非水相介質(zhì)酶法轉(zhuǎn)化制備乙酸3-甲硫基丙醇酯工藝

張佳嬋，王成濤*，趙 磊，尹麗麗，孫寶國

(北京工商大學(xué) 食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點實驗室，北京 100048)

非水相介質(zhì)酶法轉(zhuǎn)化制備乙酸3-甲硫基丙醇酯工藝

張佳嬋，王成濤*，趙 磊，尹麗麗，孫寶國

(北京工商大學(xué) 食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點實驗室，北京 100048)

研究脂肪酶催化合成天然乙酸3-甲硫基丙醇酯的關(guān)鍵因素及條件。結(jié)果表明：固定化脂肪酶Novozym 435是無溶劑體系和正己烷體系中最佳催化劑，加酶量、分子篩用量、乙酸加入次數(shù)、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間等因素對乙酸3-甲硫基丙醇酯合成有重要影響。在無溶劑體系體系，加有1.06g 3-甲硫基丙醇、0.6g乙酸的反應(yīng)中正交試驗設(shè)計優(yōu)化的條件為：加酶量50mg、分子篩加入量2g、反應(yīng)溫度42℃、反應(yīng)總時間30h，乙酸分3次加入，間隔時間為2h，搖床轉(zhuǎn)速為150r/min，乙酸3-甲硫基丙醇酯產(chǎn)率達(dá)42.4%。

3-甲硫基丙醇；乙酸3-甲硫基丙醇酯；脂肪酶Novozym 435；非水相轉(zhuǎn)化；無溶劑體系

3-甲硫基丙醇、乙酸-3-甲硫基丙醇酯(ethyl-3-methyl-thiopropionate，EMTP)、甲酸3-甲硫基丙醇酯(methyl-3-methylthio- propionate，MMTP)天然存在于多種水果、酒中，是3種重要的含硫香料[1-2]，是美國食用香料與提取物制造者協(xié)會公布的安全香料，其FEMA編號分別為3415、3883、2720。EMTP和MMTP具有濃烈的菠蘿香氣，是調(diào)配菠蘿、柑橘、辣根、番茄、洋蔥、豬肉、牛肉、雞肉、巧克力等多種果味香精、肉味香精和酒用香精的常用香料[3]，在烘烤食品、果醬、飲料、糖果、飲料、醫(yī)藥、日化等工業(yè)廣闊應(yīng)用[3]。

目前含硫類香料主要通過化學(xué)合成生產(chǎn)，如乙酸3-甲硫基丙醇酯生產(chǎn)以乙酸鈉(或?qū)妆交撬?為催化劑，3-甲硫基丙醇與乙酸酐或酰氯進(jìn)行酯化反應(yīng)制得[4]，或以甲醇鈉為催化劑，苯為溶劑，通過甲硫醇與丙烯酸乙酯反應(yīng)制備[5]。盡管化學(xué)合成法成本廉價，但存在諸如原料毒性高、合成過程污染大、有毒副產(chǎn)物難于完全去除等弊端[6-7]。

脂肪酶(Lipase，EC 3.1.1.3.)是一類特殊的酯鍵水解酶，脂肪酶不僅能催化甘油脂肪酸酯水解，還能催化酯類物質(zhì)的合成。近年非水介質(zhì)中脂肪酶催化合成生物柴油、酯類成為酶工程的重要研究熱點和綠色化學(xué)主要技術(shù)之一[6,8]。非水相體系酶催化反應(yīng)具有反應(yīng)條件溫和、增加有機底物的溶解性，改變反應(yīng)的平衡方向，提高反應(yīng)的立體選擇性，抑制水參與的副反應(yīng)，易于消除底物和產(chǎn)物的抑制作用等。生物轉(zhuǎn)化制備的香料，其構(gòu)型、手性單一，有助于香氣品質(zhì)的提高，是近年來天然香料制備的重要發(fā)展方向[9-12]。本實驗以發(fā)酵3-甲硫基丙醇和冰醋酸為主要原料，以脂肪酶為催化劑，研究天然乙酸3-甲硫基丙醇酯的生物轉(zhuǎn)化過程，優(yōu)化其非水相條件，揭示其關(guān)鍵因素、反應(yīng)規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

乙酸3-甲硫基丙醇酯 國藥化學(xué)試劑公司；正己烷、叔丁醇、正庚烷、丙酮(均為分析純) 北京化學(xué)試劑公司；Novozym 435、Lipozyme TL 100L 、Greasex 200 MG、Lipopan 50 BG、NovoCor ADL、Lipozyme TL 1M、Lipex 100T 丹麥諾維信公司；3-甲硫基丙醇、乙酸(發(fā)酵法制得) 本課題組制。

LC-20A型高效液相色譜儀 島津國際貿(mào)易有限公司；HQ45恒溫?fù)u床 中國科學(xué)院武漢科學(xué)儀器廠；DF-101S磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 液相色譜條件

ODS-SP色譜柱(4.6mm×150mm)，二極管陣列檢測器，流動相：甲醇-水(60:40，V/V)，柱溫為室溫，進(jìn)樣量20μL。

1.2.2 3-甲硫基丙醇、乙酸3-甲硫基丙醇酯的液相色譜測定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：配制系列乙酸3-甲硫基丙醇酯的甲醇溶液，液相色譜儀檢測，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。3-甲硫基丙醇和乙酸3-甲硫基丙醇酯在此條件下其保留時間分別為4.1、16.35min。

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y＝3×106x＋475726，R2＝0.9972(y為峰面積/μV；x為乙酸3-甲硫基丙醇酯質(zhì)量濃度/(mg/mL))。

樣品處理：取反應(yīng)后的樣品200μL，用甲醇稀釋至10mL，過0.45μm微孔濾膜后進(jìn)液相檢測。

式中： m為反應(yīng)結(jié)束后生成乙酸3-甲硫基丙醇酯的質(zhì)量；M為理論生成乙酸3-甲硫基丙醇酯的質(zhì)量。

1.2.3 脂肪酶篩選

溶劑體系：在25mL具塞三角瓶中加入3-甲硫基丙醇1.06g(0.01mol)、乙酸0.6g(0.01mol)和反應(yīng)溶劑10mL(依次為正己烷、丙酮、正庚烷、叔丁醇)，加入同等質(zhì)量的脂肪酶，于45℃、150r/min、密封反應(yīng)6h。所用脂肪酶為NovoCor ADL、Lipozyme TL 100L、Novozyme 435、Greasex 200 MG、Lipopan 50 BG、Lipozyme TL IM、Lipex 100T。液相色譜法測定乙酸3-甲硫基丙醇酯產(chǎn)率。

無溶劑體系：在25mL具塞三角瓶中加入3-甲硫基丙醇1.06g(0.01mol)和乙酸0.6g(0.01mol)，加入同等質(zhì)量的脂肪酶，于45℃、150r/min、密封反應(yīng)6h。所用脂肪酶為NovoCor ADL、Lipozyme TL 100L、Novozyme 435、Greasex 200 MG、Lipopan 50 BG、Lipozyme TL IM、Lipex 100T。液相色譜法測定乙酸3-甲硫基丙醇酯產(chǎn)率。

1.2.4 溶劑篩選

在分別裝有10mL正己烷、10mL丙酮、10mL正庚烷、10mL叔丁醇溶劑以及無溶劑的25mL具塞三角瓶中，加入3-甲硫基丙醇1.06g(0.01mol)、乙酸0.6g(0.01mol)和Novozym 435脂肪酶50mg。在45℃、搖床轉(zhuǎn)速150r/min條件下密封反應(yīng)6h。液相色譜法測定乙酸3-甲硫基丙醇酯產(chǎn)率。

1.2.5 各因素條件對乙酸3-甲硫基丙醇酯合成反應(yīng)的影響

在無溶劑體系下、加有1.06g 3-甲硫基丙醇，0.6g乙酸的反應(yīng)容器中，分別考察乙酸加入次數(shù)、反應(yīng)溫度、Novozym 435加酶量、分子篩用量、反應(yīng)時間等因素對乙酸3-甲硫基丙醇酯產(chǎn)率的影響，反應(yīng)物用液相色譜法測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪酶的篩選

以發(fā)酵3-甲硫基丙醇、乙酸為主要原料，選擇Novozym 435、Lipozyme TL等7種酶分別為催化劑，在無溶劑和有機溶劑體系的非水相條件下考察其乙酸3-甲硫基丙醇酯產(chǎn)率，其結(jié)果見圖1、2。

圖1、2結(jié)果表明，在考察的7種脂肪酶、2種反應(yīng)體系中，固定化Novozym 435催化合成EMTP的產(chǎn)率最高為7%，Lipex 100T有較弱的催化能力，合成產(chǎn)率約為2%，其他脂肪酶的催化產(chǎn)率都很低；有機溶劑對脂肪酶的催化活性有重要影響，實驗4種有機溶劑體系中，正己烷體系EMTP產(chǎn)率為最高，丙酮體系其產(chǎn)率為最低；采用無溶劑反應(yīng)體系Novozym 435催化合成EMTP產(chǎn)率為7%，Lipex 100T在溶劑中未表現(xiàn)出催化活性。本實驗采用無溶劑體系中固定化Novozym 435催化合成EMTP。

圖1 無溶劑體系中不同脂肪酶對EMTP產(chǎn)率的影響Fig.1 Effect of lipase type on the yield of EMTP in solvent-free system

圖2 有機溶劑體系中不同脂肪酶對EMTP產(chǎn)率的影響Fig. 2 Effect of lipase type on the yield of EMTP in organic solvent system

2.2 多種因素條件對乙酸3-甲硫基丙醇酯合成反應(yīng)的影響

2.2.1 乙酸加入次數(shù)對乙酸3-甲硫基丙醇酯合成反應(yīng)的影響

圖3 乙酸加入次數(shù)對EMTP產(chǎn)率的影響Fig.3 Effect of times of acetic acid addition on the yield of EMTP in solvent-free system

圖3結(jié)果表明，乙酸1次性加入，產(chǎn)物EMTP的產(chǎn)率很低；而將同等質(zhì)量的乙酸分3～4次均勻加入時EMTP的產(chǎn)率較高，約為8.5%。說明乙酸添加次數(shù)對脂肪酶的催化活性和產(chǎn)物EMTP的產(chǎn)率有重要影響，其原因可能是乙酸影響了反應(yīng)體系pH值及其微環(huán)境，在低pH值環(huán)境下脂肪酶的三維結(jié)構(gòu)會發(fā)生改變，使酶的活性位點被“蓋”起來，導(dǎo)致酶活性降低[11]。

2.2.2 反應(yīng)溫度對乙酸3-甲硫基丙醇酯合成反應(yīng)的影響

圖4 反應(yīng)溫度對EMTP產(chǎn)率的影響Fig.4 Effect of reaction temperature on the yield of EMTP in solvent-free system

溫度對酶的催化活性及效率有重要影響，一般高溫有利于酶促反應(yīng)速度，但高溫會降低酶的穩(wěn)定性，進(jìn)而降低酶的使用次數(shù)。圖4表明，在反應(yīng)溫度30～50℃范圍內(nèi)，反應(yīng)溫度45～50℃時產(chǎn)物EMTP較高，產(chǎn)率為11%左右。

2.2.3 加酶量對乙酸3-甲硫基丙醇酯合成反應(yīng)的影響

圖5 固定化Novozym 435酶用量對EMTP產(chǎn)率影響Fig.5 Effect of Novozym 435 amount on the yield of EMTP in solvent-free system

圖5顯示，在1.2.5節(jié)條件下無溶劑反應(yīng)體系中固定化Novozym 435加入50mg以上時，產(chǎn)物乙酸3-甲硫基丙醇酯產(chǎn)率達(dá)到較高，約為7%，繼續(xù)增加脂肪酶用量其產(chǎn)率提高并不明顯。

2.2.4 吸水劑分子篩用量對乙酸3-甲硫基丙醇酯合成反應(yīng)的影響

已證實分子篩除具有吸水作用外不具有催化反應(yīng)的能力，結(jié)果見圖6。在無脂肪酶存在的情況下，是否添加分子篩對EMTP的產(chǎn)率沒有影響，同時添加脂肪酶與分子篩后，EMTP產(chǎn)率較單純添加脂肪酶的產(chǎn)率高。分子篩的添加量對反應(yīng)效果的影響見圖7，表明隨著分子篩用量的增加，產(chǎn)物EMTP產(chǎn)率逐漸增高，當(dāng)加入分子篩2g 時，其產(chǎn)物EMTP達(dá)到最高，產(chǎn)率約為28.8%。原因可能為，脂肪酶可同時催化酯類水解和酯類合成的可逆反應(yīng)，3-甲硫基丙醇、乙酸為底物的酯類合成反應(yīng)是一產(chǎn)生水的可逆反應(yīng)，酯化反應(yīng)和水解反應(yīng)是同時進(jìn)行，其方向決定于外界條件、環(huán)境，加入分子篩吸水劑，有利于酯化反應(yīng)的進(jìn)行，提高EMTP的轉(zhuǎn)化率，因此分子篩吸水劑的添加量對非水相條件脂肪酶催化活性及轉(zhuǎn)化率有重要影響。

研究[13-15]表明，脂肪酶表面水分子是維持其活性的重要因素，非水介質(zhì)并非完全沒有水，一般是指水分含量在0.01%以下的體系。如果完全沒有水，將會導(dǎo)致酶構(gòu)象的劇烈變化甚至失活；酶的催化活性靠著與之緊靠的一層左右的水分子來維持，如果這層水分子能夠被限制在酶表面，其余水分足以用有機溶劑來替代，就不至于使酶催化能力降低或喪失。

圖6 分子篩吸水作用的研究Fig.6 Water-absorbing capacity of molecular sieve

圖7 分子篩用量對乙酸3-甲硫基丙醇酯產(chǎn)率的影響Fig.7 Effect of molecular sieve amount on the yield of EMTP in solvent-free system

2.2.5 反應(yīng)時間對乙酸3-甲硫基丙醇酯合成反應(yīng)的影響

單因素試驗顯示固定化Novozym 435酶用量50mg、分子篩2g、45℃、乙酸分3～4次均勻加入是較好的反應(yīng)條件，在此條件下研究無溶劑反應(yīng)體系中反應(yīng)時間對催化反應(yīng)效果的影響，其結(jié)果見圖8，當(dāng)反應(yīng)總時間為30h時產(chǎn)物EMTP產(chǎn)率較高約為37.6%。

圖8 反應(yīng)時間對乙酸3-甲硫基丙醇酯產(chǎn)率的影響Fig.8 Effect of reaction time on the yield of EMTP in solvent-free system

2.3 正交試驗設(shè)計優(yōu)化乙酸3-甲硫基丙醇酯的轉(zhuǎn)化條件

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取對非水相酶法轉(zhuǎn)化EMTP影響較大的4個因素：酶加入量、分子篩加入量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間，采用L9(34)正交試驗設(shè)計優(yōu)化其轉(zhuǎn)化條件，其結(jié)果見表1。 極差分析無溶劑系統(tǒng)中4種因素對乙酸3-甲硫基丙醇酯轉(zhuǎn)化率影響主次順序為：B＞D＞A＞C，即反應(yīng)時間＞分子篩用量＞反應(yīng)溫度＞加酶量，最優(yōu)水平為：A3B2C2D2，即反應(yīng)溫度42℃、反應(yīng)時間30h、脂肪酶用量50mg、分子篩用量2g。

表1 乙酸3-甲硫基丙醇酯轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化正交試驗設(shè)計與結(jié)果Table 1 Orthgonal array experimental results and analysis

2.4 驗證實驗

在2.3節(jié)最優(yōu)條件下，進(jìn)行3組平行驗證實驗，3組實驗結(jié)果無明顯差異，EMTP產(chǎn)率達(dá)到42.4%，表明正交試驗優(yōu)化的工藝條件可行。

3 結(jié) 論

在無溶劑體系中固定化脂肪酶Novozym435為最佳催化劑，酶用量、分子篩用量、乙酸加入次數(shù)、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間為對EMTP合成反應(yīng)產(chǎn)率和酶活力有重要影響的因素。無溶劑條件下正交試驗設(shè)計優(yōu)化后的條件為3-甲硫基丙醇1.06g(0.01mol)、乙酸0.6g(0.01mol)。體系加酶量50mg、分子篩加入量2g、反應(yīng)溫度42℃，乙酸分3次加入，間隔時間為2h，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，反應(yīng)總時間30h，在此條件下其乙酸3-甲硫基丙醇酯產(chǎn)率達(dá)到42.4%。

[1] 孫寶國. 食品添加劑[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2008: 59-85.

[2] 孫寶國, 何堅. 香料化學(xué)與工藝學(xué)[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2004:1-125.

[3] 孫寶國. 食用調(diào)香術(shù)[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2003: 50-99.

[4] 劉玉平, 孫寶國, 鄭福平. 食用香料乙酸3-甲硫基丙醇酯的合成研究[J]. 食品添加劑, 2005, 26(2): 15-160.

[5] LIU Yuping, CHEN Haitao, YIN Decai, et al. Synthesis and odor evaluation of five new sulfur- containing ester flavor compounds from 4-ethyloctanoic acid[J]. Molecules, 2010, 15(8): 5104-5111.

[6] BOMMARUS A S, POLIZZI K M. Novel biocatalysts: recent developments[J]. Chemical Engineering Science, 2006, 61(3): 1004-1016.

[7] MOSCIANO G, FASANO M. Organoleptic characteristics of flavor materials[J], Perfumer & Flavorist, 1995, 20(1): 31-33.

[8] GOLDBERG K, SCHROER K, LTZ S, et al. Biocatalytic ketonereduction: a powerful tool for the production of chiral alcohols:part Ⅰ: processes with isolated enzymes[J]. Applied Microbiology &Biotechnology, 2007, 76(2): 237-248.

[9] WOODLEY J M. New opportunities for biocatalysis:makingpharmaceutical processes greener[J]. Trends in Biotechnology,2008, 26(6): 321-327.

[10] PHILIPPE P, OLIVER D. Methionine catabolism in Saccharomyces cerevisiae[J]. FEMS Yeast Research, 2006, 6(1): 48-56.

[11] YADAV G D, TRIVEDI A H. Kinetic modeling of immobilized-lipase catalyzed transesterificatin of n-octanol with vinyl acetate in nonaqueous media[J]. Enzyme and Microbiology Technology. 2003, 32(7): 783-789.[12] ETSCHMANN M M W, KTTER P, HAUF J. Production of the aroma chemicals 3-(methylthio)-1-propanol and 3-(methylthio)-propylacetate with yeasts[J]. Applied Microbiology & Biotechnology,2008, 80(4): 579-587.

[13] 張東浩. 脂肪酶催化吡哆醇區(qū)域選擇性酯化及其酶學(xué)特性研究[D].天津: 天津大學(xué), 2007.

[14] 張娜, 劉均洪. 酶在接近無水有機介質(zhì)中的生物催化特性[J]. 工業(yè)催化, 2005, 13(7): 48-51.

[15] CARLQVIST P, SVEDENDAHL M, BRANNEBY C, et al. Exploring the active-site of a rationallyredesigned lipase for catalysis of michaeltype additions[J]. Chembio Chem, 2005, 6(2): 331-336.

Lipase-Catalyzed Conversion in Non-aqueous Media for the Preparation of Ethyl-3-methyl-thiopropionate

ZHANG Jia-chan，WANG Cheng-tao*，ZHAO Lei，YIN Li-li，SUN Bao-guo
(Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients, Beijing Key Laboratory of Flavor Chemistry,Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)

Ethyl-3-methyl-thiopropionate (EMTP) is an important kind of spice. The key factors and conditions for biocatalytic synthesis of EMTP in non-aqueous system were studied in the paper. The results indicated that the best catalyst in solvent-free medium or normal hexane was Novozym 435. Catalyst dosage, the amount of molecular sieve addition, the number of acetic acid addition, reaction temperature and reaction time were important factors for EMTP synthesis. The optimal preparation conditions, as determined using orthogonal array design method, were 50 mg of Novozym 435, 2 g of molecular sieve, 42 ℃ of reaction temperature, 30 h of reaction time, three times of acetic acid addition with an interval of 2 h, and 150 r/min of shaking speed. The yield of EMTP reached up to 42.4% in solvent-free medium under the optimal conditions.

3-(methylthio)-propane；ethyl-3-methyl-thiopropionate；Novozym 435；conversion in non-aqueous media；solvent-free system

TS202.3

A

1002-6630(2012)08-0001-05

2011-07-28

國家自然科學(xué)基金面上項目(31071593)；北京市教委科技面上項目(KM201110011001)；北京市屬高等學(xué)校人才強教計劃項目(PHR201008237)

張佳嬋(1987—)，女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：xiaochan8787@163.com

*通信作者：王成濤(1969—)，男，教授，博士，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：wct5566@163.com