兒茶素和表兒茶素異構(gòu)體的高效逆流色譜分離制備

成 超，尹 鷺，曹學(xué)麗*，徐 靜

(北京工商大學(xué)食品學(xué)院，食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京 100048)

兒茶素和表兒茶素異構(gòu)體的高效逆流色譜分離制備

成 超，尹 鷺，曹學(xué)麗*，徐 靜

(北京工商大學(xué)食品學(xué)院，食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京 100048)

應(yīng)用高效逆流色譜法(HPCCC)對(duì)茶葉中的兒茶素和表兒茶素兩種同分異構(gòu)體的分離制備方法進(jìn)行研究。結(jié)果表明：以正己烷-乙酸乙酯-水(體積比1:20:20)為兩相溶劑系統(tǒng)，上相為固定相，下相為流動(dòng)相，可以實(shí)現(xiàn)兒茶素和表兒茶素的完全分離。采用138mL的分離柱、1g兒茶素粗提物，在120min內(nèi)一次制備即可得到純度在95%以上的表兒茶素約35mg，純度在99%以上的兒茶素325mg，純度90%～99%的兒茶素100mg。

表兒茶素；兒茶素；異構(gòu)體；高效逆流色譜；分離制備

兒茶素(catechins，C)又稱茶單寧、兒茶酚，是茶葉中黃烷醇類物質(zhì)的總稱，是綠茶中最主要的生物活性成分，其含量可占到茶葉干質(zhì)量的15%～35%[1]。大量研究表明，兒茶素具有有效清除自由基、抗氧化、抗菌消炎、抗病毒、抗癌抗突變、改善心血管疾病癥狀及調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的作用[2-4]。

茶葉中的兒茶素分為表型和非表型兩大類，其中以表型的表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)和表兒茶素沒食子酸酯(epicatechin gallate，ECG)的含量最為豐富，約占兒茶素總量的70%[5]。近年來的研究表明，茶葉中兒茶素的表型和非表型異構(gòu)化與其清除自由基活性之間有著密切的關(guān)系[6]。因此對(duì)茶葉中不同兒茶素類成分的分離制備方法研究及對(duì)于其構(gòu)效關(guān)系的深入研究具有重要意義。

已經(jīng)有眾多文獻(xiàn)報(bào)道[7-11]茶葉中的兒茶素類成分的分離，但大多采用傳統(tǒng)的柱色譜方法。高效逆流色譜(high-performance counter-current chromatography，HPCCC)是一種連續(xù)高效的快速液-液分配色譜分離技術(shù)[12-13]。由于其無需任何固體分離介質(zhì)，物質(zhì)之間依據(jù)分配系數(shù)的不同而實(shí)現(xiàn)分離，因此它具有制備量大、分離效率高、回收率高等優(yōu)勢(shì)，廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物中活性物質(zhì)的分離制備。逆流色譜在兒茶素類物質(zhì)的分離制備中也有廣泛的應(yīng)用[14-18]。

兒茶素(C)和表兒茶素(epicatechin，EC)(圖1)是茶葉中存在含量較低的一對(duì)異構(gòu)化兒茶素，對(duì)二者的大量制備分離方法的研究報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)對(duì)高效逆流色譜法制備分離茶葉提取物中兒茶素和表兒茶素異構(gòu)體方法及放大分離的可行性進(jìn)行研究，為兒茶素和表兒茶素單體的大量制備提供參考。

圖1 兒茶素(C)和表兒茶素(EC)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Chemical structures of catechin and epicatechin

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

兒茶素粗提物(綠茶提取物分離) 北京綠色金可生物技術(shù)公司；兒茶素、表兒茶素對(duì)照品 中國(guó)食品藥品檢定研究院；正己烷、乙酸乙酯 北京化工廠；N,N-二甲基甲酰胺、冰乙酸(色譜純) 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；甲醇(色譜純) 美國(guó)Fisher Scientific公司；純水由Millipore-Q純水機(jī)自制。

1.2 儀器與設(shè)備

1100高效液相色譜儀(配有四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、二極管陣列檢測(cè)器)、高效逆流色譜儀 (配有22.5mL分析柱和138mL制備柱兩種分離柱，聚四氟乙烯管內(nèi)徑0.8mm；同時(shí)配低壓梯度泵及可變波長(zhǎng)檢測(cè)器) 美國(guó)Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 高效逆流色譜分離溶劑體系選擇

采用分析型逆流色譜分析柱，以正己烷-乙酸乙酯-水為兩相溶劑體系，首先配制兩相溶劑不同體積比(1:6:6、1:10:10、1:20:20、0:1:1)的溶劑體系，將其充分混合后，靜置分層，上相為固定相，下相為流動(dòng)相，進(jìn)行條件優(yōu)化，選出最佳溶劑體系。操作條件：分離柱體積：22.5mL；轉(zhuǎn)速：1600r/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm；流速：1.0mL/min；進(jìn)樣量：20mg；分離溫度：30℃。

1.3.2 制備高效逆流色譜分離條件

經(jīng)過分析柱優(yōu)化篩選出正己烷-乙酸乙酯-水溶劑體系，將其充分混合后，靜置分層，上相為固定相，下相為流動(dòng)相。分離柱體積：138mL；轉(zhuǎn)速：1600r/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm，分別對(duì)流速、進(jìn)樣量進(jìn)行進(jìn)一步調(diào)整，選擇最佳制備條件。

1.3.3 HPLC色譜分析條件

色譜柱：Diamonsil C18(200mm×4.6mm，5μm)，柱溫：30℃；流動(dòng)相A：二甲基甲酰胺-甲醇-乙酸體積比40:2:1.5，B：純水；梯度洗脫：0～10min，80%～70% B；10～20min，70%～60% B；20～25min，保持60% B；25～30min，60%～80% B；流速：1.0mL/min；進(jìn)樣量：10μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：278nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 兒茶素粗提物的HPLC分析

圖2 兒茶素粗提物的HPLC色譜圖Fig. 2 HPLC chromatogram of crude catchine extract

由圖2可知，HPLC外標(biāo)法分析兒茶素粗提物，測(cè)得提取物中兒茶素和表兒茶素的含量分別為84.5%和7.55%。

2.2 分析型高效逆流色譜篩選溶劑體系

圖3 兒茶素粗提物在不同溶劑體系下的分析型逆流色譜圖Fig. 3 Analytical HPCCC chromatograms of crude catchine extract in different solvent systems

[14-17]的分離EGCG和GCG的溶劑體系，結(jié)合兒茶素和表兒茶素的極性，選擇以正己烷-乙酸乙酯-水為基礎(chǔ)的溶劑體系，并利用分析型逆流色譜分離柱，對(duì)正已烷、乙酸乙酯、水以1:6:6、1:10:10、1:20:20、0:1:1不同體積配比下的分離效果進(jìn)行了快速考察，結(jié)果如圖3所示。通過對(duì)每個(gè)峰級(jí)分的HPLC分析，EC和C的出峰順序與HPCCC相反。隨著體系中正己烷比例的降低，EC和C的分離度依次增大。在采用1:6:6配比的體系時(shí)，二者已基本達(dá)到基線分離。繼續(xù)降低直至正己烷比例為0時(shí)，二者分離度雖可進(jìn)一步提高，但分離時(shí)間也相應(yīng)延長(zhǎng)。因此，選擇正己烷-乙酸乙酯-水體積比1:20:20進(jìn)行制備分離。

2.3 制備逆流色譜分離條件優(yōu)化

首先采用選擇好的體積比1:20:20正己烷-乙酸乙酯-水溶劑體系，根據(jù)制備柱和分析柱的放大倍數(shù)(約6倍)，以進(jìn)樣量120mg、流速6.0mL/min進(jìn)行分離，考察EC和C的制備分離效果，如圖4所示。在上樣量和流速以與柱體積等倍數(shù)放大時(shí)，可以在不延長(zhǎng)分離時(shí)間的情況下，獲得同樣的放大分離效果，這正是高效逆流色譜的優(yōu)勢(shì)所在。為了使上樣量進(jìn)一步提高，因而又考察了5.0mL/min和4.0mL/min兩個(gè)稍低流速下的分離效果，由圖4可知，隨著流速的降低，EC和C的分離度由0.819增加到0.923。因此選擇在4.0mL/min流速條件下，進(jìn)一步考察上樣量對(duì)二者分離效果的影響，如圖5所示。在同一流速條件下，隨著上樣量由120、240mg提高到500mg，目標(biāo)物的出峰時(shí)間有所提前，二者的分離度有所降低。

2.4 在優(yōu)化條件下的制備分離

根據(jù)上述的條件優(yōu)化結(jié)果，考察了在2.0mL/min流速下，上樣量為500mg時(shí)的分離效果，如圖6所示。與圖5相比，在同樣上樣量的情況下，EC和C的分離度明顯改善。進(jìn)而考察了在上樣量為1g時(shí)的分離效果，經(jīng)過一次分離(約120min)，從77min開始，以10mL/管收集流分，共收集9管，依次編號(hào)1～9，2號(hào)管可得95%純度以上表兒茶素約35mg；4號(hào)和8號(hào)管所得90%～99%純度的兒茶素100mg。5、6、7號(hào)管所得99%以上純度的兒茶素325mg。圖7分別給出了EC (95%純度)和C (99%純度)的HPLC分析圖譜，可知EC和C的分離效果很好。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)采用高效逆流色譜實(shí)現(xiàn)了兒茶素和表兒茶素兩種同分異構(gòu)體的完全分離。通過采用選擇好的溶劑體系，在柱體積相差約6倍的制備柱和分析柱之間進(jìn)行放大實(shí)驗(yàn)，在上樣量和流速與柱體積等倍數(shù)放大時(shí)，可在不延長(zhǎng)分離時(shí)間的情況下，獲得同樣的放大分離效果，這正是高效逆流色譜的優(yōu)勢(shì)所在。通過在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)又進(jìn)行進(jìn)一步的條件優(yōu)化和潛力挖潛，在柱體積放大約6倍的情況下，獲得了上樣量放大50倍的理想制備分離效果。即在柱體積為138mL的制備柱上，對(duì)1g兒茶素粗提取進(jìn)行了分離，在120min內(nèi)一次制備即可得到純度在95%以上的表兒茶素和99%以上的兒茶素純品。若將流速進(jìn)一步降低，在上樣量或產(chǎn)品的純度上還可以進(jìn)一步提高，但是分離時(shí)間會(huì)相應(yīng)延長(zhǎng)。因此，在放大分離時(shí)，需要綜合考慮分離度、上樣量和分離時(shí)間之間的關(guān)系，以求得分離效率的最大化。

參考文獻(xiàn)：

[1] HARBOWY M E, BALENTINE D A. Tea chemistry[J]. Crit Rev Plant Sci, 1997, 16: 415-480.

[2] 楊賢強(qiáng), 王岳飛, 陳留記, 等. 茶多酚化學(xué)[M]. 上海: 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 2003: 109-386.

[3] 廖音娟, 胡長(zhǎng)平. 表沒食子兒茶素沒食子酸酯抗肝癌作用機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 中南藥學(xué), 2012, 10(2): 132-136.

[4] 梁麗琴, 金剛, 黨建章, 等. 兒茶素對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251增殖的抑制作用及機(jī)制初探[J]. 實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志, 2011, 27(9): 1526-1528.

[5] 宛曉春. 茶葉生物化學(xué)[M]. 3版. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2003: 9-15.

[6] 徐懿, 屠幼英, 鐘小玉. 茶兒茶素異構(gòu)化研究現(xiàn)狀[J]. 中草藥, 2008,39(7): 1106-1109.

[7] 王傳金, 魏運(yùn)洋, 朱廣軍, 等. 聚酰胺色譜法分離制備高純度表沒食子兒茶素沒食子酸酯[J]. 應(yīng)用化學(xué), 2007, 24(4): 443-447.

[8] 戚向陽(yáng), 謝筆鈞, 胡慰望. 高純度表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)的分離與制備[J]. 精細(xì)化工, 1994, 11(4): 40-46.

[9] 王霞, 高麗娟, 林炳昌. 表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)的分離與制備[J]. 食品科學(xué), 2005, 26(9): 242-246.

[10] 鐘世安, 周春山, 楊娟玉. 高效液相色譜法分離純化酯型兒茶素的研究[J]. 化學(xué)世界, 2003(5): 237-245.

[11] 劉曉輝, 江和源, 堯渝. 高純度兒茶素的制備技術(shù)[J]. 中國(guó)茶葉, 2009(8): 8-11.

[12] ITO Y, CONWAY W D. High speed countercurrent chromatography[M]. New York: John Wiley, 1996.

[13] 曹學(xué)麗. 高速逆流色譜分離技術(shù)及應(yīng)用[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社,2005.

[14] CAO Xueli, TIAN Yu, ZHANG Tianyou, et al. Separation and purification of three individual catechins from tea polyphenol mixture by CCC[J]. Journal of Liquid Chromatography Related Technologies, 2001, 24(11/12): 1723-1732.

[15] CAO Xueli, ITO Y. Preparation and purification of epigallocatechin by high-speed countercurrent chromatograph[J]. Journal of Liquid Chromatography Related Technologies, 2004, 27(1): 145-152.

[16] 陳理, 鄧麗潔, 陳平. 高速逆流色譜分離同分異構(gòu)體[J]. 色譜, 2006(6): 570-573.

[17] YANAGIDA A, SHOJI A, SHIBUSAWA Y, et al. Analytical separation of tea catechins and food-related polyphenols by high-speed countercurrent chromatography[J]. Journal of Chromatography A, 2006, 1112:195-201.

[18] 曹學(xué)麗, 王尉, 裴海閏. 逆流色譜技術(shù)及其在食品領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展[J]. 北京工商大學(xué): 自然科學(xué)版, 2010, 28(3): 6-11.

Preparative Separation of Catechin and Epi-Catechin by High Performance Counter-Current Chromatography

CHENG Chao，YIN Lu，CAO Xue-li*，XU Jing
(Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients, School of Food and Chemical Engineering,Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)

High performance counter-current chromatography (HPCCC) was used for the separation and preparation of two isomers, catechin and epicatechin from crude extract of green tea. The results indicated that catechin and epicatechin could be separated completely by HPCCC using a two-phase solvent system composed of hexane, ethyl acetate and water (1:20:20,V/V) to form an upper phase as the stationary phase and a lower phase as the mobile phase. By using a 138 mL separation column,approximately 35mg of epicatechin (＞ 95% purity) and 325mg of (＞ 99% purity) or 100mg of (90% － 99% purity) cetechin were obtained from 1 g of crude extract through one-step separation in 120 min.

epicatechin；catechin；isomers；high-performance counter-current chromatography (HPCCC) ；separation and purification

TS207.3

A

1002-6630(2012)15-0140-04

2012-04-11

成超(1987—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锓蛛x工程。E-mail：chengchao-56@163.com

*通信作者：曹學(xué)麗(1967—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)樯锓蛛x技術(shù)。E-mail：caoxl@th.btbu.edu.cn