親代GATA4基因變異對(duì)子代發(fā)生先天性心臟病的影響

彭 婷，王 麗，程 琰，郭奇桑，李笑天

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院，上海 200011;2.中國(guó)福利會(huì)國(guó)際和平婦幼保健院輔助生殖醫(yī)學(xué)中心，上海 200030)

先天性心臟病(先心病 congenital heart disease，CHD)在出生缺陷病因中占首位，在新生兒中發(fā)病率約8‰。先心病的病因還未明確。近年來(lái)認(rèn)為心臟發(fā)育轉(zhuǎn)錄因子GATA4基因突變?cè)谙刃牟“l(fā)病中有重要作用。GATA4基因突變可能遺傳自父母，也可能來(lái)源于環(huán)境誘變。國(guó)外報(bào)道在先心病患者中檢測(cè)到的NKX2.5基因突變位點(diǎn)，在心臟正常的父母DNA上也可以檢測(cè)到，這種現(xiàn)象甲狀腺先天異常研究中也存在［1］。但目前國(guó)內(nèi)關(guān)于父母遺傳對(duì)子代先心病發(fā)病影響方面報(bào)道很少。本文擬從先心病患者父/母角度，分析GATA4基因編碼鏈的突變情況，了解父母遺傳因素對(duì)子代發(fā)病影響情況。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

1.1.1 病例組父代 2005－2006年復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院心血管中心的住院先心病患兒135例均經(jīng)超聲心動(dòng)圖、心導(dǎo)管檢查或外科手術(shù)確診。經(jīng)入院查體檢測(cè)是否為綜合癥型心臟病，心臟畸形分型見表1。所有研究對(duì)象均為漢族，無(wú)血緣關(guān)系。其中父親43例，母親92例。父母均取到為2例，共137例。

135例先心病中有3例有家族史，其家族史情況見表2。3例有家族史患者父母均體健，且先心病表型與家族中患病者均不同，考慮不是有顯性主基因參與的多基因遺傳模式。有1例為Down’s綜合癥患兒，區(qū)別于其他非綜合征型先心病患兒。

1.1.2 對(duì)照組父代 經(jīng)產(chǎn)前檢查沒(méi)有心臟畸形的正常人114例，為正常志愿者和復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院產(chǎn)檢的孕婦。父5例，母109例。

表1 135例先天性心臟病患者心臟畸形分類

表2 先天性心臟病家族史及Down綜合癥患兒

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 血標(biāo)本的采集和基因組DNA的提取 抽取父親或母親外周靜脈血2 ml，加入68 mmol/LEDTA 40 μl抗凝，采用U-geneDNA血液基因組DNA抽提試劑盒(安徽優(yōu)晶生物 H.Q.＆.Q.Blood DNA Kit I)按操作手冊(cè)提取基因組DNA。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)及PCR反應(yīng) 采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，將GATA4基因根據(jù)GeneBank中公布的DNA標(biāo)準(zhǔn)序列 ，使擴(kuò)增產(chǎn)物完全覆蓋基因的全部編碼序列和部分非轉(zhuǎn)錄區(qū)域，并設(shè)計(jì)上游引物包含部分內(nèi)含子，避免非特異性擴(kuò)增。共設(shè)計(jì)7對(duì)引物，引物由上海生物工程公司合成。Tm指PCR退火溫度，Dtm指DHPLC檢測(cè)溫度。反應(yīng)體系為25 μl:10 uM 正向及反向引物 0.5 μl;10ⅹbuffer 2.5 μl;10mMdNTP 0.5 μl;100%DMSO(二甲基亞砜)1.25 μl;Taq 酶(5U/μl)0.25;基因組 DNA 模板(50 ng/μl)2 μl;ddH2O 17 μl。循環(huán)參數(shù)為:95℃預(yù)變性5 min;94℃變性30s;58～61℃退火30s;72℃延伸30s;循環(huán)35次;72℃終延伸7min。PCR反應(yīng)在ABI PRISM3700型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行。擴(kuò)增完畢，取反應(yīng)產(chǎn)物5 μl與1 μl溴酚蘭加樣緩沖液充分混合后，加樣于2%瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣孔中電泳，電壓120V，電泳15 min，停止電泳后，紫外燈觀察結(jié)果并照相保存。使擴(kuò)增效率良好并具有重復(fù)性。

1.2.3 DHPLC分析 將 GATA4基因根據(jù) Gene-Bank中公布的標(biāo)準(zhǔn)序列引入WAVEnavigator軟件(美國(guó) Transgenomic公司)查找預(yù)測(cè)的融解溫度。首先分別在理想融解溫度±2℃范圍內(nèi)以不同的溫度進(jìn)行試驗(yàn)測(cè)定，試驗(yàn)確定最適實(shí)際融解溫度，以免遺漏DNA片段中的突變點(diǎn)，分析柱保留時(shí)間為8 min。

20 μl PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)PCR儀上95℃保留10 min變性后放入WAVE系統(tǒng)96孔反應(yīng)板上，進(jìn)樣、檢測(cè)和分析，根據(jù)樣本峰高幅度設(shè)定樣本吸取量，保持每個(gè)樣本峰值均達(dá)到5 MV左右。首先檢測(cè)了10個(gè)標(biāo)本GATA4基因的7個(gè)擴(kuò)增片段，證實(shí)峰型重復(fù)性佳后，再進(jìn)行全部患者及對(duì)照組的篩查。儀器用緩沖液包括A液:0.1 mol/L的三乙基胺乙酸鹽(Triethyl ammonium acetate，TEAA);B 液:0.1 mol/L的TEAA和25%的乙腈。根據(jù)不同片段的解鏈溫度，檢測(cè)系統(tǒng)將按線性遞增方式，以0.9ml/min的流速自動(dòng)將結(jié)合在檢測(cè)柱上的DNA分子洗脫下來(lái)，在260 nm處讀取吸光值，經(jīng)系統(tǒng)自動(dòng)處理后，信號(hào)被輸送到監(jiān)視屏上，形成DHPLC峰型圖譜。根據(jù)圖形重復(fù)性比對(duì)異常峰型。

重復(fù)擴(kuò)增有異常峰型的PCR產(chǎn)物，進(jìn)一步檢測(cè)驗(yàn)證，如重復(fù)出現(xiàn)異常峰型，PCR產(chǎn)物測(cè)序分析。對(duì)出現(xiàn)SNP的片段，將單一峰型樣品以2∶1與測(cè)序證實(shí)野生型樣品混合后預(yù)處理同前，DHPLC檢測(cè)，如出現(xiàn)異常峰型說(shuō)明為純合突變，仍為單一峰型為野生型。

1.2.4 測(cè)序分析 DHPLC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)的異常峰型標(biāo)本進(jìn)行DNA直接測(cè)序以明確序列變異的位點(diǎn)及類型;測(cè)序反應(yīng)所用測(cè)序儀器為ABI PRISM 3730，測(cè)序試劑為 BigDye terminator v3.1。

應(yīng)用Blast軟件將測(cè)序結(jié)果與GeneBank中的基因標(biāo)準(zhǔn)序列比照，應(yīng)用Chromas軟件對(duì)應(yīng)氨基酸序列比對(duì)可能引起的氨基酸序列改變。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 檢測(cè)到的多態(tài)位點(diǎn)按分類變量統(tǒng)計(jì)，基因型頻率及基因頻率組間差異應(yīng)用SPSS進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR結(jié)果 137例標(biāo)本經(jīng)PCR分段擴(kuò)增GA-TA4基因編碼序列，所有PCR結(jié)果經(jīng)過(guò)瓊脂糖電泳驗(yàn)證與DNA marker比照，各片斷的PCR反應(yīng)產(chǎn)物的長(zhǎng)度與所設(shè)計(jì)的各片斷大小預(yù)期值符合，特異性理想。

2.2 DHPLC檢測(cè)結(jié)果 取3例標(biāo)本在50℃非變性溫度下，檢測(cè)擴(kuò)增片段DHPLC分析效果，未見雜峰，分析效果佳，見圖1。

圖1 GATA4基因擴(kuò)增片段DHPLC未變性條件下反應(yīng)體系驗(yàn)證圖

經(jīng)DHPLC檢測(cè)，病例組及對(duì)照組GATA4exon1的S1和S2各出現(xiàn)兩種峰型，S1短片段異常峰型在對(duì)照組及病例組中多次出現(xiàn)。S2片段僅在一位法洛四聯(lián)癥患者父親有異常峰型，對(duì)照組中未發(fā)現(xiàn)此異常峰型，外顯子4片段病例組及對(duì)照組中均出現(xiàn)3種峰型:單峰、雙峰及四峰。重新進(jìn)行PCR擴(kuò)增具有異常峰型的樣品進(jìn)行DHPLC檢測(cè)，出現(xiàn)相同峰型，進(jìn)一步測(cè)序分析。

2.3 測(cè)序結(jié)果

2.3.1 基因錯(cuò)義突變 GATA4基因exon1 S2片段對(duì)應(yīng)的異常峰型測(cè)序證實(shí)為 c.-487C＞T(表2)。編碼鏈第487位堿基C轉(zhuǎn)換為T，導(dǎo)致163位密碼子由CCG轉(zhuǎn)換為CTG，編碼的氨基酸由脯氨酸轉(zhuǎn)換為絲氨酸P163S(p.Pro163Ser)，錯(cuò)義突變的測(cè)序見圖2。

表2 先心病患者父代GATA4基因變異情況

圖2 先心病患者父代GATA4基因錯(cuò)義突變測(cè)序圖

2.3.2 基因多態(tài)性 GATA4基因exon1 S1片段對(duì)應(yīng)的序列變異為編碼鏈第99位堿基由G轉(zhuǎn)換為T(c.-99G＞T)，導(dǎo)致33位密碼子由 GCG轉(zhuǎn)變?yōu)镚CT。由于第3個(gè)密碼子為簡(jiǎn)并密碼子，堿基替換后仍編碼Ala，所以事實(shí)上系同義突變(Ala33Ala)。

GATA4基因exon4發(fā)現(xiàn)兩種序列變異:雙峰對(duì)應(yīng)的序列變異為內(nèi)含子DNA序列第50745位堿基由A轉(zhuǎn)換為T，四峰對(duì)應(yīng)的序列變異為內(nèi)含子DNA序列50946位堿基由A轉(zhuǎn)換C，形成雜合子。SNP的測(cè)序圖見圖3。

圖3 先心病患者父代GATA4基因SNP測(cè)序圖

2.3.3 病例組和對(duì)照組父代基因型構(gòu)成比的比較 先心病父母組存在GATA4基因多態(tài)性，比較單核苷酸多態(tài)性在父母中的基因型和等位基因頻率，病例組與對(duì)照組沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)(表3)。

表3 CHD患者與正常對(duì)照組父代GATA4基因多態(tài)性基因型構(gòu)成比較

3 討論

本研究是國(guó)內(nèi)首次報(bào)道在先心病患者父親中也發(fā)現(xiàn)了心臟發(fā)育轉(zhuǎn)錄因子GATA4基因的Pro163Ser突變。GATA4基因在心肌細(xì)胞的表達(dá)是心肌細(xì)胞增殖、心內(nèi)膜墊形成、右室正常發(fā)育和流出道分隔形成所必須的。GATA4蛋白表達(dá)水平的微小變化就能顯著影響心臟形態(tài)和胚胎存活［2］。GATA4缺失的小鼠在胚胎發(fā)育第8～9天因心臟發(fā)育畸形而死亡，或由于胚胎腹側(cè)不能融合而出現(xiàn)心管分叉，形成兩個(gè)心管。Pro163Ser定位于GATA4基因的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域2(TAD2)，GATA4基因有兩個(gè)轉(zhuǎn)錄激活域(TAD)，兩個(gè)Ⅳ型鋅指結(jié)構(gòu)和一個(gè)核定位信號(hào)，功能分析認(rèn)為這兩個(gè)進(jìn)化中保守的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域在脊椎動(dòng)物發(fā)育過(guò)程中有重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。至今為止，僅Kayoko等［3］在TAD區(qū)域發(fā)現(xiàn)一個(gè)錯(cuò)義突變Ser52Phe。因此認(rèn)為這個(gè)區(qū)域的突變Pro163Ser可能是先心病的重要致病原因。

Rajagopal等［4］首次報(bào)道高加索患者 Pro163Ser突變時(shí)，檢測(cè)患者無(wú)心臟病史的父親血液基因組DNA，也檢測(cè)到相同Pro163Ser突變位點(diǎn)。本研究與國(guó)外報(bào)道相同，患者父親既往體格檢查未提示存在先心病，先心病患者血液基因組DNA也發(fā)現(xiàn)了Pro163Ser位點(diǎn)突變［5］。先心病患者所得到的遺傳信息一半來(lái)自父親，一半來(lái)自母親。因此先心病患者父母理論上可能攜帶相同的致病突變位點(diǎn)。Goldmuntz等［6］在法洛四聯(lián)癥患者患有室間隔缺損的一級(jí)親屬血液基因組NKX2.5基因突變檢測(cè)到與患者相同的突變。GATA4基因Pro163Ser突變可能作為外顯不全的突變位點(diǎn)，存在于患者一級(jí)親屬中。根據(jù)多基因遺傳病閾值理論解釋，單基因位點(diǎn)突變不一定導(dǎo)致先心病發(fā)生，可能需其他因素協(xié)同累計(jì)達(dá)到發(fā)病閾值。

本研究還檢測(cè)到3個(gè)新的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，一個(gè)位于外顯子區(qū)域Ala33Ala，在臨近外顯子4的內(nèi)含子區(qū)域也檢測(cè)到兩個(gè)單核苷酸多態(tài)性。3個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)查找dbSNP(NCBI)目前均未見報(bào)道。同義突變傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為未導(dǎo)致氨基酸一級(jí)結(jié)構(gòu)改變，不影響蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)，因而不致于引起蛋白功能變化，所以不會(huì)成為致病的原因。但近年來(lái)隨著對(duì)基因調(diào)控區(qū)、內(nèi)含子等翻譯區(qū)突變的研究，發(fā)現(xiàn)同義突變雖不引起氨基酸序列的改變，基因編碼區(qū)內(nèi)出現(xiàn)的同義突變可由于同義密碼子的使用偏性，導(dǎo)致翻譯效率不同或轉(zhuǎn)錄水平差異而導(dǎo)致蛋白質(zhì)表達(dá)量上的改變。Evans等［7］發(fā)現(xiàn)編碼P－糖蛋白的ABCB1基因第26外顯子上的同義突變C3435T可以使地高辛的生物利用率明顯升高。鈣敏感受體基因CaSRintron5多態(tài)性影響血清Ca2+的濃度，對(duì)甲狀旁腺功能亢進(jìn)的嚴(yán)重程度有作用。密碼子同義突變不但改變mRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)，還會(huì)影響mRNA的降解速率。對(duì)于含CG豐富的mRNA，降解速率明顯慢于含AT豐富的mRNA，這可能與CG間有著更強(qiáng)的結(jié)合能有關(guān)［8-9］。因此，同義突變可能通過(guò)轉(zhuǎn)錄后水平，翻譯后修飾等環(huán)節(jié)來(lái)影響蛋白質(zhì)功能導(dǎo)致疾病發(fā)生。通過(guò)比較先心病病例組與對(duì)照組基因型和等位基因頻率，無(wú)顯著性差異，按CHD類型分型再比較，病例組與對(duì)照組相比差異也沒(méi)有顯著性。但由于樣本量較少，還有待于進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量分析?；蛐蜆?gòu)成分析顯示符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。表明本研究對(duì)照的位點(diǎn)多態(tài)性已達(dá)到遺傳平衡，有群體代表性。

本研究在GATA4基因的外顯子邊緣的內(nèi)含子區(qū)域位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)2個(gè)堿基轉(zhuǎn)換和顛換S50745A＞T及S50946A＞C。有證據(jù)表明，曾被認(rèn)為是無(wú)編碼意義和無(wú)確切生物功能的內(nèi)含子，雖然在mRNA加工過(guò)程中被剪切掉，但仍具有其特定的功能，至少在維持mRNA前體穩(wěn)定性、翻譯和轉(zhuǎn)錄過(guò)程的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用［10］，甚至在進(jìn)化過(guò)程中承受一定的選擇壓力。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)在先心病患者正常的一級(jí)親屬中也可以存在GATA4基因的Pro163Ser突變位點(diǎn)。隨著基因組研究的發(fā)展，有望可以發(fā)現(xiàn)所有父母攜帶的可能對(duì)先心病發(fā)病有影響的基因變異，進(jìn)一步提高先心病的產(chǎn)前診斷和優(yōu)生優(yōu)育。

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