游泳運動對衰老大鼠學習記憶及海馬CA1、CA3、DG區(qū)nNOS表達的影響

崔建梅，付 芳，賀繼平，宋憲強，于 芳

隨著年齡的增大，機體各臟腑器官功能逐漸退化，使老年人對外界環(huán)境改變的應激能力明顯降低，記憶功能逐漸減弱，學習記憶隨著機體的老化，出現(xiàn)腦老化。腦老化即腦認知功能下降、減退，初期最典型的表現(xiàn)是記憶力下降，極端形式是老年癡呆。此病是以學習記憶能力減退、認知功能下降為主要表現(xiàn)的慢性腦組織退行性疾病，是繼心臟病、癌癥、腦卒中之后的第4位致死原因[1]。腦老化至今病因未明，普遍認為其形成主要與遺傳因素、氧化損傷、神經(jīng)細胞凋亡、腦組織缺血缺氧等因素關系密切。運動作為預防和延緩腦衰老的方法之一越來越受到人們的重視。多數(shù)研究表明，合理的運動能夠促進新陳代謝、增強活力、改善心血管功能、提高機體免疫力，從而延緩衰老、延長壽命。并且長期慢性運動可以延緩與衰老相關的精神功能的減退，對學習記憶有良好的影響[2]，但是具體機制尚不清楚。

大量研究表明，衰老使機體抗氧化能力降低，導致自由基異常堆積，與衰老所致的記憶力減退有關[3]。海馬（Hippocampus）是大腦邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，在信息處理中起著重要作用，是研究動物和人類學習記憶功能的經(jīng)典腦區(qū)，又是最易受衰老影響的腦區(qū)之一[4]。依據(jù)細胞形態(tài)、不同皮質區(qū)發(fā)育的差異及纖維排列不同可將海馬劃分為4個不同區(qū)域：CAl、CA2、CA3和DG區(qū)。不同區(qū)域的功能不盡相同，海馬的CAl、CA3、DG區(qū)在學習記憶中擔負著尤其重要的作用[5-6]。中樞乙酰膽堿（ACh）是參與學習記憶的重要神經(jīng)遞質，海馬-邊緣系統(tǒng)中有豐富的膽堿能纖維和膽堿敏感細胞及受體，與學習記憶密切關系[7]。乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesteras，AchE）作為Ach的重要水解酶，其活性的改變可間接反映膽堿能神經(jīng)元活性的變化。一氧化氮（nitric oxide，NO）在記憶的形成中起逆向信使作用，參與長時程增強LTP的形成。在正常生理情況下，神經(jīng)元型一氧化氮合酶（nNOS）催化產(chǎn)生的NO作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞的信使分子，在學習記憶機制中具有重要作用[8]。以上資料表明：衰老導致學習記憶能力下降可能與腦自由基、中樞神經(jīng)遞質Ach水平及腦組織NO水平有關，但是神經(jīng)遞質Ach與腦自由基及海馬CAl、CA3、DG區(qū)nNOS的關系，以及長期游泳運動改善衰老大鼠學習記憶的機制尚不清楚。而且以往的研究對象主要是藥物致大鼠衰老模型，且同時涉及海馬3區(qū)（CAl、CA3、DG）的研究較少?；谶@方面的考慮，本研究以海馬CAl、CA3、DG區(qū)為研究重點，測試自然衰老大鼠游泳運動8周后空間學習記憶能力、腦自由基（SOD、GSH-px、MDA）、乙酰膽堿酯酶（AchE）活性及海馬 CAl、CA3、DG區(qū)nNOS的變化，探討游泳運動提高衰老大鼠學習記憶能力的可能機制。

1 材料及方法

1.1 動物及分組

健康老年SD大鼠40只（24月齡），雌雄各半，體重330～350 g；成年組20只（3月齡），體重220～250 g，均購于山西醫(yī)科大學動物飼養(yǎng)中心。常規(guī)分籠（每籠2～3只），標準嚙齒類飼料常規(guī)喂養(yǎng)，自由進食飲水，室溫21℃～25℃，濕度50%～60%，通風良好，自然光照。將40只衰老大鼠隨機分為2組，即衰老對照組（aging control group，AC）、衰老運動組（aging exercise group，AE），每組20只。成年對照組（adult control group，C）20只，其中10只用于腦自由基（SOD、GSH-Px、MDA）及AchE活性的測試，其余10只用于海馬CAl、CA3、DG區(qū)nNOS的測試。

1.2 試 劑

超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽合成酶（GSH-px）、丙二醛（MDA）、乙酰膽堿酯酶（AchE）及nNOS測定試劑盒均由武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)。

1.3 訓練方案

成年對照組、衰老對照組不施加任何干擾因素，籠中自由飲食、飲水、自由活動。衰老運動組游泳8周，運動負荷參照徐波等游泳訓練方法，且略加改動[9]。衰老運動組適應性訓練3 d，正式實驗時，大鼠每周一至周六（約 18：00～20：00）進行 60 min/次的無負重游泳訓練，后4周訓練每周遞增15 min，共8周，游泳水溫（30±1）℃。

1.4 八臂迷宮實驗程序

所有大鼠在第9周周五進行八臂迷宮實驗。實驗前大鼠先在迷宮中適應2 d，每天2次（第8周周六、周日），適應時3～4只大鼠同時置于迷宮中，自由活動和攝取食物10 min。第9周周一、周二進行每天2次的訓練，訓練時只有固定的四臂2、4、6、8號臂中放置餌片，該次序在整個實驗過程維持不變，任其在迷宮中尋找食物10 min。正式實驗前2天所有大鼠限制飲食，第9周周五正式實驗，正式實驗時2、4、6、8號臂放置食物，大鼠放于迷宮中央?yún)^(qū)平臺，用一玻璃罩蓋住，并將通往8個臂的口堵住，15 s后開放洞口并開啟分析測試軟件，測試定時10 min。大鼠可自由選擇進入任意一臂以攝取食物，大鼠進入有食物的臂且攝取食物為1次正確選擇，否則為錯誤選擇。分析軟件分析記錄大鼠錯誤選擇的次數(shù)，錯誤選擇次數(shù)分為工作記憶錯誤（working memory error，WME）：大鼠重新進入放食物臂或第一次進入放食物臂而不攝取食物的次數(shù)；參考記憶錯誤（reference memory error，RME）：大鼠進入不放食物臂的次數(shù)；總記憶錯誤（total error，TE）：WME、RME 兩者之和。每只大鼠上、下午各測試1次，共2次，取平均值進行統(tǒng)計分析。

1.5 腦自由基及乙酰膽堿酯酶活性測試

八臂迷宮行為測試后第2天，將每組大鼠取10只斷頭處死，迅速取出腦組織，將腦組織制成10%的組織勻漿上清液，用冷生理鹽水按1∶9稀釋成10%組織勻漿，3 000～4 000 r/min車速離心15 min，取上清液進行 SOD、GSH-px、MDA及乙酰膽堿酯酶（AchE）的測定，按試劑盒說明書測定各個指標的活性及含量。

1.6 腦組織取材與切片

八臂迷宮行為測試后第2天，將每組剩余10只大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉（2%，40 mg/kg）腹腔注射麻醉，打開胸腔，刺針插入心臟至升主動脈，迅速剪破右心耳，快速灌入300 mL冷生理鹽水，隨即灌入300 mL 4%多聚甲醛（先快后慢）進行前固定，再以10%蔗糖磷酸緩沖液灌入300 mL，至肝臟變硬變白為止。最后迅速取腦，取出后放在上述相同4℃固定液中固定2 h，再浸入含20%蔗糖的PBS溶液中4℃保存過夜，待組織完全下沉后冷凍切片，隔4取1，片厚40μm。

1.7 ABC免疫組織化學染色

腦切片經(jīng)Triton X-100（0.5%，37℃）PBS磷酸緩沖液孵育40 min，0.01M PBS液漂洗3次后入0.3%雙氧水PBS液中孵育15min。然后加入正常山羊血清（1∶60）工作液孵育1h，再加入nNOS血清兔抗大鼠第一抗體37℃孵育5 h。后加入生物素羊抗兔第二抗體37℃孵育40 min，DAB呈色20 min，然后置入0.2%明膠溶液裱片，酒精梯度脫水、透明、封片。

1.8 圖像分析和統(tǒng)計學處理

用數(shù)碼生物顯微鏡（德國Leica）和JD－801（江蘇捷達）顯微圖像分析軟件，參照大鼠腦立體定位圖譜確定大鼠海馬CA1、CA3、DG區(qū)的位置（見圖1、圖2），測定海馬以上3區(qū)nNOS陽性神經(jīng)元的表達。每組大鼠各隨機選取雙側海馬CA1、CA3、DG區(qū)nNOS的切片20張，10×40倍光鏡下計數(shù)nNOS陽性神經(jīng)元的個數(shù)、面積和灰度。

圖1 大鼠腦切片，箭頭所示海馬CA1/CA3/DGFigure1 the brain slices of rats，Hippocampu CA1/CA3/DG

圖2 海馬CA1/CA3/DG區(qū)nNOS陽性神經(jīng)元（×100）Figure2 the distribution of the nNOS within CA1/CA3/DG（×100）in the Hippocampus

采用SPSSl7．0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，采用單因素方差分析法（ANOVE）對組間差異進行統(tǒng)計，P＜0．05有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結果

2.1 大鼠八臂迷宮行為測試結果

圖 3 結果顯示：與成年對照組（360．32±87．89）s比較，衰老對照組（527．45±103．56）s完成八臂迷宮時間顯著延長（P＜0．01），平均延長 167．13 s。衰老對照組工作記憶錯誤次數(shù)（6．01±2．56次，WME）顯著增多（P＜0．01），平均增加 3 次；參考記憶錯誤次數(shù)（5．65±2．65 次，RME）顯著增多（P＜0．01）；總錯誤次數(shù)（11．66±4．53 次，TE）遠遠高于成年對照組（P＜0．01），平均增加 7．21 次。而衰老運動組與成年對照組比較，完成八臂迷宮時間顯著延長（P＜0．05），平均延長 75．11 s；RME（3．75±1．42 次）顯著增多（P＜0．05），WME 增多，但沒有顯著差異（P＞0．05），TE 顯著高于成年對照組（P＜0．05），平均增加 3．75 次。

與衰老對照組比較，衰老運動組RME及TE均顯著減少（P＜0．05，P＜0．01），總錯誤次數(shù)比衰老對照組減少 3．46 次；WME（4．65±1．76 次）減少，但沒有顯著差異（P＞0．05）。完成八臂迷宮的時間比衰老對照組顯著縮短（P＜0．05），減少 92．02 s。表明長期游泳運動可以改善衰老大鼠的學習記憶能力。

圖3 大鼠八臂迷宮測試結果Figure3 Results of 8-arms radial maze in rats

2.2 大鼠腦自由基及AchE活性測試結果

與成年對照組比較，衰老對照組大鼠超氧化物歧化酶（SOD）及谷胱甘肽過氧化物（GSH－Px）活性顯著減弱（P＜0．01），SOD 活性下降 28．11 nU/mL，GSH－Px 活性下降 1．68 μmol/mg；丙二醛（MDA）含量增多（P＜0．01），平均增加 2．08 nmol/mL。與衰老對照組比較，衰老運動組大鼠SOD活性顯著增強（P＜0．01），平均增加11．47 nU/mL；GSH－Px活性增強，但沒有顯著差異（P＞0．05）；MDA 含量顯著下降（P＜0．05），平均減少 1．4 nmol/mL。表明長期規(guī)律的、維持一定時間的游泳運動可有效地增加衰老大鼠腦組織的抗氧化能力（見表1）。

與成年對照組比較，衰老對照組及衰老運動組大鼠AchE活性均顯著增強（P＜0．01，P＜0．05），衰老對照組平均增加34．34 μ/g。與衰老對照組比較，衰老運動組大鼠AchE活性顯著減弱（P＜0．01），平均降低 15．91 μ/g，降低幅度 12%（見表 1）。表明長期游泳運動可減弱衰老大鼠腦組織的AchE活性，從而增加大腦乙酰膽堿的含量，改善衰老大鼠學習記憶能力。

表1 大鼠腦自由基及AchE活性測試結果一覽表（±s，n=10）Table1 Results of brain free radical and AchE activities in rats（±s，n=10）

表1 大鼠腦自由基及AchE活性測試結果一覽表（±s，n=10）Table1 Results of brain free radical and AchE activities in rats（±s，n=10）

注：##P＜0.01，#P＜0.05，與成年對照組比較；**P＜0.01，*P＜0.05，與衰老對照組比較（下同）。

組別 AChE/μ·g-1 MDA/nmol·mL-1 GSH-px/μmol·mg-1 SOD/nU·mL-1成年對照組 96.02±23.56 2.05±0.32 4.50±1.03 68.67±8.96衰老對照組130.36±20.36##4.13±0.72##2.92±0.53##40.56±6.89##衰老運動組114.45±34.21##*2.73±0.88#*3.23±3.03##52.03±4.56##**

2.3 各組大鼠海馬CA1區(qū)nNOS神經(jīng)元圖像分析結果

海馬CA1、CA3及DG區(qū)nNOS陽性表達產(chǎn)物為深褐色，呈錐形或卵圓形，染色均勻，主要位于神經(jīng)元的胞體和突起的胞漿內，但細胞核未被染色，突起較明顯（見圖4－6）。

圖4 海馬CA1區(qū)nNOS陽性神經(jīng)元分布Figure4 The distribution of the nNOS immunoreactive neurons in the Hippocampus CA1

圖5 海馬CA3區(qū)nNOS陽性神經(jīng)元分布Figure5 The distribution of the nNOS immunoreactive neurons in the Hippocampus CA3

圖6 海馬DG區(qū)nNOS陽性神經(jīng)元分布Figure6 The distribution of the nNOS immunoreactive neurons in the Hippocampus DG

衰老對照組及衰老運動組大鼠海馬CA1區(qū)nNOS免疫陽性細胞數(shù)量及面積均顯著低于成年對照組（P＜0．01，P＜0．05），灰度差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）；經(jīng)過8周游泳運動，衰老運動組大鼠海馬CA1區(qū)免疫陽性細胞數(shù)量和面積表達均增加（P＜0．05），灰度增加，但無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）（見表 2）。

表2 各組大鼠海馬CA1區(qū)nNOS神經(jīng)元圖像分析結果（±s，n=10）Table2 Results of Image Pattern Analysis of nNOS Immune Positive Cells in the Hippocampus CA1 of rats（±s，n=10）

表2 各組大鼠海馬CA1區(qū)nNOS神經(jīng)元圖像分析結果（±s，n=10）Table2 Results of Image Pattern Analysis of nNOS Immune Positive Cells in the Hippocampus CA1 of rats（±s，n=10）

組別 統(tǒng)計片 面積/μm2 個數(shù)/個 灰度成年對照組 20 760.68±121.36 7.32±1.25 103.21±21.95衰老對照組 20 348.34±79.45##3.28±0.79##98.78±10.64衰老運動組 20 568.34±133.58#*5.32±1.24#*101.38±15.68

2.4 各組大鼠海馬CA3區(qū)nNOS神經(jīng)元圖像分析結果

衰老對照組及衰老運動組大鼠海馬CA3區(qū)nNOS免疫陽性細胞數(shù)量及面積均顯著少于成年對照組（P＜0．01，P＜0．05），灰度差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）；經(jīng)過8周游泳運動，衰老運動組大鼠海馬CA3區(qū)nNOS免疫陽性細胞數(shù)量和面積表達均增加（P＜0．05），灰度差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）（見表 3）。

表3 各組大鼠海馬CA3區(qū)nNOS神經(jīng)元圖像分析結果（±s，n=10）Table3 Results of Image Pattern Analysis of nNOS Immune Positive Cells in the Hippocampus CA3 of rats（±s，n=10）

表3 各組大鼠海馬CA3區(qū)nNOS神經(jīng)元圖像分析結果（±s，n=10）Table3 Results of Image Pattern Analysis of nNOS Immune Positive Cells in the Hippocampus CA3 of rats（±s，n=10）

組別 例數(shù) 統(tǒng)計片 面積/μm2 細胞個數(shù) 平均灰度成年對照組 10 20 565.92±78.41 5.24±1.34 109.14±17.54衰老對照組 10 20 264.62±95.05##2.45±1.9##95.57±12.57衰老運動組 10 20 339.12±69.43#*3.14±0.85#*103.36±24.16

2.5 各組大鼠海馬DG區(qū)nNOS神經(jīng)元圖像分析結果

衰老對照組及衰老運動組海馬DG區(qū)nNOS免疫陽性細胞數(shù)量及面積均顯著低于成年對照組（P＜0．01），灰度值顯著降低（P＜0．01）；經(jīng)過8周游泳運動，衰老運動組大鼠海馬DG區(qū)nNOS免疫陽性細胞數(shù)量和陽性產(chǎn)物面積表達均增加（P＜0．05），灰度值顯著增加（P＜0．01）（見表 4）。

表4 各組大鼠海馬DG區(qū)nNOS神經(jīng)元圖像分析結果（±s，n＝10）Table4 Results of Image Pattern Analysis of nNOS Immune Positive Cells in the Hippocampus DG of rats（±s，n＝10）

表4 各組大鼠海馬DG區(qū)nNOS神經(jīng)元圖像分析結果（±s，n＝10）Table4 Results of Image Pattern Analysis of nNOS Immune Positive Cells in the Hippocampus DG of rats（±s，n＝10）

組別 統(tǒng)計片 面積/μm2 細胞個數(shù) 平均灰度成年對照組 20 1638.23±321.41 13.24±4.32 86.14±17.56衰老對照組 20 1034.62±195.05##8.56±1.19##78.57±12.58##衰老運動組 20 1339.12±169.49#*11.14±0.85#*82.36±24.16**

3 討 論

3.1 游泳運動對衰老大鼠大腦乙酰膽堿酯酶活性及學習記憶能力的影響

中樞膽堿能系統(tǒng)被認為是構成學習記憶的重要通路。Ach是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內從事和維持高級神經(jīng)功能活動的一類重要的神經(jīng)遞質，它廣泛分布于海馬、腦干網(wǎng)狀結構、紋狀體、邊緣系統(tǒng)、杏仁核等，Ach的不足直接影響中樞膽堿能通路（學習記憶的主要通路）。DEUTSCH等通過動物實驗發(fā)現(xiàn)，乙酰膽堿與學習、記憶的形成和儲存有關[10]。ZHANGW等發(fā)現(xiàn)給動物注射擬膽堿藥物能提高老年大鼠學習記憶能力，而抗膽堿藥物則減弱大鼠學習記憶能力[11]。Ach是由膽堿乙?；负铣桑憠A酯酶（AchE）分解，通過乙酰膽堿受體發(fā)揮生物效應。由于Ach性質極不穩(wěn)定，容易水解，極難準確測定其含量，而AchE是Ach的降解酶，測定腦組織中AchE的活性，可判斷腦內Ach含量的變化。因此，目前許多研究均以AchE活性作為反映中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)功能狀態(tài)的重要指標[12]，AchE活性增高反映機體體內Ach含量不足。本實驗發(fā)現(xiàn)，衰老大鼠腦組織中AchE明顯升高，可能會引起Ach含量不足，與JHA等研究結果一致[13]。

學習記憶是腦的高級功能，是衡量人類智能發(fā)育的重要指標。衰老是一種正常而復雜的生物學過程，在衰老過程中，機體出現(xiàn)各種功能下降及生理紊亂現(xiàn)象，學習記憶伴隨著機體的老化，也明顯減退。目前，從整體水平上研究動物學習記憶能力的實驗模型有多種，八臂迷宮已被公認為一種檢測大鼠空間記憶能力的常用實驗裝置，它由一個中心區(qū)和其周圍連接的八條臂組成。它需要大鼠在多次的訓練中，通過觀察周圍一些固定的參照物來學習和記憶自身與置于迷宮臂末端的白色小食丸——食餌的相對位置，獲得辨別空間方位的能力[14]。（1）參考記憶錯誤，反應了大鼠尋找食物的空間認知能力和遠記憶情況。如果大鼠具有良好的空間認知能力，就能根據(jù)迷宮周圍的參照物，能夠有效地尋找到食物。（2）工作記憶錯誤，反應了大鼠近記憶情況，如果大鼠近記憶良好，在尋找到食物后會立即進食，且進食后不會再返回重新攝食。本研究采用八臂迷宮實驗法對老齡大鼠學習記憶功能進行觀察。結果發(fā)現(xiàn)：與成年對照組比較，衰老對照組完成八臂迷宮時間延長167．13 s，工作記憶錯誤次數(shù)平均增加3次，說明衰老大鼠隨著年齡的增長，學習記憶功能嚴重下降。這可能與衰老大鼠AchE活性增強有關，AchE的經(jīng)典作用是使Ach分解生成膽堿和乙酸，在終止神經(jīng)傳遞中起重要作用，保持其功能正常是學習記憶的必要條件[15]。本實驗中，AchE活性異常增高，造成腦內Ach含量下降，引起膽堿能投射系統(tǒng)傳遞功能減弱，可能是導致衰老大鼠學習及記憶能力發(fā)生障礙的一個重要原因，與FUKUI[16]研究結果一致。運動作為一種抗衰老的手段已有近百年的歷史。研究認為，經(jīng)常進行體育運動能改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)的機能，促進智力的發(fā)展，使記憶的物質基礎發(fā)生變化，增強人的記憶力，提高大腦的工作效率，延緩大腦衰老[17]。本實驗得出相同結果，與衰老對照組比較，經(jīng)過8周游泳運動的衰老大鼠進入不放食物臂的次數(shù)及總錯誤次數(shù)顯著減少，總錯誤次數(shù)平均減少2次。表明可能長期游泳運動能減弱大鼠大腦AchE活性，使Ach分解減少，改善膽堿系統(tǒng)功能，進而改善衰老大鼠學習記憶能力下降及衰老健忘等癥狀。

3.2 游泳運動對衰老大鼠大腦自由基活性的影響

衰老的自由基理論認為衰老是細胞成分積累性氧化損傷的結果，是由自由基反應引起的，自由基反應引起環(huán)境、疾病和遺傳控制的與衰老過程有關的衰老性改變[18]。研究表明，老年人在增齡的過程中，人體的防御功能減弱，腦自由基的清除能力降低，這些自由基能損傷細胞膜、細胞器，誘導神經(jīng)元凋亡，導致其功能嚴重破壞，從而使學習記憶能力下降，進而引起AD[19]。SOD和GSH－Px是機體2種重要的抗氧化酶，SOD能催化超氧陰離子生成過氧化氫，而GSH－Px則能迅速清除過氧化氫。MDA是脂質過氧化物的代謝產(chǎn)物，可間接反映自由基對機體的損傷程度。因此MDA和SOD可間接反映腦組織中氧自由基含量的變化和腦組織的損傷程度，是反映機體衰老情況的指標。本實驗研究顯示：衰老對照組大鼠腦組織中的SOD及GSH-px活性較成年對照組明顯降低，SOD平均降低28.11 nU/mL，降低幅度為41%；GSH-px平均降低 1.58μmol/mg，MDA含量顯著增加，平均增加2.08 nmol/mL，表明衰老大鼠機體抗氧化、清除自由基的能力嚴重受損。多數(shù)研究表明：AB蛋白在突觸可塑性和早期記憶功能的損害中發(fā)揮重要作用[20]；而氧自由基能促進AB的毒性和聚集，使其在腦內過度活躍，誘導神經(jīng)元凋亡，可能損傷膽堿能神經(jīng)元[21]，從而導致衰老，使學習記憶能力下降，可能是腦自由基導致學習記憶能力下降的機制之一。研究認為，長期有氧訓練有利于促進自由基的消除，抑制增齡引起的抗氧化能力降低，調節(jié)機體氧化系統(tǒng)的平衡，對機體產(chǎn)生有益影響，這是運動延緩腦衰老的主要機制之一[22]。本實驗也證實了這一點，衰老大鼠經(jīng)過8周游泳運動使腦組織中SOD活性顯著增強，MDA含量明顯下降，表明長期游泳運動可提高機體的抗氧化能力，保護神經(jīng)細胞，從而增強衰老大鼠學習記憶能力，但具體機制有待于進一步研究。

3.4 游泳運動對衰老大鼠海馬CA1、CA3、DG區(qū)nNOS表達的影響

海馬是學習記憶的重要區(qū)域，在衰老過程中海馬等結構功能紊亂是學習記憶能力降低的重要原因[23]。海馬神經(jīng)元的長時程增強作用（LTP）是學習記憶的神經(jīng)生物學基礎，是由相互聯(lián)系的CA1、CA3和DG區(qū)等多個區(qū)域組成，且海馬CA1、CA3和DG區(qū)是LTP形成及學習記憶的重要部位，在學習記憶中擔負著尤其重要的作用[24-25]。NO作為一種神經(jīng)遞質在神經(jīng)元之間起信息傳遞作用，參與學習記憶、神經(jīng)遞質的釋放、突觸傳遞及腦內局部血流量的調節(jié)等許多生理過程[26]。NAHID等研究認為海馬NO的合成對大鼠空間記憶的形成或許是一個很關鍵的因素[27]。PAUL等研究發(fā)現(xiàn)衰老大鼠學習記憶減退與海馬NOS活性降低及NO合成減少有關，注射L-精氨酸可以通過增加海馬NO的含量改善大鼠的學習記憶能力[28]。KIRCHNER等在水迷宮室驗中發(fā)現(xiàn)nNOS敲除的小鼠認知功能顯著削弱[29]。

已有資料表明：大鼠學習記憶過程中其腦組織NO和NOS神經(jīng)元出現(xiàn)上調，衰老大鼠NO產(chǎn)生不足可能引起大鼠空間學習記憶能力的衰退。本實驗得到相同結果，衰老對照組nNOS顯著減少，說明衰老大鼠空間學習記憶障礙至少部分是由于損害海馬一氧化氮合酶神經(jīng)元導致NO生成減少所致；而衰老運動組大鼠游泳運動8周后，海馬CA1、CA3、DG區(qū)內nNOS陽性細胞及面積明顯增多。表明衰老大鼠長期游泳運動提高學習記憶能力可能與海馬CA1、CA3及DG區(qū)nNOS表達增強有關，但海馬nNOS增強的機制仍不清楚。可能由于長期游泳運動使谷氨酸和鈣離子內流，激活nNOS使海馬CA1、CA3、DG區(qū)NO增多。NO在誘導與學習記憶密切相關的長時程增強（LTP）過程中起重要作用。研究認為：nNOS對誘導海馬LTP是必需的，采用nNOS抑制劑7-硝基吲唑可阻斷LTP的形成[30]，長期游泳運動激活nNOS催化L-精氨酸產(chǎn)生NO[31]。NO作為逆向信使擴散至突觸前膜使可溶型鳥苷酸環(huán)化酶（sGC）活化，增加突觸前環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）含量，促進突觸前谷氨酸（Glu）的釋放，谷氨酸再作用于突觸后N-甲基D天門冬氨酸（NMDA）受體，參與長時程增強現(xiàn)象（LTP）[32]；同時觸發(fā) Ca2+通道開放，Ca2+通過 NMDA 進入胞內與鈣調蛋白（CaM）結合后活化NOS，NOS催化L-Arg再生成NO，從而對LTP的效應起維持促進作用。另有文獻表明：NO還可能通過調節(jié)多巴胺、乙酰膽堿等與學習記憶有關的神經(jīng)遞質的釋放[33]，及對腦血管的擴血管作用從而增加腦血流量，參與學習記憶的過程[34]。有關長期運動影響海馬nNOS陽性神經(jīng)元衰老變化的研究較少，以上推論還有待進一步探討。

本實驗衰老大鼠通過長期游泳運動腦自由基SOD、GSH-px活性顯著上調，自由基MDA含量減少，大腦AchE活性顯著減弱，海馬CA1、CA3及DG區(qū)nNOS陽性神經(jīng)元的數(shù)目和面積均明顯增高。表明長期游泳運動可能通過調節(jié)大腦自由基水平、調節(jié)神經(jīng)遞質活性、增強nNOS活性誘導LTP的形成，從而增強衰老大鼠的學習記憶能力，具體機制有待進一步研究。

4 小 結

（1）衰老大鼠大腦抗氧化能力顯著下降，中樞膽堿能系統(tǒng)AchE活性顯著增強，導致衰老大鼠學習記憶能力下降。長期游泳運動可提高衰老大鼠抗氧化能力，改善受損的中樞膽堿能系統(tǒng)，從而增強衰老大鼠的學習記憶能力。

（2）衰老大鼠海馬CA1、CA3、DG區(qū)nNOS的表達顯著減少。長期游泳運動可以增加海馬CA1、CA3及DG區(qū)nNOS的活性，增加NO的水平，從而增強衰老大鼠的學習記憶能力。

[1]ALZHEIMER'S A.Alzheimer's Association Report 2011 Alzheimer's diseasefactsand figures[J].Alzheimer's&Dementia，2011，7：208-244.

[2]AGUIAR A SJr，CASTRO A A，MOREIRA E L，etal.Short bouts of mild-intensity physical exercise improve spatiallearning and memory in aging rats：involvement of hippocampal plasticity via AKT，CREB and BDNFsignaling[J].Mech Ageing Dev，2011，132（11-12）：560-567.

[3]SASAKIT，UNNOK，TAHARA S，etal.Age-related increaseof reactive oxygen generation in thebrainsof mammalsand birds：isreactiveoxygen a signalingmoleculetodeterminetheagingprocessand lifespan[J].Geriatr Gerontol Int，2010，1：10-24.

[4]ZHAO W P，KAWAGUCHI Y，Matsui H，etal.Histochemistry and morphology of the multifidus muscle in lumbar discherniation：comparativestudy between diseased and normal sides[J].Spine，2000，25（17）：2 191-2 199.

[5]CHAN R H，SONG D，GOONAWARDENA A V，etal.Changes of hippocampal CA3-CA1 population nonlinear dynamics across different training sessions in rats performing a memory-dependent task[J].Conf Proc IEEEEng Med Biol Soc，2010：5 464-5 467.

[6]WUD，YANGL，XUX Y，etal.Effectsof congenital HCMV infection on synaptic plasticityin dentategyrus（DG）of rat hippocampus[J].Brain Res，2011，1389：27-34.

[7]YAGUCHIT，NAGATA T，NISHIZAKIT.Dilinoleoyl phosphatidylcholine ameliorates scopolamine-induced impairment of spatial learning and memory by targetingalpha7 nicotinicACh receptors[J].Life Sci，2009，84（9-10）：263-266.

[8]PALUMBO M L，F(xiàn)OSSER N S，RIOS H，etal.Loss of hippocampal neuronal nitric oxide synthase contributes to the stress-related deficit in learningand memory[J].JNeurochem，2007，102（1）：261-274.

[9]徐波，季瀏，林龍年，等.游泳訓練對大鼠學習記憶和腦內神經(jīng)遞質的影響[J].中國運動醫(yī)學雜志，2004，23（3）：261-265.

[10]ZHANG W，TAN Y F，ATWOOD H L，etal.Biphasic effects of the cholinergic agonist carbachol on long-term potentiation in the dentate gyrusof themammalian hippocampus[J].Neurosci Lett，2010，479（2）：157-160.

[11]TINSLEY C J，F(xiàn)ONTAINE-PALMER N S，VINCENT M，etal.Differing time dependencies of object recognition memory impairments produced by nicotinic and muscarinic cholinergic antagonism in perirhinal cortex[J].Learn Mem，2011，18（7）：484-492.

[13]JHA R，RIZVI SI.ENDEAN E P，etal.Age-dependent decline in erythrocyte acetylcholinesteraseactivity：correlation with oxidative stress[J].Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub，2009，153（3）：195-198.

[14]PIETRELLIA，L?PEZ-COSTA JJ，GONIR，etal.Effectsof moderate and chronic exerciseon thenitrergic systemand behavioral parameters in rats[J].Brain Res，2011，1 389：71-82.

[15]PINTON S，DA ROCHA JT，ZENI G，etal.Organoselenium improves memory decline in mice：involvement of acetylcholinesterase activity[J].Neurosci Lett，2010，472（1）：56-60.

[16]FUKUI K，ONODERA K，SHINKAI T，etal.Impairment of learning and memory in ratscaused by oxidativestress and aging，and changes in antioxidativedefensesystems[J].Ann NY Acad Sci，2001，928：168-75.

[17]RENS，HE X，YUNS，etal.Effectsof exerciseon spatial learningand hippocampal synaptic plasticity in brain aging mice[J].Wei Sheng Yan Jiu，2010，39（2）：239-241.

[18]BECKMANK B，NMESB N.Thefree radicaItheory of agingmatures[J].PhysioIRev，1998：78.

[19]DEIR，TAKEDA A，NIWA H，etal.Lipid peroxidation and advanced glycation end products in the brain in normal aging and in Alzheimer's disease[J].Acta Neuropathol，2002，104（2）：113-122.

[20]SELKOE D J.Alzheimer's disease is a synaptic failure[J].Science，2002，298（5 594）：789-791.

[21]MAURICE T，LOCKHART B P，Privat A.Amnesia induced in mice by centrally administered beta-amyloid peptides involves cholinergic dysfunction[J].Brain Res，1996，706（2）：181-193.

[22]PIETRELLI A，LOPEZ-COSTA J，GONI R，etal.Aerobic exercise prevents age-dependent cognitive decline and reduces anxiety-related behaviors in middle-aged and old rats[J].Neuroscience，2012，202：252-266.

[23]CAO L，WANGF，YANGQ G，etal.Reduced thyroid hormones with increased hippocampal SNAP-25 and Munc18-1 might involvecognitive impairment duringaging[J].Behav Brain Res，2012，229（1）：131-137.

[24]INAH L，TAYLORSJERMAN，etal.Disruption of delayed memory for asequence of spatial locations following CA1 or CA3 lesionsof thedorsal hippocampus[J].Neurobiology of Learning and Memory，2005，84（2）：138-147.

[25]MORRIS A M，CHURCHWELL J C，KESNER R P etal.Selective lesions of the dentate gyrus produce disruptions in place learning for adjacent spatial locations[J].Neurobiology of Learning and Memory，2012，97（3）：326-331.

[26]SEGIETH J，PEARCE B，F(xiàn)OWLER L，etal.Regulatory role of nitric oxideover hippocampal 5-HTreleasein vivo[J].Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol，2001，363（3）：302-306.

[27]NAHIDMAJLESSI，SAMIRACHOOPANI，TAHEREHBOZORGMEHR，etal.Involvement of hippocampal nitric oxidein spatial learningin therat[J].Neurobiology of Learningand Memory，2008，（90）：413-419.

[28]PAUL V，REDDY L，EKAMBARAM P.A reversal by L-arginine and sodium nitroprusside of ageing-induced memory impairment in rats by increasingnitric oxide concentration in the Hippocampus CA3[J].Indian JPhysiol Pharmacol，2005，49（2）：179-186.

[29]KIRCHNER L，WEITZDOERFER R，HOEGER H，etal.Impaired cognitive performancein neuronal nitric oxidesynthaseknockout miceis associated with hippocampal protein derangements[J].Nitric Oxide，2004，11（4）：316-330.

[30]LESSMANNV，STROH-KAFFEIS，STEINBRECHERV.Theexpression mechanism of the residual LTPin the CAI region of BDNF k.o.mice is insensitiveto NOsynthaseinhibition[J].Brain Research，2011，1391（19）：14-23.

[31]MEIRELLES L R，MENDES-RIBEIRO A C，MENDES M A，etal.Chronic exercise reduces platelet activation in hypertension：upregulation of the L-arginine-nitric oxidepathway[J].Scand JMed Sci Sports，2009，19（1）：67-74.

[32]SHIMIZUE，TANGYP，RAMPONC，etal．NMDAreceptor-dependent synaptic reinforcement as acrucial process for memory conso1idation[J]．Science，2000，290（5494）：1170-1174．

[33]VOLZ T J，SCHENK J O.L-arginine increases dopamine transporter activity in rat striatum via a nitric oxide synthase-dependent mechanism[J].Synapse，2004，54（3）：173-182.

[34]UCHIDA S，KAWASHIMA K，LEETJ.Nicotine-induced NO-mediated increase in cortical cerebral blood flow is blocked byβ2-adrenoceptor antagonistsin theanesthetized rats[J].Autonomic Neuroscience，2002，96（2）：126-130.