自然殺傷細(xì)胞分離、培養(yǎng)方法的建立

朱向情 劉凌 吳瓊 陳翠竹 雷力 王強(qiáng) 馬麗華 龐榮清 趙晶 何潔 張曉曉阮光萍 潘興華

自然殺傷細(xì)胞（natural?killer?cells，NK）是指一類(lèi)無(wú)需預(yù)先致敏就可以殺傷某些血液系統(tǒng)腫瘤和變異轉(zhuǎn)化細(xì)胞的細(xì)胞類(lèi)群。NK細(xì)胞是機(jī)體先天獲得性免疫系統(tǒng)重要的組成細(xì)胞之一，因其殺傷靶細(xì)胞無(wú)需致敏，可以在免疫應(yīng)答早期發(fā)揮作用；同時(shí)NK細(xì)胞免疫應(yīng)答的早期還能釋放多種趨化因子和細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)機(jī)體的特異性免疫應(yīng)答。因此NK細(xì)胞對(duì)腫瘤的治療比較理想，但是人體內(nèi)NK細(xì)胞的數(shù)量很少，只占外周血的5﹪～?10﹪，需要體外擴(kuò)增到一定的數(shù)量后，才能進(jìn)行治療。本實(shí)驗(yàn)的目的是建立一種簡(jiǎn)單、高效獲得NK細(xì)胞的方法。

材料和方法

一、材料

RPMI?1640（美國(guó) GIBCO 公司），淋巴細(xì)胞分離液（上海榮盛生物試劑廠），雙抗：100萬(wàn)U/ml青霉素和 100 μg/ml鏈霉素（華北制藥廠），rIL-2?10萬(wàn)U/ml（昆明總醫(yī)院制劑室生產(chǎn)），苯丙氨酸甲酯（L-Phenylalanine?methylamine?ester，PME，美國(guó)Sigma公司）。

二、方法

（一）單個(gè)核細(xì)胞的分離

取健康人外周血10?ml，枸櫞酸鹽抗凝。無(wú)菌室內(nèi)，轉(zhuǎn)入 50?ml離心管中，加入 40?ml生理鹽水，混勻，2000?×g離心 3?min 除去上清，加入生理鹽水至50?ml，重懸。將細(xì)胞懸液平均分配至兩支加有20?ml淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，2000?×g離心 20?min。吸取以單個(gè)核細(xì)胞為主的白色云霧層至另一離心管中，加入適量的生理鹽水，2000?×g離心 3?min 除去淋巴細(xì)胞分離液。

（二）NK細(xì)胞的分離方法和培養(yǎng)擴(kuò)增

1.NK細(xì)胞的分離方法：采用PME法。因PME可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，代謝生成苯丙氨酸進(jìn)入溶酶體內(nèi)，降低溶酶體內(nèi)滲透壓，使溶酶體破裂，釋放出酶使細(xì)胞溶解，從而有效去除富含溶酶體的單個(gè)核巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞等，但同時(shí)不改變淋巴細(xì)胞的表型和細(xì)胞毒性。利用PME這一特性，將分離得到的單個(gè)核細(xì)胞，用5?mmol/L?PME室溫處理40?min，并輕輕的震蕩。然后用生理鹽水洗滌2 次，1800?×g離心 3?min。

2.NK細(xì)胞的培養(yǎng)擴(kuò)增：將PME處理后的單個(gè)核細(xì)胞，加入RPMI?1640完全培養(yǎng)基[含10﹪小牛血清、pH?=?7.2]，在塑料培養(yǎng)瓶和 6孔板中分別加入 10?ml和 2?ml，每組加 rhIL-2（6000?U/ml）并調(diào)整細(xì)胞濃度為 5?×?106/ml。培養(yǎng) 3～?5?h，移去未黏附細(xì)胞的懸液，收集黏附于板底表面的細(xì)胞，調(diào)成細(xì)胞濃度為 2?×?106/ml，同時(shí)補(bǔ)充 IL-2，細(xì)胞終濃度為 6000?U/ml，繼續(xù)培養(yǎng)，每 3?d 換液1次。

（三）NK細(xì)胞活性的檢測(cè)

1.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)：取單細(xì)胞懸液于流式管中，加 1× 磷酸鹽緩沖液（phosphate?buffer,?PBS）4ml?1800?×g離心 5?min，棄上清，重復(fù) 3 次，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為約 1?×?106個(gè) /100 μl；加抗體（CD16，CD56，CD3），輕輕吹打混勻，4℃避光孵育30?min；加 1?×?PBS?4?ml?1800?×g離心 5?min, 棄上清，重復(fù)3次，加500 μl 1 × PBS，輕輕吹打混勻；上機(jī)檢測(cè)。

2.四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法：用MTT法檢測(cè)NK細(xì)胞的殺傷活性。在培養(yǎng)的第1、4、7、10、14 天分別取細(xì)胞，充分洗滌，以 1?×?106/ml的濃度將效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞（A549）加于96孔板(均為3個(gè)復(fù)孔)中,孵育48?h后，加入MTT?10 μl/孔，4?h 后離心棄上清，加 500?ml/L 無(wú)水乙醇和500?g/L二甲基亞砜混合液200 μl/孔，充分吹打、混勻，在酶標(biāo)儀上讀取A450nm值，并按下列公式計(jì)算NK細(xì)胞的殺傷率。

殺傷率 (﹪)?=?{1?-?[殺傷孔的A值 - 效應(yīng)孔的A值 ]?/靶細(xì)胞孔的A值 }?×100﹪

（四）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，NK細(xì)胞表面CD16、CD56、CD3的表達(dá)率用相對(duì)數(shù)表示，不同時(shí)間NK細(xì)胞殺傷率用x±?s不同效靶濃度組間及不同培養(yǎng)時(shí)間NK細(xì)胞的殺傷率比較采用隨機(jī)區(qū)組方差分析，以P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)??果

一、NK細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

NK 細(xì)胞 3～?5?h 開(kāi)始貼壁，貼壁后，將懸浮細(xì)胞棄掉，重懸NK細(xì)胞。在IL-2的刺激下第3天開(kāi)始增殖，出現(xiàn)集落，第7天時(shí)集落最多(圖1)。

圖1 奧林巴斯相差顯微鏡下觀察NK細(xì)胞形態(tài)（×100）

二、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NK細(xì)胞表面抗原

收集培養(yǎng)7?d的NK細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為10?×?106/ml。用流式細(xì)胞檢測(cè)儀檢測(cè)細(xì)胞表面CD16，CD56，CD3的表達(dá)率，以確定NK細(xì)胞的純度。結(jié)果CD3-表達(dá)率為96.5﹪,CD3+表達(dá)率為3.1﹪，CD16+和CD56+表達(dá)率為31.0﹪（圖2）。

圖2 誘導(dǎo)培養(yǎng)7d后單個(gè)核細(xì)胞中CD3+與CD3-流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果

三、MTT法檢測(cè)NK細(xì)胞的殺傷活性

本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了5個(gè)時(shí)間點(diǎn)（第1，4，7，14天），3 個(gè)效靶濃度比（5:1、10:1、20:1）（圖3）。從圖中可以看出，第1天和第4天，效靶比為20:1的情況下，殺傷性是最好的，而效靶比在10:1的情況下，殺傷性是最差的；當(dāng)誘導(dǎo)培養(yǎng)到第7天的時(shí)候，開(kāi)始發(fā)生變化，隨著效靶比的比率增高，殺傷性反而降低；誘導(dǎo)培養(yǎng)的第10天，效靶比在10:1的濃度下，殺傷性最好；誘導(dǎo)培養(yǎng)的第14天，效靶比在5:1的情況下，殺傷率是最好的（表1）。

圖3 不同時(shí)間不同效靶濃度的殺傷率

討 論

NK細(xì)胞在感染性疾病中的研究取得了很大的成果。Fortis等[1]報(bào)道了NK細(xì)胞與HIV-1和人T細(xì)胞白血病病毒的相互作用。還有研究報(bào)道：發(fā)現(xiàn)抗鼠巨細(xì)胞病毒需要MHC樣糖蛋白活化Ly49H，闡明了不同種系小鼠對(duì)CMV敏感性不同的可能原因。NK細(xì)胞的激活大多是細(xì)胞因子或趨化因子介導(dǎo)的間接作用，而不是直接的NK受體的作用，所以對(duì)于利什曼病NK細(xì)胞主要是通過(guò)細(xì)胞因子起作用的；另外，NK細(xì)胞還參與錐蟲(chóng)病、鼠弓形體、瘧原蟲(chóng)等早期感染的防御[2-4]。研究者們還利用高時(shí)間分辨膜電容測(cè)定和熒光成像技術(shù)發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞產(chǎn)生分泌性溶酶體，在對(duì)抗腫瘤、抗病毒和細(xì)胞介導(dǎo)的異體移植排斥反應(yīng)中發(fā)揮重要的防御作用[5]。

表1 培養(yǎng)不同時(shí)間NK細(xì)胞的殺傷率（﹪，±s）

表1 培養(yǎng)不同時(shí)間NK細(xì)胞的殺傷率（﹪，±s）

效靶濃度比 例數(shù) 第1天 第4天 第7天 第10天 第14天 F值 P值5:1 3 51.14?±?3.85 47.88?±?2.34 46.71?±?3.41 62.63?±?4.01 72.63?±?2.65 33.829 0.000 10:1 3 45.24?±?5.47 33.44?±?4.13 43.38?±?2.54 63.27?±?3.18 70.51?±?3.27 47.047 0.000 20:1 3 58.86?±?4.12 54.42?±?3.02 35.29?±?2.48 52.84?±?3.60 51.00?±?2.78 22.831 0.000 F值 6.811 32.859 12.797 7.860 49.872 P值 0.029 0.001 0.007 0.021 0.000

NK細(xì)胞作為機(jī)體固有免疫的重要組成部分是機(jī)體抗腫瘤、抗感染的第一道天然防線。隨著對(duì)NK細(xì)胞生物功能及活化機(jī)制的了解，NK細(xì)胞在造血干細(xì)胞/骨髓移植的輔助治療及腫瘤過(guò)繼免疫治療方面的作用倍受關(guān)注。最近在異基因造血干細(xì)胞移植中發(fā)現(xiàn)供者異源反應(yīng)性NK細(xì)胞可以發(fā)揮移植物抗白血病效應(yīng)，并減少移植物抗宿主病的發(fā)生，故輸注供者異源反應(yīng)性NK細(xì)胞已經(jīng)成為臨床移植輔助治療的新策略［6-7］。

本研究用淋巴分離液的方法從外周血分離得到單個(gè)核細(xì)胞，用PME處理除去單個(gè)核巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞，得到較為純化的NK細(xì)胞，用IL-2誘導(dǎo)的方法，純化NK細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：（1）光鏡顯微鏡下，細(xì)胞在誘導(dǎo)的第3天開(kāi)始出現(xiàn)細(xì)胞集落,第7天時(shí)，細(xì)胞的集落最多；（2）流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)結(jié)果，表明細(xì)胞在誘導(dǎo)的第7天，CD3-為 90.5﹪，CD15+CD56+為 31﹪；（3）MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，單個(gè)核細(xì)胞在誘導(dǎo)培養(yǎng)的第1天和第4天，效靶比為20:1的情況下，殺傷性是最好的，而效靶比在10:1的情況下，殺傷性是最差的,當(dāng)誘導(dǎo)培養(yǎng)到第7天的時(shí)候，開(kāi)始發(fā)生變化，隨著效靶比的比率增高，殺傷性反而降低,誘導(dǎo)培養(yǎng)的第10天，效靶比在10:1的濃度下，殺傷性好,誘導(dǎo)培養(yǎng)的第14天，效靶比在5:1的情況下，殺傷率是最好的。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：本研究在用NK細(xì)胞治療患者的時(shí)候應(yīng)該選擇誘導(dǎo)培養(yǎng)了7?d的細(xì)胞，因?yàn)檫@時(shí)候的細(xì)胞首先擴(kuò)增的數(shù)量是最多的，其次殺傷性是最強(qiáng)的，最后就是少量的細(xì)胞就能夠達(dá)到一定的療效。本實(shí)驗(yàn)為NK細(xì)胞應(yīng)用于臨床提供了理論依據(jù)。

1? Fortis?C,?Tasca?S,?Capiluppi?B,?et?al.?Natural?killer?cell?function?in?HIV-1?infected?patients[J].?J?Biol?Regul?Homeost?Agents,?2002,16(1):30-32.

2? Une?C,?Andersson?J,?Eloranta?ML,?et?al.?Enhancement?of?natural?killer(NK)?cell?cytotoxicity?and?induction?of?NK?cell-derived?interferon-gamma?(IFN-gamma)?display?different?kinetics?during?experimental?infection?with?Trypanosoma?cruzi?[J].?Clin?Exp?Immunol,?2000,121(3):?499-505.

3? SherA,?Collazzo?C,?Scanga?C,?et?al.?Induction?and?regulation?of?IL-12-dependent?host?resistance?to?Toxop?lasma?gondii?[J].?Immunol?Res,?2003，27?(2-3):?521-528.

4? Stevenson?MM,?Su?Z,?Sam?H,?et?al.?Modulation?of?host?responses?to?blood-stage?malaria?by?interleukin-12:?from?therapy?to?adjuvant?activity?[J].?Microbes?Infect,?2001,3(1):49-59.

5? Liu?DF,?Xu?L,?Yang?F,?et?al.?Rapid?biogenesis?and?sensitization?of?secretory?lysosomes?in?NK?cells?mediated?by?target-cell?recognition[J].?Proc?Natl?Acad?Sci?USA,?2005,102(1):?123-127.

6? Passweg?JR,?Stern?M,?Koehl?U,?et?al.?Use?of?natural?killer?cells?in?hematopoetic?stem?cell?transplantation[J].?Bone?Marrow?Transplant,?2005,35(7):637-643.

7?李曉紅，高春記.異基因造血干細(xì)胞移植中NK細(xì)胞的作用 [J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志 ,?2006,8(4):?350-354.