細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞免疫治療腫瘤研究進(jìn)展

吉海杰 王黎明 李會 劉大慶 史高娜 李娜 裴雪濤 吳明遠(yuǎn)

近年來，全球惡性腫瘤患者人數(shù)逐漸上升，新發(fā)病例數(shù)從2002年的1090萬上升到2008年的1270萬，因腫瘤導(dǎo)致死亡人數(shù)從670萬上升到760萬，成為人類死亡的首位原因[1]。手術(shù)、放療和化療的單一或聯(lián)合應(yīng)用對早發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤的治療能取得較好的療效，但腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及腫瘤晚期患者由于體質(zhì)差或治療不敏感等原因?qū)е律鲜霪煼o法實施或療效不佳[2]。因此，尋找能有效抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移且副作用小的治療方法成為臨床腫瘤治療的迫切需要。

隨著腫瘤免疫學(xué)的發(fā)展及對腫瘤抗原、腫瘤免疫逃逸機(jī)制和腫瘤微環(huán)境的認(rèn)識深入，腫瘤免疫治療成為治療腫瘤的一種新模式：即通過激發(fā)或調(diào)動機(jī)體的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境抗腫瘤免疫力，從而控制和殺傷腫瘤細(xì)胞[3]。繼淋巴因子激活殺傷細(xì)胞、腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞及CD3單抗激活的殺傷細(xì)胞后，細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine-induced?killer,?CIK)的殺瘤作用日益受到重視。1991年美國斯坦福大學(xué)Schmidt-Wolf利用多種細(xì)胞因子(干擾素-γ、CD3單克隆抗體、白介素-1和白介素-2)成功誘導(dǎo)外周血單核細(xì)胞快速增殖分化為具有腫瘤殺傷活性細(xì)胞，并命名為CIK細(xì)胞[4]。CIK細(xì)胞與其他過繼性免疫治療細(xì)胞相比具有增殖速度快、殺瘤活性高、殺瘤譜廣、副作用小、對正常骨髓造血影響輕微等優(yōu)點[5]，因此CIK細(xì)胞被認(rèn)為是新一代腫瘤過繼免疫治療的首選?，F(xiàn)就CIK細(xì)胞的生物學(xué)特性、安全性和臨床應(yīng)用研究等方面的最新進(jìn)展綜述如下。

一、CIK細(xì)胞的生物學(xué)特性

（一）CIK細(xì)胞表型分析

CIK細(xì)胞多是采用IFN-γ、IL-2和CD3單克隆抗體等因子與外周血單核細(xì)胞體外共同培養(yǎng)一段時間獲得的一群異質(zhì)細(xì)胞，包括CD3-CD56+、CD3+CD56-和CD3+CD56+等 細(xì) 胞 亞 群，其 中CD3+CD56+細(xì)胞亞群是主要的細(xì)胞毒性效應(yīng)細(xì)胞，共 表達(dá) TCR-α/β、CD5 和 CD8，不 表達(dá) CD16[6]。CD3+CD56+細(xì)胞在生理條件下外周血中的數(shù)量極 少 (1﹪～?5﹪)，外 周 血 中 CD3+CD56-T 細(xì) 胞亞群在體外多細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下表達(dá)CD56分化為無增殖活性的CD3+CD56+細(xì)胞；以CD4和CD8為標(biāo)準(zhǔn)對T淋巴細(xì)胞分類發(fā)現(xiàn)增殖活性具有 CD4-CD8+>CD4+CD8->CD4+CD8+>CD4-CD8-的特點，除CD4+CD8-T亞群外，其余T細(xì)胞亞群均可通過體外多因子培養(yǎng)而獲得CD56分子的表達(dá)[7]。由于CD4+CD8+細(xì)胞和CD4-CD8-細(xì)胞在正常人外周血中數(shù)量極少，提示CD3+CD56+主要來源于CD3+CD8+CD56-T淋巴細(xì)胞。成熟的CD3+CD56+細(xì)胞具有大顆粒淋巴細(xì)胞形態(tài)，能表達(dá) NKG2D/CD134、LFA-1/CD11α、CD27、MIP-1α、Perforin、FasL和CD45RA，不表達(dá)CCR7和CD28；CD3+CD56+細(xì)胞雖然被稱為自然殺傷細(xì)胞(Natural?killer,?NK)樣T淋巴細(xì)胞，但不完全具備NK細(xì)胞表型，例如不表達(dá)NK細(xì)胞特異性活化受體NKp30、NKp44 和 NKp46，抑制性受體 KIR2DL1-2、KIR3DL1 和 NKG2A[7]。但表達(dá) DNAM-1、NKG2D和NKp30等NK細(xì)胞活化受體[8]。CD3+CD56+細(xì)胞不表達(dá)Ⅰ型自然殺傷T細(xì)胞標(biāo)志分子TCRVα24-JαQ，故被認(rèn)為屬于Ⅱ型自然殺傷T細(xì)胞[9]。CIK細(xì)胞高度表達(dá)CD3、CD54和CD11α，中度表達(dá) CD3CD56、HLA-DR、CD28CD54和 CD28，不表達(dá)CD86和CD80[10]。研究還發(fā)現(xiàn)CIK細(xì)胞能分泌IFN-γ和 TNF-α 等細(xì)胞因子[11]。

值得注意的是，不同細(xì)胞因子誘導(dǎo)的CIK細(xì)胞表型具有多樣性，各亞群比例具有差異性，例如比較分別用IL-2、IL-7及IL-12誘導(dǎo)的CIK細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)IL-12能誘導(dǎo)更多CD3+CD56+細(xì)胞，而IL-7能誘導(dǎo)CD11和CD28表達(dá)[12]；與IL-2比較IL-15更能誘導(dǎo)NKG2D表達(dá)[13]；與CD3單克隆抗體比較兔抗胸腺細(xì)胞球蛋白能誘導(dǎo)CIK細(xì)胞表達(dá)NK細(xì)胞受體 CD158a、CD158b、NKp46、NKG2D 和 NKG2A或CD94，并能分泌IL-12p40[14]。

（二）CIK細(xì)胞生物活性

自從Schmidt-Wolf等[4]發(fā)現(xiàn)CIK細(xì)胞在體內(nèi)外對人B淋巴瘤SU-DHL4細(xì)胞均有殺傷活性以來，其殺瘤活性得到廣泛關(guān)注。由于CIK細(xì)胞具有T淋巴細(xì)胞殺瘤活性和NK細(xì)胞非主要組織相容性復(fù)合體限制性殺瘤的特點，對多種腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出強(qiáng)大的殺傷活性[15]。目前研究表明CIK細(xì)胞對多種血液腫瘤細(xì)胞和實體瘤細(xì)胞在體內(nèi)外均具有殺傷活性(表1)。

（三）CIK細(xì)胞殺瘤機(jī)制研究

1.溶解靶細(xì)胞：早期研究發(fā)現(xiàn)CIK細(xì)胞能通過溶解靶細(xì)胞發(fā)揮殺瘤效應(yīng)，可被表面黏附分子LFA-1或ICAM-1的單克隆抗體所阻滯[29]。進(jìn)一步研究證實CIK細(xì)胞通過釋放含有胞質(zhì)顆粒直接溶解腫瘤細(xì)胞，其脫顆粒主要有兩條途徑：一條為CIK細(xì)胞表面黏附分子LFA-1與ICAM-1相互作用刺激其脫顆粒；另一條為CIK細(xì)胞表面CD3或CD3樣受體與CD3單抗相互作用刺激其脫顆粒[30]。

2.誘導(dǎo)凋亡：研究發(fā)現(xiàn)CIK細(xì)胞表達(dá)分泌Fas配體(FasL)，可通過Fas-FasL途徑誘導(dǎo)Fas+腫瘤細(xì)胞凋亡，同時CIK細(xì)胞抗凋亡基因如cFLIP、Bc1-2、Bcl-xL、DAD1和survivin表達(dá)上調(diào)，能抵抗FasL+腫瘤細(xì)胞對CIK的反作用[31]。另外CIK細(xì)胞還能分泌腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體可誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡[32]。CIK細(xì)胞與MGC-803胃癌細(xì)胞混合培養(yǎng)5?h后，可見靶細(xì)胞表面有孔洞形成；培養(yǎng)14?h后，靶細(xì)胞表面可見直徑不一的圓形凋亡小體及孔洞；培養(yǎng)24?h后，可見靶細(xì)胞發(fā)生破裂[33]。CIK細(xì)胞體外可影響卵巢癌耐藥細(xì)胞SKOV3或CDDP細(xì)胞周期，能誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡[34]。

二、CIK細(xì)胞安全性研究

粒細(xì)胞-單核細(xì)胞集落形成實驗表明CIK細(xì)胞對正常骨髓細(xì)胞毒性較小[4]。異體CIK細(xì)胞在動物模型可引起輕微移植物抗宿主疾病(graftversus-host?disease,?GVHD)，螢光素酶標(biāo)記的 CIK細(xì)胞骨髓移植后發(fā)現(xiàn)其浸潤在發(fā)生GVHD靶組織數(shù)量較少且持續(xù)時間短暫[35]。此外，CIK細(xì)胞分泌大量的IFN-γ能抑制GVHD發(fā)生[36]。對5例臍帶血移植后復(fù)發(fā)的急性白血病患者進(jìn)行臍帶血CIK細(xì)胞輸注，除1例發(fā)生急性Ⅲ級GVHD外，其他4例均未發(fā)現(xiàn)異常反應(yīng)[37]。對18例造血干細(xì)胞移植后血液病復(fù)發(fā)患者進(jìn)行CIK細(xì)胞治療，除2例發(fā)生急性Ⅰ-Ⅱ級GVHD和1例限制性慢性GVHD外未出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)[38]。

三、CIK細(xì)胞臨床應(yīng)用研究

1999年Schmidt-Wolf等[39]首次將IL-2基因轉(zhuǎn)染的自體CIK細(xì)胞用于腎癌、結(jié)直腸癌和淋巴瘤患者進(jìn)行Ⅰ期臨床試驗研究，10例患者中除3例出現(xiàn)2級發(fā)熱癥狀外沒有嚴(yán)重不良反應(yīng)事件發(fā)生；6例患者疾病進(jìn)展，3例患者病情穩(wěn)定，1例濾泡性淋巴瘤的患者完全緩解。目前CIK細(xì)胞單獨或聯(lián)合手術(shù)或(和)放化療用于臨床多種腫瘤的治療。對以“CIK?cells?clinical?trial”為關(guān)鍵詞在 Pubmed 檢索到的11項CIK細(xì)胞治療腫瘤臨床試驗進(jìn)行分析，381例患者中24例完全緩解，27例部分緩解，40例輕度緩解，161例病情穩(wěn)定，129例疾病進(jìn)展；總體來看CIK細(xì)胞治療的副作用較小且能顯著提高患者生存率[40]。近年來，我國學(xué)者在CIK細(xì)胞臨床研究方面取得了顯著進(jìn)展，受到國際同行的關(guān)注。例如對以“CIK”或“細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞”為關(guān)鍵詞在中國科學(xué)技術(shù)期刊數(shù)據(jù)庫檢索到24項臨床試驗進(jìn)行分析，563例患者中40例完全緩解，126例部分緩解，125例輕度緩解，135例病情穩(wěn)定和58例疾病進(jìn)展[41]。作者以“CIK?cell”為關(guān)鍵詞在clinicaltrials.gov檢索到16項臨床試驗，涵蓋血液腫瘤、肺癌、肝癌、腎癌及乳腺癌等腫瘤的治療，其中9項是由我國學(xué)者注冊。

（一）CIK細(xì)胞治療血液腫瘤

7例霍奇金淋巴瘤及2例非霍奇金淋巴瘤晚期患者在造血干細(xì)胞移植失敗后接受CIK細(xì)胞治療，1例發(fā)生無癥狀的輕度低血壓，1例輕度發(fā)熱和1例由于疾病進(jìn)展出現(xiàn)血小板減少癥；短期療效表明2例部分緩解，2例病情穩(wěn)定[42]。對11例血液病患者在造血干細(xì)胞移植失敗后反復(fù)進(jìn)行CIK細(xì)胞輸入，除4例發(fā)生急性GVHD外沒有嚴(yán)重不良事件發(fā)生；6例疾病進(jìn)展并死亡，1例病情穩(wěn)定，1例病情改善，3例完全緩解[43]。24例血液腫瘤患者在造血干細(xì)胞移植失敗后接受CIK細(xì)胞治療，5例完全緩解[44]。9例彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤老年患者接受自體CIK細(xì)胞治療，淋巴瘤癥狀和生活質(zhì)量均顯著提高，試驗結(jié)束時9例均完全緩解且無不良反應(yīng)發(fā)生[45]。以上研究表明CIK細(xì)胞用于血液腫瘤的治療具有安全性和有效性。

表1 ?CIK細(xì)胞殺瘤活性

（二）CIK細(xì)胞治療實體瘤

目前已有CIK細(xì)胞治療腎癌、乳腺癌、肝癌、肺癌及胃癌等腫瘤的臨床研究報道。自體CIK細(xì)胞治療16例腎癌轉(zhuǎn)移患者，其中3例完全緩解，1例部分緩解，6例病情穩(wěn)定[46]。自體CIK細(xì)胞治療腎癌轉(zhuǎn)移患者表明CIK能改善預(yù)后，且輸入CIK細(xì)胞頻率與療效呈正相關(guān)性[47]。18例腎癌患者術(shù)后進(jìn)行化療聯(lián)合CIK細(xì)胞治療，其中3例治療1年后肺轉(zhuǎn)移且2年后死亡，15例病情穩(wěn)定；對照組10例患者接受單獨化療，其中6例治療1年后出現(xiàn)肺和腹腔癌轉(zhuǎn)移(6例3年內(nèi)死亡)，其余4例病情穩(wěn)定[48]。CIK細(xì)胞過繼免疫治療35例乳腺癌患者，其中24例完全緩解，6例部分緩解，1例病情穩(wěn)定，近期有效率為85.71﹪，疾病控制率為88.57﹪，中位無進(jìn)展期15個月；僅1例出現(xiàn)一過性發(fā)熱反應(yīng)[49]。13例原發(fā)性肝癌患者接受自體CIK細(xì)胞治療，其病情得到好轉(zhuǎn)且無不良反應(yīng)發(fā)生[50]。一項隨機(jī)對照臨床研究表明肝癌根治性手術(shù)聯(lián)合CIK治療能降低腫瘤復(fù)發(fā)和進(jìn)展，并顯著延長無進(jìn)展生存期[51]。微創(chuàng)聯(lián)合CIK細(xì)胞治療肝癌，治療組1年和18個月的復(fù)發(fā)率顯著低于對照組[52]。CIK細(xì)胞聯(lián)合化療治療Ⅲ期非小細(xì)胞肺癌表明支氣管動脈灌注化療聯(lián)合CIK治療組臨床有效率高于全身化療組，且骨髓抑制毒性和非骨髓抑制毒性發(fā)生率低于全身化療組[53]。Ⅳ期胃癌患者化療聯(lián)合CIK細(xì)胞免疫治療，患者短期緩解率為56.3﹪，而單獨化療組為48﹪[54]。一項隨機(jī)對照臨床研究表明胃癌術(shù)后化療聯(lián)合CIK細(xì)胞治療組患者中位生存期為49個月，而單獨化療組僅為27個月；2年和5年的存活率CIK細(xì)胞治療組分別為73.5﹪和40.4﹪，單獨化療組分別為52.6﹪和23.9﹪；CIK細(xì)胞治療不同頻次組間具有顯著差異，增加CIK細(xì)胞治療頻次能降低死亡風(fēng)險[55]。

一項回顧性臨床研究表明40例實體瘤患者接受自體CIK細(xì)胞治療臨床癥狀得到顯著改善，其6個月、1年和3年的存活率分別為70.0﹪、60.0﹪和57.5﹪[56]。另一項對CIK細(xì)胞治療實體瘤的Ⅱ/Ⅲ期臨床試驗系統(tǒng)性分析研究，表明CIK細(xì)胞能顯著增加患者6個月、1年和2年生存率，延長平均生存期；CIK細(xì)胞治療組患者6個月、1年和2年無進(jìn)展生存期率顯著增加，中位進(jìn)展期明顯延長[57]。

四、存在問題和展望

過繼性細(xì)胞免疫療法是向腫瘤患者輸入具有抗腫瘤活性的免疫細(xì)胞，直接殺傷腫瘤或激發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)來殺傷腫瘤細(xì)胞，對早期或手術(shù)或(和)放化療后腫瘤治療具有重要價值。CIK細(xì)胞作為新一代過繼免疫細(xì)胞，大量研究已證明其抗腫瘤作用比其他免疫活性細(xì)胞更具有優(yōu)勢。根據(jù)衛(wèi)生部第三類醫(yī)療技術(shù)的管理辦法，越來越多醫(yī)療機(jī)構(gòu)具備提供CIK細(xì)胞免疫療法服務(wù)的能力，但目前尚無CIK細(xì)胞療法的臨床應(yīng)用技術(shù)規(guī)范，使此項新技術(shù)應(yīng)用受到限制。

傳統(tǒng)CIK細(xì)胞主要通過分離患者自體外周血單核細(xì)胞經(jīng)體外細(xì)胞因子誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得，由于多數(shù)患者手術(shù)及放化療后體質(zhì)較弱，一方面外周血采集比較困難，另一方面所分離的單核細(xì)胞數(shù)量少、質(zhì)量差導(dǎo)致后期CIK細(xì)胞擴(kuò)增周期長和數(shù)量不足不利于自體免疫細(xì)胞治療，限制自體CIK細(xì)胞臨床治療腫瘤的應(yīng)用。臍帶血中富含多功能干細(xì)胞，除造血干細(xì)胞外，還有大量免疫細(xì)胞前體細(xì)胞，是一種重要的人類生物資源[58]。近年來研究發(fā)現(xiàn)臍帶血單核細(xì)胞來源的CIK細(xì)胞免疫原性低、增殖和殺瘤活性更高，而且臍帶血來源豐富、質(zhì)量可控[59]。采用臍帶血來源的CIK細(xì)胞輔助常規(guī)療法治療晚期惡性實體瘤患者，總緩解率、無病生存期和總生存率顯著高于單獨化療[60]，這提示臍帶血來源的CIK細(xì)胞具有良好的臨床應(yīng)用價值和前景。

CIK細(xì)胞免疫治療腫瘤臨床療效確切，但還沒有形成完善和完備的應(yīng)用和監(jiān)管體系，通過CIK細(xì)胞基礎(chǔ)和臨床應(yīng)用研究的結(jié)合制定出CIK細(xì)胞治療惡性腫瘤的技術(shù)規(guī)范迫在眉睫，其中如何獲得足夠數(shù)量并具有高細(xì)胞毒活性的效應(yīng)細(xì)胞，如何更好地將CIK細(xì)胞治療和其他治療手段有效結(jié)合成為重點與難點。

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