茯苓總?cè)茖π∈蟾螕p傷的預(yù)防作用

張先淑，饒志剛，胡先明,*，劉 鵬

(1.重慶工貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，重慶 408000；2. 病毒學(xué)國家重點實驗室，組合生物合成與新藥發(fā)現(xiàn)教育部重點實驗室，武漢大學(xué)藥學(xué)院，湖北 武漢 430071)

茯苓總?cè)茖π∈蟾螕p傷的預(yù)防作用

張先淑1，饒志剛2，胡先明2,*，劉 鵬2

(1.重慶工貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，重慶 408000；2. 病毒學(xué)國家重點實驗室，組合生物合成與新藥發(fā)現(xiàn)教育部重點實驗室，武漢大學(xué)藥學(xué)院，湖北 武漢 430071)

目的：研究茯苓三萜對四氯化碳(CCl4)所致小鼠肝損傷的治療作用。方法：將小鼠隨機分為正常組、模型組、聯(lián)苯雙酯組及茯苓三萜高、中、低劑量組共6組。小鼠腹腔注射CCl4橄欖油溶液造模。治療組以高、中、低劑量(180、90、45mg/(kg·d))茯苓三萜進(jìn)行灌胃，陽性藥物對照組用聯(lián)苯雙酯滴丸(180mg/(kg·d))，皆以1g/100mL羧甲基纖維素鈉溶液混懸，0.2mL/10g體質(zhì)量進(jìn)行灌胃；正常組與模型組以0.9%生理鹽水(0.2mL/10g)體質(zhì)量灌胃。最后摘眼球取血，收集血清，檢測丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性；以及小鼠肝組織HE染色后做病理切片觀察。結(jié)果：與模型組相比茯苓三萜治療組能夠顯著降低小鼠血清中AST、ALT活性。病理切片清楚地顯示茯苓三萜能夠顯著減輕小鼠肝損傷的程度。結(jié)論：茯苓三萜對CCl4所致的小鼠肝損傷有明顯治療作用。

茯苓三萜；小鼠；肝損傷；四氯化碳；治療作用

茯苓為多孔菌科真菌茯苓(Poria cocos(schw.)wolf)的干燥菌核[1]。它為我國常用中藥，是多種方藥及中成藥的原料，以茯苓為原料配伍的中成藥有300 多種[2]。它具有利水消腫、滲濕、健脾、寧心的功效，其主要化學(xué)成分為多糖、三萜類化合物(茯苓酸、茯苓素)等。三萜類化合物具有免疫調(diào)節(jié)[3]、抗氧化[4]、抗炎癥[5]、抗腫瘤[6]等活性，國內(nèi)外對茯苓三萜類成分及其生物活性等方面做了一些研究。但茯苓總?cè)频谋８位钚晕匆妶蟮?。?jù)此，本實驗選用四氯化碳致小鼠肝損傷模型對茯苓總?cè)频谋８巫饔米隽顺醪窖芯俊?/p>

1 材料與方法

1.1 動物

昆明種小鼠，雌性，體質(zhì)量 25～28g；實驗動物由武漢大學(xué)動物實驗中心提供，S P F級，許可證號SCXK(鄂)2008-2004。自由飲水，攝食。

1.2 藥物與試劑

茯苓總?cè)?溶劑法提取)、熊果酸標(biāo)品(純度＞98%) 上海友思生物技術(shù)有限公司；聯(lián)苯雙酯滴丸(保肝藥物) 浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠；生理鹽水(0.9%)、CCl4(分析純) 江蘇強盛化工有限公司；羧甲基纖維素鈉(化學(xué)純)、橄欖油(化學(xué)純) 國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；722型可見分光光度計 廣州市科迅實驗器材有限公司；7170型全自動生化分析儀 珠海森龍生物科技有限公司；JA3103N型電子天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；16K臺式離心機 珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司；XSP-6CA光學(xué)顯微鏡 上海團結(jié)制造廠。

1.4 方法

1.4.1 茯苓總?cè)铺崛7]

稱取500g茯苓干燥藥材，粉碎，過20目篩，加藥材量6倍體積的95%乙醇浸泡 48h后過濾，回收乙醇，所得黑褐色浸膏懸浮于水中，用 250mL 乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，回收乙酸乙酯，得棕黃色濃縮液。

1.4.2 總?cè)贫ㄐ澡b定[7]

取20mg 總?cè)迫苡?mL醋酐中，加濃硫酸-醋酐(體積比1:20)5mL，觀察溶液顏色變化。

1.4.3 總?cè)坪繙y定[8]

以熊果酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用香草醛-冰乙酸-高氯酸顯色法，參照文獻(xiàn)[10]用分光光度法，按照公式(1)計算出茯苓總?cè)频暮俊?/p>

式中：ρ為樣品液中三萜質(zhì)量濃度/(g/L)；V為樣品液體積/L；m為樣品質(zhì)量/g。

1.4.4 CCl4致小鼠肝損傷的治療作用[9]

昆明種小鼠7 2只，雌性，隨機均分為6組，每組12只。分別為茯苓三萜高、中、低劑量組，模型對照組、正常組和聯(lián)苯雙酯組。實驗前稱小鼠體質(zhì)量，給藥組及對照組皆從實驗第1天起，每天上午腹腔注射0.2% CCl4橄欖油溶液0.1mL/10g。同日下午，給藥組以高、中、低劑量分別為180、90、45mg/(kg·d)的茯苓三萜，用1g/100mL羧甲基纖維素鈉混懸( 0.2 mL/10g體質(zhì)量)灌胃；聯(lián)苯雙酯組以聯(lián)苯雙酯180mg/(kg·d)劑量，用1g/100mL羧甲基纖維素鈉混懸灌胃，0.2mL/10g體質(zhì)量；正常組與模型對照組均灌服0.9%的生理鹽水，0.2mL/10g體質(zhì)量。第2～4天每天上午給藥同上，第4天下午再重復(fù)注射CCl41次，最后一次處理完后，所有組的小鼠都禁食不禁水。第5天上午稱小鼠體質(zhì)量后摘眼球取血，分離血清，用自動生化分析儀測定ALT與AST。處死動物，剖腹取肝臟與脾臟，分別稱質(zhì)量后，計算臟器指數(shù)；然后取肝右葉，固定于10%中性甲醛液中，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察肝組織病理學(xué)改變。

1.4.5 觀察指標(biāo)及其方法

1.4.5.1 血清中生化指標(biāo)的測定

用7170型全自動生化分析儀測定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)。

1.4.5.2 肝臟指數(shù)與脾臟指數(shù)的測定

處死動物，剖腹取肝臟與脾臟，分別稱質(zhì)量，肝臟指數(shù)(肝體比)與脾臟指數(shù)(脾體比)的測定分別按照公式(2)、(3)計算。

式中：m1為肝濕質(zhì)量/g；m為體質(zhì)量/g；m2為脾濕質(zhì)量/g。

1.4.5.3 肝臟組織形態(tài)學(xué)觀察

取肝右葉組織置于10%中性甲醛液中固定，石蠟包埋，切片，作HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織形態(tài)學(xué)變化情況。

1.4.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 茯苓總?cè)贫ㄐ苑治雠c含量測定

2.1.1 總?cè)贫ㄐ澡b定

取20mg 總?cè)迫苡?5mL 醋酐中，加濃硫酸-醋酐(體積比 1:20) 5mL，溶液由黃變紅，逐漸變紫變藍(lán)，最后褪色。證明提取物中含有三萜類。

表2 小鼠體質(zhì)量與肝臟及脾臟質(zhì)量(±s，n=12)Table 2 Body, liver and speen weights of mice in each group(±s，n=12)

表2 小鼠體質(zhì)量與肝臟及脾臟質(zhì)量(±s，n=12)Table 2 Body, liver and speen weights of mice in each group(±s，n=12)

注：a.與模型組相比，差異顯著(P＜0.05)；b. 與模型組相比，差異極顯著(P＜0.01)。

組別 實驗前體質(zhì)量/g 實驗后體質(zhì)量/g 肝臟質(zhì)量/g 脾臟質(zhì)量/g 肝臟指數(shù) 脾臟指數(shù)正常組 27.85±9.14 28.17±21.82 1.11±0.04a 0.071±3.25×10-5 3.961±0.3341b 0.2552±0.001379模型組 27.59±9.87 27.77±25.27 1.63±0.28 0.077±0.00035 5.756±1.070 0.2744±0.0008910聯(lián)苯雙酯組 27.32±10.32 27.33±14.00 1.53±0.07 0.077±0.00035 5.646±0.7525 0.2586±0.006147低劑量組 25.28±14.81 26.02±20.33 1.48±0.27 0.073±0.00015 5.576±1.515 0.2810±0.0004020中劑量組 27.50±5.41 27.58±11.14 1.44±0.07 0.070±2.45×10-5 5.189±0.2665 0.2566±0.0009330高劑量組 27.54±4.77 28.04±8.93 1.46±0.08 0.070±0.00019 5.165±0.3689 0.2494±0.002025

2.1.2 總?cè)坪繙y定

由標(biāo)準(zhǔn)曲線可得回歸方程為y＝0.08390.0902(R2＝0.9993)，其中，x為樣品中茯苓總?cè)坪?(mg/mL)，y為吸光度。經(jīng)實驗測得樣品液的吸光度為0.337。由上述回歸方程計算得樣品液中三萜含量為2.56mg/mL；三萜的百分含量為1.27%。

2.2 血清學(xué)檢測

表1 茯苓三萜對小鼠血清ALT與AST活性的影響(±s，n=12)Table 1 Effect of Poria cocos triterpenes on serum ALT and AST in mice(±s，n=12)

表1 茯苓三萜對小鼠血清ALT與AST活性的影響(±s，n=12)Table 1 Effect of Poria cocos triterpenes on serum ALT and AST in mice(±s，n=12)

注：a.與模型組相比，差異極顯著(P＜0.01)；b.與正常組相比，差異極顯著(P＜0.01)。

組別 AST活力/( U/mL) ALT活力/( U/mL)正常組 44.00±24.96 32.22±3.95模型組 139.33±8.21b 286.56±12.15b聯(lián)苯雙酯組 84.00±8.50a 188.67±26.75a低劑量組 123.56±7.09a 258.00±13.40a中劑量組 116.11±9.16a 216.11±9.57a高劑量組 88.78±5.70a 207.22±21.69a

由表1可知，模型組小鼠血清AST、ALT活力較正常組明顯升高(P＜0.01)，茯苓三萜各治療組AST、ALT活力明顯低于模型組(P＜0.01)，且各劑量組之間存在量效關(guān)系。

2.3 CCl4致小鼠肝損傷的臟器指數(shù)

由表2可知，正常組肝臟質(zhì)量與模型組比較，差異顯著(P＜0.05)，說明CCl4會使小鼠肝臟明顯腫大；茯苓三萜低、中、高劑量組與模型組比較，能降低肝臟質(zhì)量，但差異不顯著(P＞0.05)，無統(tǒng)計學(xué)意義。正常組肝臟指數(shù)與模型組比較，差異極顯著(P＜0.01)，說明CCl4會使小鼠肝臟指數(shù)增大；茯苓三萜低、中、高劑量組與模型組比較，能降低肝臟質(zhì)量指數(shù)，但差異不顯著(P＞0.05)，無統(tǒng)計學(xué)意義。

正常組脾臟質(zhì)量與模型組比較，CCl4會使小鼠脾臟腫大，但差異不顯著(P＞0.05)，無統(tǒng)計學(xué)意義；茯苓三萜低、中、高劑量組與模型組比較，能降低脾臟質(zhì)量，但差異不顯著(P＞0.05)，無統(tǒng)計學(xué)意義。正常組脾臟指數(shù)與模型組比較，CCl4會使小鼠脾臟指數(shù)增大，但差異不顯著(P＞0.05)，無統(tǒng)計學(xué)意義；茯苓三萜中、高劑量組與模型組比較，能降低脾臟指數(shù)，但差異不顯著(P＞0.05)，無統(tǒng)計學(xué)意義。

由此說明CCl4會使小鼠肝臟和脾臟腫大，使肝臟和脾臟指數(shù)增大；而茯苓三萜能適當(dāng)抑制CCl4所致的小鼠肝臟和脾臟腫大。

2.4 肝組織病理切片

圖1 肝臟病理切片(×100)Fig.1 Pathological analysis of liver tissues by HE staining (×100)

由圖1可知，模型組小鼠肝組織鏡下可見肝小葉結(jié)構(gòu)稍紊亂，肝小葉內(nèi)肝細(xì)胞大部分腫脹，細(xì)胞質(zhì)疏松，部分肝細(xì)胞氣球樣變，脂肪變性，匯管區(qū)少許炎癥細(xì)胞浸潤，無明顯壞死。對于CCl4引起的肝臟組織病理病變，茯苓三萜低、中、高劑量組能減輕肝細(xì)胞腫脹，對CCl4引起的急性肝損傷有明顯的保護作用。其中茯苓三萜低劑量組使肝小葉結(jié)構(gòu)有所改善，但纖維化、脂肪變性仍明顯；茯苓三萜中劑量組使纖維化改善，脂肪變性仍較明顯，膠原纖維間隔較少；茯苓三萜高劑量組使輕度脂肪變性且僅有少量纖維組織，小葉結(jié)構(gòu)明顯改善，肝小葉多呈放射狀分布，匯管區(qū)結(jié)締組織增生不明顯；聯(lián)苯雙酯陽性對照組使細(xì)胞腫脹、氣球樣變、肝竇充血明顯減輕。而正常組則肝組織結(jié)構(gòu)正常，無脂滴、腫脹、炎癥細(xì)胞浸潤。

3 討 論

運用經(jīng)典的CCl4模型，同時以低、中、高劑量茯苓三萜給予治療，通過血清學(xué)指標(biāo)檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)茯苓三萜能夠有效降低上述指標(biāo)，表明其對受損肝臟有保護作用；另外從肝組織病理切片發(fā)現(xiàn)治療組的肝纖維化病變得到改善，并且呈現(xiàn)劑量相關(guān)性。這為茯苓作為保肝功能的保健食品開發(fā)提供了前景。當(dāng)然，已有研究[10-12]顯示MMP-2是肝臟最重要的病變因子，可能參與了肝細(xì)胞變形的發(fā)生、發(fā)展。本實驗只探討了茯苓三萜抗肝損傷的作用，而它的作用機制還需通過TGF-β1mRNA及MMP-2等的表達(dá)做進(jìn)一步研究。

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Preventive Effect of Triterpenes fromPoria cocoson Liver Injury in Mice

ZHANG Xian-shu1，RAO Zhi-gang2，HU Xian-ming2,*，LIU Peng2
(1. Chongqing Industry and Trade Polylechnic, Chongqing 408000, China；2. State Key Laboratory of Virology, Key Laboratory of Combinatorial Biosynthesis and Drug Discovery,Ministry of Education; School of Pharmaceutical Sciences, Wuhan University, Wuhan 430071, China)

Objective ：To explore the preventive effect of triterpenes fromPoria cocoson carbon tetrachloride-induced liver injury in mice. Methods: Kunming mice were randomly divided into normal group, model group, (dimethyl diphenyl bicarboxylate,DDB) positive control group, and low-, middle- and high-dose treatment groups. Mouse models of liver injury were created by intraperitoneal injection of CCl4. The high-, middle- and low-dose treatment groups were orally administered with triterpenes fromPoria cocosat doses of 180, 90 mg/(kg· d) and 45 mg/(kg·d), respectively. The positive control group was orally administered with DDB at a dose of 180 mg/(kg·d). Both drugs were separately suspended in 1 g/100 mL CMC-Na solution before administration and given at a level of 0.2 mL/10 g body weight. The normal and model groups were given 0.9% normal saline at a level of 0.2 mL/10 g body weight. The serum AST and ALT activities were determined and liver injury was evaluated by HE staining. Results: Compared with the model group, the three treatment groups showed significantly lower AST and ALT activities. In addition,Poria cocostriterpenes could significantly attenuate liver injury in mice. Conclusion:Poriacocostriterpenes have obvious protective effect on CCl4-induced liver injury in mice.

Poria cocostriterpenes；mice；liver injury；carbon tetrachloride；treatment efficacy

TS201.21

A

1002-6630(2012)15-0270-04

2011-07-06

國家科技部重大專項(2009ZX09301-14-1)

張先淑(1972—)，女，講師，本科，研究方向為生物化學(xué)與天然藥物學(xué)。E-mail：czqpeng@126.com

*通信作者：胡先明(1951—)，男，教授，博士，研究方向為藥物化學(xué)與保健食品。E-mail：xmhu@whu.edu.cn