RP- HPLC法測量藥物有關(guān)物質(zhì)的不確定度評定

樂立源，葛朝霞

（邵陽市食品藥品檢驗所，湖南 邵陽 422001）

高效液相色譜法被廣泛應(yīng)用于藥品的有關(guān)物質(zhì)檢查中，由于本法不需要雜質(zhì)對照品，當(dāng)無法獲得雜質(zhì)對照品時，本法成為最佳檢查計算有關(guān)雜質(zhì)的含量的方法。不加校正因子的主成分自身對照法可以解決面積歸一化法中可能出現(xiàn)的儀器檢測范圍和線性范圍問題，而且操作簡單、運(yùn)算方便，無需雜質(zhì)對照品；缺點(diǎn)是本法會存在稀釋步驟、進(jìn)樣針和進(jìn)樣閥殘留、進(jìn)樣誤差等影響因素，往往也會導(dǎo)致計算出的雜質(zhì)與真實含量之間存在一定的誤差［3］。而一般有關(guān)物質(zhì)檢查限度通常較低，大多數(shù)為1%左右。面對這樣一個限度值，什么樣的檢出數(shù)值才是可信值，誤差范圍有多大，什么樣的結(jié)果才能放心發(fā)出報告，本文試著從測量不準(zhǔn)確度方向出發(fā)，分析有關(guān)物質(zhì)結(jié)果誤差范圍的問題，償試找出誤差原因，為藥檢所日常檢驗提供依據(jù)。

1 測量原理及方法

有關(guān)物質(zhì)檢查所用的方法多為藥典附錄VE第四法“不加校正因子的主成分自身對照法”。不加校正因子的主成分自身對照法本法是配制一個濃度與雜質(zhì)限度相當(dāng)?shù)墓┰嚻啡芤鹤鳛閷φ杖芤海话闶怯晒┰嚾芤褐苯酉♂尩玫?，通常稀?00倍（限度1%）。對照溶液有二個用途：一是用來調(diào)節(jié)儀器的靈敏度，二是用于與供試品溶液色譜圖上的雜質(zhì)峰面積進(jìn)行比較（相當(dāng)于一個外標(biāo)），以計算雜質(zhì)的含量。

2 數(shù)學(xué)模型

其中X——藥品中所含有關(guān)雜質(zhì)比例（百分比）；

A雜——藥品中檢出有關(guān)雜質(zhì)峰峰面積（mAU＊sec）；

A標(biāo)——標(biāo)準(zhǔn)溶液中主成分峰峰面積（mAU＊sec）；

F——對照溶液的稀釋倍數(shù)。

3 不確定度來源分析

由公式1得知，測量藥品中有關(guān)物質(zhì)的量的不確定度主要來源于幾個方面：①重復(fù)性測量所得到的不確定度（Ur（R））；②對照溶液稀釋過程引入的不確定度（Ur（V））；③測量儀器帶來的不確定度（Ur（A））；④樣品均勻性引入的不確定度（Ur（U））。

4 不確定度各分量的評定

4.1 重復(fù)測量引入的不確定度評定

測量過程中的隨機(jī)因素對測量結(jié)果反映在一組重復(fù)性測量的條件下獲得的觀測列中，通過這樣一組觀測列可以計算由重復(fù)性引入的不確定度。本實驗按照藥典標(biāo)準(zhǔn)方法 對某一樣品進(jìn)行10次重復(fù)檢測，測量結(jié)果見表1。

表1 藥品有關(guān)物質(zhì)檢測結(jié)果

一般來說，有關(guān)物質(zhì)檢查都是以兩次測量結(jié)果的平均值計算的，故重復(fù)檢測引入的不確定度為：

重復(fù)性測量引起的相對不確定度為：

4.2 稀釋倍數(shù)引入的不確定度

對照溶液的配制是在室溫（10℃～30℃）條件下配制的，溫度呈均勻分布，根據(jù)經(jīng)驗可知，溫度引入的不確定度較小，可以忽略不計；此過程的不確定度主要由稀釋過程中使用容器或量器引入的，主要稀釋步驟如下：

對照溶液的配制：用1mL的移液管量取供試溶液1.00mL，用流動相定容至100mL容量瓶中，得到對照溶液。

由此可知，對照溶液稀釋過程中引入的不確定度分量主要有以下幾個方面：

UV1：對照溶液配制過程中使用1mL移液管引入的不確定度；

UV2：對照溶液配制過程中使用100mL容量瓶引入的不確定度；

在實驗中使用的均為A類玻璃器具，根據(jù)JJG-196-2006《常用玻璃儀器檢定規(guī)程》［4］規(guī)定：1mL移液管容量允許誤差為±0.007mL；100mL容量瓶容量允許誤差為±0.01mL。不確定度評定中，一般采用三角分布，K ＝，則標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制過程中各種量器引入的相對不確定度為：

合成配制過程中量器引入的相對不確定度為：

4.3 測量儀器帶來的不確定度

根據(jù)JJG705-2002《液相色譜儀檢定規(guī)程》［5，6］高效液相色譜儀帶來的誤差最大不超過±3%。不確定度評定中，一般采用矩形分布，K ＝，則液相色譜儀引入的不確定度為

4.4 樣品不均勻性引入的不確定度

不均勻性體現(xiàn)了樣品特性量值存在分散性，可以通過一個修正因子來反映，數(shù)學(xué)期望值應(yīng)為1，但其不確定度卻不為零，同批內(nèi)藥品質(zhì)量相對一致，而通過重復(fù)測量應(yīng)已把不均勻性引入的不確定度包含在內(nèi)，故不確定度不再計算。

5 計算合成不確定度

計算合成相對不確定度為：

計算合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

6 擴(kuò)展不確定度

取包含因子K＝2，計算擴(kuò)展不確定度：

7 檢測結(jié)果與報告表示

檢得有關(guān)物質(zhì)結(jié)果可以表示如下：

8 討論

從測量不確定度結(jié)果可以得出，檢測結(jié)果為1%，不確定度帶來的誤差可達(dá)到0.074%之多，約占結(jié)果的7.4%，換而言之，如果測量結(jié)果出現(xiàn)在（0.926%，1.074%）區(qū)間內(nèi)，那么這個結(jié)果一定是可疑值，也就是藥檢系統(tǒng)常說的邊緣值，如果要發(fā)出這樣的報告書，所要遇到的報告書錯發(fā)風(fēng)險將是最大的。將各不確定度分量繪圖（見圖1）。

圖1 不確定度分量

由圖1可以看到，稀釋過程引入的不確定度分量最小，儀器因素與重復(fù)測量所引入不確定度對總不確定度貢獻(xiàn)最大。試分析這兩個因素：儀器因素完全取決于儀器本身精度與日常維護(hù)，液相色譜儀每年的計量檢定與期間核查是儀器是否工作正常的最大保障。重復(fù)測量因素取決于兩點(diǎn)人員操作。人員操作因素關(guān)鍵在于實驗室規(guī)范操作與人員素質(zhì)，相信這個相對于大多數(shù)藥檢所來說已經(jīng)不是問題。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典 ［M］.北京：中醫(yī)藥科技出版社，2005：149.

［2］JJF1059-2010測量不確定度評定與表示 ［S］.2010.

［3］余振喜，庚莉菊，黃海偉，等.淺談HPLC法測定有關(guān)物質(zhì)時已知雜質(zhì)的計算方法［J］.中國藥品標(biāo)準(zhǔn)，2010，11（4）：278-282.

［4］JJG-196-2006常用玻璃儀器檢定規(guī)程 ［S］.2006.

［5］JJG705-2002液相色譜儀檢定規(guī)程 ［S］.2002.

［6］鄭宗寅，吳惠英.液相色譜儀測量結(jié)果的不確定度評定 ［J］.科技創(chuàng)新導(dǎo)報，2010，12（4）：45.