RP-HPLC法測定蒼耳子中蒼術(shù)苷

劉玉紅，朵 睿，2，黃 蛟，王明奎，易進(jìn)海*

（1.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，四川 成都 610041；2.瀘州醫(yī)學(xué)院，四川 瀘州，646000；3.中國科學(xué)院成都生物所，四川 成都 610041）

蒼耳子是菊科植物蒼耳Xanthium sibiricum Patr.的干燥成熟帶總苞的果實(shí)，具有散風(fēng)寒、通鼻竅、祛風(fēng)濕之功效，用于風(fēng)寒頭痛、鼻塞流涕、鼻鼽、鼻淵等癥，是鼻淵之要藥［1］，為臨床常用有毒中藥。《本草品匯精要》記載蒼耳子“有毒”?！赌戏街饕卸局参铩酚涊d: “蒼耳，有毒部位，全株；以果實(shí)為最毒”。因蒼耳服用過量或炮制不當(dāng)引起的中毒甚至死亡的病例時(shí)有發(fā)生［2-3］，病理特征表現(xiàn)為動(dòng)物和人在誤食一定量后出現(xiàn)血糖下降，昏迷，嚴(yán)重者出現(xiàn)腎衰竭甚至死亡；慢性中毒多因初服時(shí)未出現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)而長期服用，結(jié)果導(dǎo)致蓄積中毒，引起心肌及肝功能損害［4］。現(xiàn)代化學(xué)和毒理研究表明蒼耳子的毒性成分主要為水溶性苷類成分:蒼術(shù)苷(atractyloside)與羧基蒼術(shù)苷(carboxyatractyloside)以及其它苷類衍生物等［5］。蒼術(shù)苷及羧基蒼術(shù)苷可抑制體內(nèi)ADP/ATP對蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)，并帶來嚴(yán)重的血糖下降，從而導(dǎo)致體內(nèi)代謝紊亂［6-8］，與蒼耳子中毒的表現(xiàn)一致，因此被認(rèn)為是蒼耳子的主要毒性成分。建立蒼耳子中蒼術(shù)苷的測定方法，對蒼耳子的毒性成分進(jìn)行監(jiān)控，保證臨床用藥安全是十分必要的。蒼耳子中蒼術(shù)苷的測定尚未見文獻(xiàn)報(bào)道，其它樣品中蒼術(shù)苷的測定方法文獻(xiàn)報(bào)道有酶聯(lián)免疫法［9］、TLC斑點(diǎn)測試［10］、GC-MS［11］、HPLC-ELSD［12］、LC-API-MS［13］等，這些方法在定量的準(zhǔn)確性或方法的普適性方面存在一定的局限。本實(shí)驗(yàn)首次建立了RP-HPLC測定蒼耳子中蒼術(shù)苷的方法，該方法簡便、快速，重復(fù)性好，為控制蒼耳子的質(zhì)量和毒性提供了參考。

1 材料

Agilent 1200型高效液相色譜儀 (包括四元泵，DAD檢測器，柱溫箱，自動(dòng)進(jìn)樣器，工作站)；KQ—100超聲波清洗儀 (昆山市超聲儀器有限公司)，Mettler Toledo XS205型電子天平 (瑞士)，Millipore Milli-Q超純水系統(tǒng) (美國)。

實(shí)驗(yàn)樣品購于四川、遼寧、山東、河北、內(nèi)蒙古、新疆、甘肅等地共35批蒼耳子藥材和飲片，由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院舒光明研究員鑒定。蒼術(shù)苷對照品自制，純度為98.1%，經(jīng)理化性質(zhì)和光譜數(shù)據(jù)分析，鑒定其結(jié)構(gòu)。乙腈為美國Fisher色譜純；水為Millipore Milli-Q超純水系統(tǒng)制得的超純水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為Agilent ZORBAX SB-phenyl(4.6 mm×250 mm，5 μm)柱；流動(dòng)相為乙腈-0.01 mol/L磷酸二氫鈉溶液 (20∶80)；體積流量1.0 mL/min；檢測波長203 nm；柱溫35℃。對照品溶液及供試品溶液的色譜圖見圖1。同時(shí)對樣品中蒼術(shù)苷的200～400 nm紫外光譜圖與對照品的紫外光譜圖進(jìn)行比較，表明樣品峰無其它雜質(zhì)干擾。

圖1 蒼術(shù)苷對照品 (A)及蒼耳子供試品 (B)的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms of atractyloside(A)and Xanthii Fructus(B)

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取蒼術(shù)苷對照品11.29 mg，置10 mL量瓶中，加10%甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻。再精密量取上述對照品溶液1 mL，置10 mL量瓶中，加10%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL中含蒼術(shù)苷0.1129 mg的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取蒼耳子粉未 (過三號篩)1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加水20 mL，精密稱定質(zhì)量，超聲 (功率250 W，頻率40 kHz)處理40 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用水補(bǔ)足減失質(zhì)量，離心 (12000 r/min，5 min)，取上清液作為供試品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系 精密吸取蒼術(shù)苷對照品各1、3、6、9、12、15、20 μL，注入液相色譜儀中，以進(jìn)樣量 (μg)為橫坐標(biāo)，對照品峰面積 (A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果蒼術(shù)苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=458.9X-3.884(r=0.9999)，線性范圍為0.1129 ～2.258 μg。

2.4.2 定量限和檢出限 將2.2項(xiàng)下的溶液，用10%甲醇溶液稀釋成0.01129 mg/mL的溶液，進(jìn)樣測定，按10倍和3倍信噪比計(jì)算出蒼術(shù)苷的定量限和檢出限分別約為34 ng、11.3 ng。

2.4.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液(樣品01)10 μL，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣5次，按2.1項(xiàng)下色譜條件測定，蒼術(shù)苷的峰面積的RSD為0.58%，表明儀器精密度好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液(樣品01)10 μL，注入液相色譜儀，分別于0、1、4、8、24 h檢測，記錄色譜圖，蒼術(shù)苷的峰面積的RSD為0.83%，表明供試品溶液于24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一蒼耳子 (樣品01)粉未，精密稱取約1 g，共5份，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液10 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計(jì)算出蒼術(shù)苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.14 mg/g、RSD為1.0%，表明該方法重復(fù)性好。

2.4.6 加樣回收試驗(yàn) 取已知蒼術(shù)苷含有量的樣品 (樣品01，2.14 mg/g)，0.5 g，共6份，精密稱定，準(zhǔn)確加入適量對照品，照2.3項(xiàng)下操作，測定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 蒼術(shù)苷的加樣回收率實(shí)驗(yàn) (n=6)Tab.1 Recovery of atractyloside

2.5 樣品測定 照2.3項(xiàng)下方法制備35批次蒼耳子樣品的供試品溶液，分別精密吸取10～20 μL注入液相色譜儀測定，在2.1項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行測定，計(jì)算各樣品中蒼術(shù)苷，結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 提取溶劑和樣品制備方法的考察 蒼術(shù)苷為水溶性苷類。本實(shí)驗(yàn)比較了水、25%甲醇、50%甲醇對蒼術(shù)苷超聲提取的效果，3種溶劑測定同一樣品的含有量分別為0.214%、0.191%，0.0723%，表明不同溶劑提取對蒼術(shù)苷有顯著影響，以水提取效果最佳。又以水為提取溶劑，比較了超聲提取30、40、60 min的差異，結(jié)果表明提取 40 min即可。

表2 蒼耳子樣品中蒼術(shù)苷的測定結(jié)果 (n=3)Tab.2 Contents of atractyloside in Xanthii Fructus

3.2 色譜條件的選擇和優(yōu)化

3.2.1 流動(dòng)相系統(tǒng)的篩選 參照文獻(xiàn)［13］，采用甲醇-醋酸鹽緩沖液系統(tǒng)，結(jié)果基線噪音太大，該系統(tǒng)不適合紫外檢測器短波長檢測。又自行摸索比較了甲醇-磷酸水、乙腈-磷酸水、乙腈-磷酸鹽等系統(tǒng)，結(jié)果以乙腈-磷酸鹽系統(tǒng)較好，但仍存在色譜峰拖尾嚴(yán)重的問題，故對不同色譜柱的分離效果進(jìn)行比較。

3.2.2 色譜柱的篩選 比較了Phenomenex LUNA C18(2)(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，Agilent Eplise XDB-C18柱 (4.6 mm ×250 mm，5 μm)，親水性C18柱 Phenomenex Gemini C18110A(4.6 mm×250 mm，5 μm)，苯基柱 Agilent ZORBAX SB-phenyl(4.6 mm×250 mm，5 μm)的分離效果，結(jié)果以苯基柱分離效果最佳，峰形較為對稱。

3.2.3 測定波長的選擇 蒼術(shù)苷為貝殼杉烯苷類化合物，DAD掃描可見僅有末端吸收，故采用203 nm為測定波長，結(jié)果表明靈敏度較高，待測成分基線分離，重現(xiàn)性良好，符合定量測定的要求。

3.3 測定結(jié)果 35批次蒼耳子藥材及飲片的測定結(jié)果，表明不同來源蒼耳子中蒼術(shù)苷的含有量差異很大，有必要制定蒼術(shù)苷的限量標(biāo)準(zhǔn)。有報(bào)道稱南方產(chǎn)蒼耳子低毒，北方產(chǎn)蒼耳子毒性較大，本實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果與此結(jié)論有相同趨勢。

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