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      伏毛鐵棒錘藥材HPLC指紋圖譜研究

      2012-11-02 03:13:46馬學琴康小蘭付雪艷何志梅
      亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥 2012年12期
      關(guān)鍵詞:鐵棒參照物烏頭

      馬學琴,康小蘭,王 飛,付雪艷,何志梅

      (寧夏醫(yī)科大學 藥學院,寧夏 銀川 750004)

      鐵棒錘是毛茛科烏頭屬植物鐵棒錘Aconitum szechenyianumGay.和伏毛鐵棒錘Aconitum Flavum Hand.Mazz.的干燥塊根[1]。2010年版中國藥典未收載品種,為陜、甘、寧等省應用較廣的一種民間草藥[2]。其味苦辛,性熱,有大毒,具“活血祛瘀,祛風濕,止痛”等作用[3]。目前,課題組對其所含的總生物堿以及烏頭堿的含量已有研究[4-5]。本研究繼續(xù)從綜合評價伏毛鐵棒錘質(zhì)量的角度出發(fā),建立其HPLC指紋圖譜,為伏毛鐵棒錘藥材的鑒定提供實驗依據(jù)。

      1 儀器與試藥

      1.1 儀器

      日立LC-2000高效液相色譜儀;島津UV-2550紫外分光光度計;奧豪斯AP210型分析天平。

      1.2 藥品與試劑

      烏頭堿對照品(批號110720-200409);甲醇、乙腈(色譜純,美國TEDIA);娃哈哈純凈水;其它試劑均為分析純。鐵棒錘為自采,來源:固原六盤山(樣品編號S1-S3)、月亮山(樣品編號S4-S5)、種植園(樣品編號S6-S8)、黑城鄉(xiāng)(樣品編號S9-S10);經(jīng)寧夏醫(yī)科大學藥學院生藥學教研室鑒定為毛茛科烏頭屬植物伏毛鐵棒錘AconitumFlavum Hand.Mazz.的干燥塊根。

      2 方法

      2.1 色譜條件

      色譜柱:美國 Thermo ODS-2HYPERSIL(250mm×4.6mm,5μm);流動相:A-甲醇-乙腈(3∶2),B-醋酸-醋酸鈉(pH=4.5)緩沖液梯度洗脫:0~10min 1%~5%A,10~30min 5%~15%A,30~40min 15%~25%A,40~50min 25%~80%A,50~60min 80%~100%A,60~70min 100%A;檢測波長:240~280nm,流速0.8mL/min,柱溫:30℃。

      2.2 對照品溶液制備

      精密稱量烏頭堿對照品5.6mg,置5mL容量瓶中,色譜甲醇溶解,定容,得烏頭堿對照品貯備液。

      2.3 供試品溶液制備

      取伏毛鐵棒錘藥材,粉碎,過80目篩,60℃干燥至恒重。精密稱取適量(相當生藥1g),置200mL具塞三角錐形瓶中,加入氯仿-甲醇-水(6∶4∶1)20mL,超聲提取40min,冷卻,過濾,濾液水浴蒸干,殘渣用甲醇溶解并定容至10mL得供試品溶液,臨用前0.45μm微孔濾膜過濾。

      2.4 伏毛鐵棒錘藥材指紋圖譜方法學考察

      (1)精密度試驗:按“2.3”項下方法制備供試品溶液,取同一供試液,連續(xù)進樣6次,按“2.1”色譜條件測定,選擇25個共有峰進行比較。結(jié)果表明,各共有峰的相對保留時間RSD<0.23%,各共有峰的相對峰面積RSD<2.14,表明供試品的精密度良好。

      (2)重復性試驗:取同一批次伏毛鐵棒錘藥材,按“2.3”項下方法平行操作,制備6份供試液,按“2.1”色譜條件測定。結(jié)果表明,各共有峰的相對保留時間RSD<1.15%,各共有峰的相對峰面積RSD<2.78,表明方法的重現(xiàn)性良好。

      (3)穩(wěn)定性試驗:取同一供試品溶液,分別于0、2、4、8、12、24h進樣測定,對25個共有峰進行比較,結(jié)果各共有峰的相對保留時間RSD<0.21%,各共有峰的相對峰面積RSD<1.66%,表明供試品溶液在24內(nèi)穩(wěn)定。

      3 結(jié)果

      3.1 指紋圖譜的采集及共有峰的標定

      按照“2.3”項下方法,制備10批次伏毛鐵棒錘供試液,按“2.1”色譜條件測定并記錄色譜圖。采用國家藥典委員會頒布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A版》軟件自動匹配10批次伏毛鐵棒錘藥材HPLC色譜圖相關(guān)參數(shù),以平均數(shù)法作為對照指紋圖譜的生成方法,設(shè)時間窗寬度為0.2min,提取伏毛鐵棒錘藥材的共有模式建立對照指紋圖譜,見圖1。

      圖1 伏毛鐵棒錘藥材對照指紋圖譜

      標定共有峰共25個,以峰面積較大的5號峰為參照物峰,分別計算其余共有峰與5號參照物峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果表明,10批次伏毛鐵棒錘藥材共有峰的相對保留時間RSD小于0.5%,而相對峰面積RSD在11.34~27.61之間,說明各批次藥材之間共有峰的保留時間有著很好的一致性,但由于來源的不同,其峰面積相差較大。

      3.2 相似度計算

      將10批伏毛鐵棒錘藥材樣品指紋圖譜導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A版》軟件,計算各樣品指紋圖譜與生成的對照圖譜的相似度,樣品S1~S10的相似度依次為0.927、0.901、0.953、0.918、0.911、0.926、0.916、0.933、0.937、0.903。結(jié)果表明,10批次藥材與對照指紋圖譜的相似度結(jié)果均大于0.9,相關(guān)性良好。

      4 討論

      4.1 伏毛鐵棒錘藥材相似度評價

      本實驗所采集藥材均來自寧夏中部干旱帶固原地區(qū),海拔高度在2600m左右,是伏毛鐵棒錘聚集生長的地區(qū)。由于此地區(qū)土壤、水分、氣候、陽光、溫度等條件較為相似,并且所采集的伏毛鐵棒錘均為兩年生,故藥材之間一致性較好,相似度均在0.9以上。

      4.2 指紋圖譜參照物峰的選擇

      本實驗最初以烏頭堿色譜峰作為參照物峰,但其峰面積相對較小(峰面積<總峰面積的5%),根據(jù)《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求》中的規(guī)定,峰面積相對較小的色譜峰誤差較大,不適宜作為參照物峰。故本實驗選擇峰面積相對較大的5號色譜峰作為參照物峰,其余共有峰與其的比值誤差較小,結(jié)果較為準確。

      4.3 波長的選擇

      本實驗采用DAD檢測器,在進行供試品溶液全波長掃描時,供試液的最大吸光度在260nm,故選用240~280nm整合波長的色譜圖,能夠捕捉到更多的色譜峰。

      4.4 供試品制備方法的優(yōu)化

      本實驗選用70%乙醇、100%甲醇、氯仿-甲醇(2∶1)、氯仿-甲醇-水(6∶4∶1)等溶劑,回流、超聲等提取方法,并進行了提取工藝的正交試驗,以峰之間的分離度和峰的個數(shù)為指標,優(yōu)選出氯仿-甲醇-水(6∶4∶1)為溶劑,超聲提取時,供試液色譜峰的個數(shù)最多且分離度較好,故選用此法。

      本研究建立了伏毛鐵棒錘HPLC指紋圖譜,從藥材整體色譜圖入手,選取了25個特征峰構(gòu)成了伏毛鐵棒錘的指紋圖譜,能提供更全面的質(zhì)量控制信息,為鑒別該藥材提供了更多的參考數(shù)據(jù)。

      [1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].北京:化學工業(yè)出版社,1985.

      [2]張銀霞,張銀娟,唐建寧,等.六盤山區(qū)伏毛鐵棒錘資源調(diào)查的研究與評價[J].農(nóng)業(yè)科學研究,2008,29(1):55-57.

      [3]王毓杰,張 靜,田會萍,等.民族藥鐵棒錘炮制減毒原理初步研究[J].中國中藥雜志,2010,35(5):588-592.

      [4]付雪艷,董 琳,權(quán)洪峰,等.鐵棒錘總生物堿的含量測定[J].科協(xié)論壇,2007(8):476.

      [5]付雪艷,董 琳,張義偉,等.HPLC測定鐵棒錘中烏頭堿的含量[J].科協(xié)論壇,2007(8):456.

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