具塞三角錐形瓶中，加入氯仿－甲醇－水（6∶4∶1）20mL，超聲提取40min，冷卻，過濾，濾液水浴蒸干，殘渣用甲醇溶解并定容至10mL得供試品溶液，臨用前0.45μm微孔濾膜過濾。

2.4 伏毛鐵棒錘藥材指紋圖譜方法學考察

（1）精密度試驗：按“2.3”項下方法制備供試品溶液，取同一供試液，連續(xù)進樣6次，按“2.1”色譜條件測定，選擇25個共有峰進行比較。結(jié)果表明，各共有峰的相對保留時間RSD＜0.23%，各共有峰的相對峰面積RSD＜2.14，表明供試品的精密度良好。

（2）重復性試驗：取同一批次伏毛鐵棒錘藥材，按“2.3”項下方法平行操作，制備6份供試液，按“2.1”色譜條件測定。結(jié)果表明，各共有峰的相對保留時間RSD＜1.15%，各共有峰的相對峰面積RSD＜2.78，表明方法的重現(xiàn)性良好。

（3）穩(wěn)定性試驗：取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24h進樣測定，對25個共有峰進行比較，結(jié)果各共有峰的相對保留時間RSD＜0.21%，各共有峰的相對峰面積RSD＜1.66%，表明供試品溶液在24內(nèi)穩(wěn)定。

3 結(jié)果

3.1 指紋圖譜的采集及共有峰的標定

按照“2.3”項下方法，制備10批次伏毛鐵棒錘供試液，按“2.1”色譜條件測定并記錄色譜圖。采用國家藥典委員會頒布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A版》軟件自動匹配10批次伏毛鐵棒錘藥材HPLC色譜圖相關(guān)參數(shù)，以平均數(shù)法作為對照指紋圖譜的生成方法，設(shè)時間窗寬度為0.2min，提取伏毛鐵棒錘藥材的共有模式建立對照指紋圖譜，見圖1。

圖1 伏毛鐵棒錘藥材對照指紋圖譜

標定共有峰共25個，以峰面積較大的5號峰為參照物峰，分別計算其余共有峰與5號參照物峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果表明，10批次伏毛鐵棒錘藥材共有峰的相對保留時間RSD小于0.5%，而相對峰面積RSD在11.34～27.61之間，說明各批次藥材之間共有峰的保留時間有著很好的一致性，但由于來源的不同，其峰面積相差較大。

3.2 相似度計算

將10批伏毛鐵棒錘藥材樣品指紋圖譜導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A版》軟件，計算各樣品指紋圖譜與生成的對照圖譜的相似度，樣品S1～S10的相似度依次為0.927、0.901、0.953、0.918、0.911、0.926、0.916、0.933、0.937、0.903。結(jié)果表明，10批次藥材與對照指紋圖譜的相似度結(jié)果均大于0.9，相關(guān)性良好。

4 討論

4.1 伏毛鐵棒錘藥材相似度評價

本實驗所采集藥材均來自寧夏中部干旱帶固原地區(qū)，海拔高度在2600m左右，是伏毛鐵棒錘聚集生長的地區(qū)。由于此地區(qū)土壤、水分、氣候、陽光、溫度等條件較為相似，并且所采集的伏毛鐵棒錘均為兩年生，故藥材之間一致性較好，相似度均在0.9以上。

4.2 指紋圖譜參照物峰的選擇

本實驗最初以烏頭堿色譜峰作為參照物峰，但其峰面積相對較小（峰面積＜總峰面積的5%），根據(jù)《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求》中的規(guī)定，峰面積相對較小的色譜峰誤差較大，不適宜作為參照物峰。故本實驗選擇峰面積相對較大的5號色譜峰作為參照物峰，其余共有峰與其的比值誤差較小，結(jié)果較為準確。

4.3 波長的選擇

本實驗采用DAD檢測器，在進行供試品溶液全波長掃描時，供試液的最大吸光度在260nm，故選用240～280nm整合波長的色譜圖，能夠捕捉到更多的色譜峰。

4.4 供試品制備方法的優(yōu)化

本實驗選用70%乙醇、100%甲醇、氯仿－甲醇（2∶1）、氯仿－甲醇－水（6∶4∶1）等溶劑，回流、超聲等提取方法，并進行了提取工藝的正交試驗，以峰之間的分離度和峰的個數(shù)為指標，優(yōu)選出氯仿－甲醇－水（6∶4∶1）為溶劑，超聲提取時，供試液色譜峰的個數(shù)最多且分離度較好，故選用此法。

本研究建立了伏毛鐵棒錘HPLC指紋圖譜，從藥材整體色譜圖入手，選取了25個特征峰構(gòu)成了伏毛鐵棒錘的指紋圖譜，能提供更全面的質(zhì)量控制信息，為鑒別該藥材提供了更多的參考數(shù)據(jù)。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].北京：化學工業(yè)出版社，1985.

[2]張銀霞，張銀娟，唐建寧，等.六盤山區(qū)伏毛鐵棒錘資源調(diào)查的研究與評價[J].農(nóng)業(yè)科學研究，2008，29（1）：55-57.

[3]王毓杰，張 靜，田會萍，等.民族藥鐵棒錘炮制減毒原理初步研究[J].中國中藥雜志，2010，35（5）：588-592.

[4]付雪艷，董 琳，權(quán)洪峰，等.鐵棒錘總生物堿的含量測定[J].科協(xié)論壇，2007（8）：476.

[5]付雪艷，董 琳，張義偉，等.HPLC測定鐵棒錘中烏頭堿的含量[J].科協(xié)論壇，2007（8）：456.