原核表達(dá)肺炎鏈球菌毒力蛋白PspA對人類嗜中性粒細(xì)胞釋放CXCL8的影響

徐 蕾，陳 丹，甘 萍，曹 炬

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)教研室 400016；2.重慶建設(shè)醫(yī)院藥劑科 400050；3.重慶三峽中心醫(yī)院兒童分院兒內(nèi)科 404000；4.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗科 400016）

原核表達(dá)肺炎鏈球菌毒力蛋白PspA對人類嗜中性粒細(xì)胞釋放CXCL8的影響

徐 蕾1，陳 丹2，甘 萍3，曹 炬4

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)教研室 400016；2.重慶建設(shè)醫(yī)院藥劑科 400050；3.重慶三峽中心醫(yī)院兒童分院兒內(nèi)科 404000；4.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗科 400016）

目的探討原核表達(dá)肺炎鏈球菌表面蛋白A（PspA）對人類嗜中性粒細(xì)胞釋放CXCL8的影響。方法將重組質(zhì)粒pET－32a（＋）/PspA轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌BL21（DE3）中，經(jīng)異丙基－β－D－硫代吡喃半乳糖苷誘導(dǎo)重組菌表達(dá) TRx－His－PspA融合蛋白并純化；通過腸激酶切掉融合蛋白的TRx－His部分，獲得PspA蛋白。用PspA蛋白免疫小鼠，獲得抗PspA抗體。再將PspA蛋白加入到人類嗜中性粒細(xì)胞的培養(yǎng)基中共孵育，檢測CXCL8釋放水平的差異；最后，用抗PspA抗體檢測其對PspA蛋白促人類嗜中性粒細(xì)胞釋放CXCL8的影響。結(jié)果中性粒細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)合成和釋放到培養(yǎng)基上清液的CXCL8顯著增加（P＜0.05）；而加入了抗PspA抗體后，PspA蛋白刺激人中性粒細(xì)胞釋放CXCL8的能力明顯減弱。結(jié)論P(yáng)spA可以上調(diào)人類嗜中性粒細(xì)胞趨化因子CXCL8的合成和釋放，揭示了中性粒細(xì)胞和肺炎鏈球菌致病因素之間的關(guān)系。

鏈球菌，肺炎；膜蛋白質(zhì)類；中性粒細(xì)胞；CXCL8

據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，每年死于肺炎鏈球菌侵入性疾病的人數(shù)有1.6億［1］。肺炎鏈球菌表面蛋白A（pneumococcal surface protein A，PspA）是肺炎鏈球菌的主要毒力蛋白之一，該菌在侵入性疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。另一方面，中性粒細(xì)胞從血液中遷移到炎癥病灶是固有免疫反應(yīng)抗侵入性肺炎鏈球菌疾病的初始階段［4］。然而，中性粒細(xì)胞和肺炎鏈球菌的相互作用還不完全清楚。本研究通過揭示肺炎鏈球菌毒力蛋白PspA和人嗜中性粒細(xì)胞釋放炎性因子CXCL8的密切關(guān)系，從而了解肺炎鏈球菌與機(jī)體免疫細(xì)胞、免疫體系的相互關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株及質(zhì)粒 大腸埃希菌BL21（DE3）為本實(shí)驗室保存；pET－32a（＋）/PspA為本實(shí)驗室構(gòu)建。

1.2 動物及主要試劑 BALB/c小鼠由重慶醫(yī)科大學(xué)動物中心提供，均為雌性，8～10周齡，18～20g。異丙基－β－D－硫代吡喃半乳糖苷、丙烯酰胺為Sigma產(chǎn)品，質(zhì)粒抽提試劑盒為Omega公司產(chǎn)品，組氨酸單克隆抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG為Novagen公司產(chǎn)品，SYBR綠色熒光定量PCR購自羅氏公司，RPMI－1640培養(yǎng)基、胎牛血清、HEPES購自Gibco公司。

1.3 融合蛋白TRx－His－PspA的誘導(dǎo)表達(dá)、鑒定及純化 將重組質(zhì)粒pET－32a（＋）/PspA轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌BL21中，挑取陽性克隆，接種于含氨芐西林的普通瓊脂培養(yǎng)液中，于37℃振蕩至對數(shù)增長期時，加入異丙基－β－D－硫代吡喃半乳糖苷（終濃度為1.5mmol/L）誘導(dǎo)4h，取樣進(jìn)行12%十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfonate polyacrylate gel electrophoresis，SDS－PAGE）分析。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng) SDS－PAGE 后電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，用5%脫脂奶粉封閉2h，加入組氨酸單克隆抗體孵育過夜；PBS液洗滌后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗IgG，室溫作用1h后二氨基聯(lián)苯胺（3，3′－diaminobenzidine，DAB）顯色，觀察結(jié)果。超聲波破菌后，細(xì)菌濾液采用親和層析法純化融合蛋白，將所得的融合蛋白溶液經(jīng)透析除鹽復(fù)性。

1.4 去除標(biāo)簽蛋白，獲得PspA蛋白 腸激酶切除融合蛋白TRx－His－PspA溶液，取少量溶液經(jīng)12%SDS－PAGE分析確認(rèn)被切除部分分別是TRx－His和PspA后，將剩余溶液加入到Ni－Agarose His柱，濾去TRx－His蛋白，獲得PspA蛋白，置于－80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 抗PspA抗體的制備 腹腔免疫小鼠。基礎(chǔ)免疫：PspA 10g/只加完全弗氏佐劑；加強(qiáng)免疫：PspA 10g/只＋不完全弗氏佐劑（每隔2周加強(qiáng)1次，連續(xù)2次）；對照組只注射佐劑；第3次免疫1周后，眼眶取血行酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測免疫效果，用PspA蛋白包被酶標(biāo)板，加小鼠血清，再加入二抗，顯色后讀取450 nm波長下各孔的吸光度，以高于陰性對照組2.1倍為陽性。

1.6 外周血中性粒細(xì)胞的分離 采集正常志愿者新鮮外周血，全血用沒有二價陽離子的Hanks平衡鹽緩沖液（Hanks balanced salt mixture，HBSS）稀釋后形成連續(xù)的梯度分層；在室溫下以500×g的速度離心30min后棄上清液，再將細(xì)胞置于1.5%右旋糖酐溶液中，200×g離心10min，吸取上清液。連續(xù)兩次0.5×PBS的低滲裂解30s以去除紅細(xì)胞；再用同等體積的1.75×PBS恢復(fù)等張，中性粒細(xì)胞計數(shù)。最后，中性粒細(xì)胞的形態(tài)分析評估其純度大于98%，臺盼藍(lán)染色顯示其活細(xì)胞所占比例大于96%。分離獲得的中性粒細(xì)胞用RPMI－1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，輔以10%和20mmol/L羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩沖液。

1.7 PspA蛋白對中性粒細(xì)胞活力影響的噻唑藍(lán)法分析 中性粒細(xì)胞（1×105細(xì)胞/孔）分別接種到96孔板，用10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL濃度的 PspA蛋白分別處理中性粒細(xì)胞12h和24h，每孔加入10μL噻唑藍(lán)溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入200μL二甲亞砜，低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在550nm處的吸光度測定吸光度，以量化有活性的中性粒細(xì)胞。

1.8 CXCL8濃度的測定 中性粒細(xì)胞接種于10cm培養(yǎng)皿中（5×106細(xì)胞/個），用10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200 ng/mL濃度的PspA蛋白刺激中性粒細(xì)胞8h后提取總RNA，取1μg的總RNA，利用隨機(jī)引物將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用實(shí)時定量 PCR 擴(kuò)增 CXCL8（上游引物：5′－GAC CAC ACT GCG CCA ACA CA－3′；下游引物：reverse，5′－ACC TCT TCA AAA ACT TCT CCC GAC－3′和β－actin（上游引物：5′－AGC GGG AAA TCG TGC GTG－3′；下游引物：5′－CAG GGT ACA TGG TGG TGC C－3′）。同時，用10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL濃度的PspA蛋白分別刺激中性粒細(xì)胞12h和24h，然后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用ELISA測定CXCL8在無細(xì)胞上清液中的濃度。

1.9 實(shí)時定量PCR擴(kuò)增CXCL8 中性粒細(xì)胞分兩組接種于6孔板中（5×105細(xì)胞/個），一組加入PspA蛋白（100ng/mL）和抗PspA抗體（50μg/mL）孵育30min的混合物；另一組只加PspA蛋白（200ng/mL）不加抗體，處理24h后，采用實(shí)時定量PCR擴(kuò)增CXCL8。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)分析，組間比較采用t檢驗，組間比較采用單因素方差檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

BL21/pET－32a（＋）－PspA的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物可見相對分子質(zhì)量約70 000的蛋白條帶，為PspA（相對分子質(zhì)量50 000）與Trx－His（相對分子質(zhì)量20 000）的融合蛋白條帶（圖1）；重組蛋白與組氨酸單克隆抗體反應(yīng)，在70 000左右處出現(xiàn)特異的反應(yīng)條帶，確證獲得了帶有6個組氨酸接頭的融合蛋白（圖2）。透析除去尿素，使融合蛋白復(fù)性（圖3）。

圖1 融合蛋白的電泳圖

圖2 融合蛋白的Western－blot圖

圖3 純化的融合蛋白的電泳圖

圖4 融合蛋白酶切后的電泳圖

切除融合蛋白TRx－His標(biāo)簽，獲得PspA蛋白（圖4）。高濃度的PspA蛋白引起宿主細(xì)胞的細(xì)胞毒作用是非常有限（圖5）。PspA蛋白刺激中性粒細(xì)胞后，CXCL8的釋放均呈劑量依賴性增強(qiáng)（圖6，P＜0.05），其中CXCL8水平在24h高于12h，CXCL8的釋放在100～200ng/mL濃度時進(jìn)入了一個平臺期（圖7）。當(dāng)PspA蛋白被抗體中和后，CXCL8的釋放明顯下降（圖8，P＜0.05）。

圖5 PspA蛋白對中性粒細(xì)胞活力影響的線形圖

圖6 中性粒細(xì)胞受PspA蛋白刺激后產(chǎn)生CXCL8的柱狀圖

圖7 PspA蛋白刺激中性粒細(xì)胞釋放CXCL8的線形圖

圖8 PspA蛋白及其抗體影響CXCL8產(chǎn)生的柱狀圖

3 討 論

肺炎鏈球菌的毒性蛋白，包括PspA已被證明在侵入性肺炎鏈球菌感染的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用［2－4］。PspA是肺炎鏈球菌的細(xì)胞表面蛋白，在目前分離出的所有肺炎鏈球菌菌株中都存在［5］。PspA的疫苗可以預(yù)防高危嬰兒感染肺炎鏈球菌［6］。PspA是乳鐵蛋白結(jié)合蛋白，它可以抑制由肺炎鏈球菌引起的補(bǔ)體活化［7］。同時，PspA可以保護(hù)肺炎鏈球菌避免受乳鐵蛋白的殺傷作用［8］。此外，PspA在流感病毒感染后的繼發(fā)性肺炎鏈球菌感染中也起作用［9］。

嗜中性粒細(xì)胞是固有免疫系統(tǒng)中主要的效應(yīng)細(xì)胞，同時也參與適應(yīng)性免疫反應(yīng)［10］。嗜中性粒細(xì)胞是循環(huán)體系和組織中最豐富的白細(xì)胞，成為清除侵入性肺炎鏈球菌的主要成分。肺炎鏈球菌與中性粒細(xì)胞的相互作用激活了嗜中性粒細(xì)胞，使其吞噬肺炎鏈球菌并且合成了多種炎癥介質(zhì)，從而誘發(fā)炎癥反應(yīng)。這些炎癥調(diào)節(jié)因子包括顆粒酶（如髓過氧化物酶、β－葡萄糖醛酸酶、彈性蛋白酶、明膠酶等）和細(xì)胞因子，特別是IL－9、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factorα，TNF－α）和轉(zhuǎn)化生長因子α（transforming growth factorα，TGF－α）［11－12］，這可能是嗜中性粒細(xì)胞防御侵入性肺炎鏈球菌感染的機(jī)制。由于嗜中性粒細(xì)胞是早期免疫應(yīng)答的重要組成，所以肺炎鏈球菌如何調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞免疫功能對于解決侵入性肺炎鏈球菌的感染是非常重要的。嗜中性粒細(xì)胞通過一定的趨化因子，尤其是CXCL8［13］，被招募到炎癥部位。CXCL8是CXC趨化因子家族的成員之一，它可以刺激嗜中性粒細(xì)胞的吞噬功能，并上調(diào)該細(xì)胞表面黏附分子的表達(dá)，以及增強(qiáng)嗜中性粒細(xì)胞對內(nèi)皮細(xì)胞的黏附。事實(shí)證明，侵入性肺炎球菌疾病中炎癥部位的CXCL8濃度明顯增加［15］。

本研究證明了PspA可以刺激中性粒細(xì)胞的CXCL8生產(chǎn)。由于CXCL8是一個強(qiáng)有力的中性粒細(xì)胞趨化因子，肺炎球菌毒性蛋白增加CXCL8的釋放，招募更多的中性粒細(xì)胞在感染組織殺死肺炎鏈球菌。另一方面，過量生產(chǎn)CXCL8可以招募更多的中性粒細(xì)胞以及其他免疫細(xì)胞如淋巴細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞在炎癥部位，放大炎癥反應(yīng)。事實(shí)上，肺炎鏈球菌引起的體液免疫反應(yīng)就是細(xì)胞炎癥因子和抗炎癥因子在體內(nèi)的差異調(diào)節(jié)［16］。所以，本實(shí)驗探討了在炎癥反應(yīng)中肺炎鏈球菌的這種毒力蛋白和CXCL8的功能聯(lián)系，為弄清一系列炎癥反應(yīng)中免疫細(xì)胞和肺炎球菌致病因素之間的關(guān)系，制定新的戰(zhàn)略來控制肺炎球菌侵入性疾病做鋪墊。

［1］Cripps AW，Leach，AJ，Lehmann D，et al.Pneumococcal vaccination in developing countries［J］.Lancet，2006，368（9536）：644.

［2］Bogaert D，De Groot R，Hermans PW.Streptococcus pneumoniae colonisation：the key to pneumococcal disease［J］.Lancet Infect Dis，2004，4（3）：144－154.

［3］Koedel U，Scheld WM，Pfister HW.Pathogenesis and pathophysiology of pneumococcal meningitis［J］.Lancet Infect Dis，2002，2（12）：721－736.

［4］Farnworth SL，Henderson NC，Mackinnon AC，et al.Galectin－3reduces the severity of pneumococcal pneumonia by augmenting neutrophil function［J］.Am J Pathol，2008，172（2）：395－405.

［5］Bergmann S，Hammerschmidt S.Versatility of pneumococcal surface proteins［J］.Microbiology，2006，152（2）：295－303.

［6］Francis JP，Richmond PC，Pomat WS，et al.Maternal antibodies to pneumolysin but not to pneumococcal surface protein A delay early pneumococcal carriage in high－risk papua new guinean infants［J］.Clin Vaccine Immunol，2009，16（11）：1633－1638.

［7］Hammerschmidt S，Bethe G，Remane PH，et al.Identification of pneumococcal surface protein A as a lactoferrin－binding protein of Streptococcus pneumoniae［J］.Infect Immun，1999，67（4）：1683－1687.

［8］Shaper M，Hollingshead SK，Benjamin WH，et al.PspA protects Streptococcus pneumoniae from killing by apolactoferrin，and antibody to PspA enhances killing of pneumococci by apolactoferrin［J］.Infect Immun，2004，72（9）：5031－5040.

［9］King QO，Lei B，Harmsen AG.Pneumococcal surface protein A contributes to secondary Streptococcus pneumoniae infection after influenza virus infection［J］.J Infect Dis，2009（4）：537－545.

［10］Laskay T，van Zandbergen G，Solbach W.Neutrophil granulocytes as host cells and transport vehicles for intracellular pathogens：apoptosis as infection－promoting factor［J］.Immunobiology，2008，213（3/4）：183－191.

［11］Navarini AA，Lang KS，Verschoor A，et al.Innate immuneinduced depletion of bone marrow neutrophils aggravates systemic bacterial infections［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2009，106（17）：7107－7112.

［12］Foley SC，Hamid Q.Images in allergy and immunology：neutrophils in asthma［J］.J Allergy Clin Immunol，2007，119（5）：1282－1286.

［13］Dogan S，Zhang X，Pridmore AC，et al.Pneumolysin－induced CXCL8production by nasopharyngeal epithelial cells is dependent on calcium flux and MAPK activation via Toll－like receptor 4［J］.Microbes Infect，2011，13（1）：65－75.

［14］Herbold W，Maus R，Hahn I，et al.Importance of CXC chemokine receptor 2in alveolar neutrophil and exudate macrophage recruitment in response to pneumococcal lung infection［J］.Infect Immun，2010，78（6）：2620－2630.

［15］Koedel U，Scheld WM，Pfister HW.Pathogenesis and pathophysiology of pneumococcal meningitis［J］.Lancet Infect Dis，2002，2（12）：721－736.

［16］Khan AQ，Shen Y，Wu ZQ，et al.Endogenous pro－and anti－inflammatory cytokines differentially regulate an in vivo humoral response to streptococcus pneumoniae［J］.Infect Immun，2002，70（2）：749－761.

Influence of pneumococcal surface protein A on human neutrophils releasing CXCL8

XuLei1，ChenDan2，GanPing3，CaoJu4
（1.DepartmentofPathobiology，ChongqingMedicalUniversity，Chongqing400016，China；2.Departmentof Pharmacy，ChongqingJiansheHospital，Chongqing400050，China；3.DepartmentofInternalMedicine，Children′sBranchHospital，ChongqingSanxiaCentralHospital，Chongqing404000，China；4.Departmentof Laboratory，F(xiàn)irstAffiliateHospital，ChongqingMedicalUniversity，Chongqing400016，China）

ObjectiveTo investigate the influence of prokaryotic express pneumococcal surface protein A（PspA）on CXCL8releasing from human neutrophils.MethodsThe recombinant plasmid pET－32a（＋）/PspA was transformed into E.coli BL21（DE3）.The fusion protein TRx－His－PspA was expressed and digested by enterokinase after purification，in order to get protein PspA.Then mice were immunized with protein PspA to get the anti－PspA antibodies.Protein PspA single or mixed with anti－PspA antibodies was added in the medium of human neutrophils for coincubation.Later the CXCL8producing and releasing from neutrophils were detected.ResultsThe fusion protein TRx－His－PspA was expressed and purified successfully.The protein PspA was obtained after digested by enterokinase.The anti－PspA antibodies with high titer were gotten from the immunized mice.After the protein PspA adding in the medium of human neutrophils，the neutrophils were detected to produce and release more CXCL8by real－time quantitative polymerase chain reaction and enzyme－linked immunosorbent assay（P＜0.05）.On the other side，the anti－PspA antibodies could reduce the ability of protein PspA to stimulate the CXCL8producing and releasing.ConclusionThe protein PspA could induce human neutrophil synthesizing and releasing chemokine CXCL8，which reveals the relationship between neutrophils and Streptococcus pneumoniae.

streptococcus pneumoniae；membrane proteins；neutrophils；CXCL8

10.3969/j.issn.1671－8348.2012.14.020

A

1671－8348（2012）14－1397－03

2011－12－25

2012－02－05）