液相色譜法與氨基酸分析法測定食品中甘氨酸的比較研究

劉小力

(國家食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)中心，北京 100094)

液相色譜法與氨基酸分析法測定食品中甘氨酸的比較研究

劉小力

(國家食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)中心，北京 100094)

建立對食品中游離甘氨酸經(jīng)提取、凈化等處理后，鄰苯二甲醛衍生，經(jīng)高效液相色譜測定分析，并將該方法與氨基酸分析儀測定甘氨酸的方法進(jìn)行比較研究。通過對市售的液體乳、含乳飲料(品)類和植物蛋白飲料(品)類中游離甘氨酸分別應(yīng)用兩種方法進(jìn)行測定，結(jié)果表明，氨基酸分析儀法測定甘氨酸具有測定結(jié)果穩(wěn)定準(zhǔn)確、檢出限低和操作簡單的特點(diǎn)，而液相色譜法(熒光檢測器)測定甘氨酸檢測時(shí)間快，檢出限也能滿足常規(guī)檢測的需要，因此，在實(shí)際應(yīng)用中，兩種方法均可采用，可作為互相驗(yàn)證的方法。

甘氨酸；液相色譜；氨基酸分析

近年來，我國相繼出現(xiàn)了奶粉中添加乳清粉、添加動(dòng)物水解蛋白、三聚氰胺的惡性食品安全事件。甘氨酸是氨基酸系列中結(jié)構(gòu)最為簡單，人體非必需的一種氨基酸，在國內(nèi)外應(yīng)用廣泛[1]。在我國的GB 2760—2011《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中，甘氨酸被列為合成香料的一種，標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定其使用范圍為調(diào)味料及豆奶，最大使用限量為1.0g/kg[2]。近年來，我國出現(xiàn)一些不法企業(yè)為了提高蛋白質(zhì)含量，用成本較低的甘氨酸來代替乳粉，甚至在生產(chǎn)過程中違規(guī)使用或摻雜工業(yè)級(jí)甘氨酸，制造劣質(zhì)或完全不含有乳成分的假“乳飲料”，其添加量甚至遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出GB 2760—2011中規(guī)定的1.0g/kg，給消費(fèi)者帶來潛在的安全隱患。在我國，根據(jù)GB 2760—2011規(guī)定，含乳飲料中未將甘氨酸作為可以使用的食品添加劑[2]。在美國，根據(jù)食品藥品管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)關(guān)于食品添加劑使用范圍及限量的有關(guān)規(guī)定[3]，甘氨酸作為特殊膳食和營養(yǎng)添加劑可在所有食品中添加，但添加后食品中最終的甘氨酸總量(以游離氨基酸計(jì))小于等于總蛋白質(zhì)質(zhì)量的3.5%[4]。在我國，由于產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)于蛋白質(zhì)含量的要求，一些不法企業(yè)為了使產(chǎn)品的蛋白質(zhì)達(dá)標(biāo)，早期的辦法是提高產(chǎn)品中牛奶(或奶粉)的含量，但這樣產(chǎn)品的成本也就會(huì)隨之增高。而使用甘氨酸正好達(dá)到降低成本又使蛋白質(zhì)含量達(dá)標(biāo)這一目的，奶粉的蛋白質(zhì)含量一般為25%，但甘氨酸的蛋白質(zhì)含量為100%，也就是說，在產(chǎn)品中僅添加1份甘氨酸，便可達(dá)到使用4份奶粉的效果[5]。這些不法企業(yè)，為牟取暴利，鉆標(biāo)準(zhǔn)不完善的空子，不顧消費(fèi)者的健康和利益，在生產(chǎn)過程中大量使用或摻雜工業(yè)級(jí)甘氨酸，制造劣質(zhì)或不含乳成分的“乳飲料”，這樣的“乳飲料”由于使用工業(yè)級(jí)的甘氨酸重金屬溶劑殘留等有害物質(zhì)，危害人體健康。

因此，建立快速、易于推廣的甘氨酸檢測方法，將為政府監(jiān)管提供有力的技術(shù)支撐。根據(jù)現(xiàn)有的研究基礎(chǔ)，甘氨酸測定方法有紙色譜法、離子交換色譜法、反相高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、薄層色譜法、氣相色譜法等[6]。本實(shí)驗(yàn)選擇鄰苯二甲醛(OPA)柱前衍生-液相色譜和氨基酸分析儀建立甘氨酸的定性、定量測定方法，并將兩種快速測定方法進(jìn)行比較分析，為避免違法濫用甘氨酸情況的出現(xiàn)提供技術(shù)上的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

液體乳、含乳飲料(品)類和植物蛋白飲料(品)類市購。

甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度＞99%)、鄰苯二甲醛(OPA)、巰基乙醇、乙腈、乙酸銨；氨基酸分析用試劑(檸檬酸三鈉、氫氧化鈉、氯化鈉、鹽酸、檸檬酸、乙酸鈉、冰醋酸、無水乙醇、乙二醇甲醚、茚三酮)均為優(yōu)級(jí)純；0.4mol/L硼酸鈉緩沖液；衍生試劑的配制：稱取0.1g OPA用10mL甲醇溶解，加0.1mL乙硫醇，用0.4mol/L硼酸鈉緩沖液定容至100mL。

1.2 儀器與設(shè)備

1100高效液相色譜儀(帶熒光檢測器) 美國安捷倫公司；L-8800氨基酸分析儀 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 提取和凈化

準(zhǔn)確量取液體乳、含乳飲料或植物蛋白飲料5.0mL于燒杯中，液體乳和乳飲料(品)類樣品中加1倍乙腈振搖，植物蛋白飲料樣品加2.5倍乙腈振搖，濾紙過濾(待樣品出現(xiàn)絮狀沉淀后過濾)，濾液經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后上機(jī)測定。

如樣品中游離甘氨酸的含量較高時(shí)，可將濾液用水適當(dāng)稀釋，使樣液的最終質(zhì)量濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍之內(nèi)。

1.3.2 液相色譜測定

1.3.2.1 測定方法

樣品中游離甘氨酸經(jīng)提取、凈化等處理后，用鄰苯二甲醛衍生，其衍生物經(jīng)高效液相色譜分離，于熒光檢測器檢測。

1.3.2.2 色譜條件

色譜柱：Agilent EclipseXDB-C18(4.6mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相：A為0.02mol/L乙酸銨溶液65%，B為25%乙腈，C為10%甲醇；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL；熒光檢測器：Ex＝330nm，Em＝460nm。

1.3.2.3 定性、定量方法

采用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時(shí)間對樣品峰進(jìn)行準(zhǔn)確定性，采用外標(biāo)法以峰面積計(jì)算定量，依次配制不同質(zhì)量濃度的甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣分析，以質(zhì)量濃度/(μg/mL)為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 氨基酸分析儀測定

食品中游離氨基酸，經(jīng)氨基酸分析儀的離子交換柱分離后，按照氨基酸分析儀設(shè)定的洗脫程序，用不同離子強(qiáng)度、pH值的緩沖液依次將氨基酸按吸附力的不同洗脫下來(先酸性氨基酸再中性氨基酸最后堿性氨基酸)，被洗脫下來的氨基酸與茚三酮反應(yīng)液在加熱的條件下反應(yīng)(135℃)，生成可在分光光度計(jì)中570nm和440nm檢測到的藍(lán)紫色物質(zhì)(仲氨生成淺黃色物質(zhì)440nm檢測)外標(biāo)法定量[7]。甘氨酸為中性氨基酸，在10min左右出峰。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法的設(shè)定

比較采用1)透析袋去除大分子蛋白質(zhì)[8]；2)采用95%乙醇除蛋白的方法[9]；3)采用蛋白沉降劑20%醋酸鋅和15%亞鐵氰化鉀沉降蛋白[10]；4)乙腈除蛋白方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乙腈除蛋白效果較好，方法簡單且回收率較高，對甘氨酸測定無干擾。因此，針對液體乳、乳飲料、植物蛋白飲料等食品，本實(shí)驗(yàn)采用乙腈除蛋白的凈化方法。

2.2 OPA柱前衍生-液相色譜檢測方法

2.2.1 衍生劑選擇與衍生方法的設(shè)定

OPA衍生劑在2-巰基乙醇存在下與第一級(jí)氨基酸迅速反應(yīng)聲稱1-硫代-2-烷基異吲哚，加成物經(jīng)熒光檢測器測定[11]。苯異硫氰酸酯衍生劑與一、二級(jí)氨基酸反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物在原來氨基酸結(jié)構(gòu)上引入苯環(huán)，使得能夠用熒光檢測器檢測[12]。但是PITC衍生時(shí)需要真空干燥以出去過量試劑，因此很難全部自動(dòng)化。相比OPA衍生劑本身不干擾分離與檢測，不必除去過量試劑，色譜圖基線比較平穩(wěn)[13]。基于以上考慮，本方法中甘氨酸的測定采取OPA柱前衍生法。

樣品自動(dòng)柱前衍生程序?yàn)槌槿悠?.0μL、沖洗進(jìn)樣針端口5.0s、抽取衍生液5.0μL、沖洗進(jìn)樣針端口5.0s、混合30次(混合時(shí)間為2min左右)進(jìn)樣(進(jìn)樣量為10μL)。

樣品手動(dòng)柱前衍生程序：用移液器準(zhǔn)確移取樣品濾液0.5mL于2mL的棕色自動(dòng)進(jìn)樣瓶中，再準(zhǔn)確加入0.5mL OPA衍生試劑，反應(yīng)1min后，立即進(jìn)樣。

2.2.2 色譜條件的優(yōu)化

流動(dòng)相中乙酸銨溶液和甲醇的配制比例對甘氨酸的出峰時(shí)間和分離效果均有直接影響，這一比例的最終確定根據(jù)樣品分離過程中甘氨酸與其他氨基酸峰完全分離為主要因素，其次選擇適合的分離時(shí)間。根據(jù)表1選擇乙酸銨、乙腈和甲醇的不同比例進(jìn)行測定，最終選擇流動(dòng)相：A為0.02mol/L乙酸銨溶液65%，B為25%乙腈，C為10%甲醇，測定出峰時(shí)間在7min左右。

表1 流動(dòng)相選擇Table 1 Selection of optimal mobile phase composition

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

1g/L甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液：將儲(chǔ)備液稀釋配成質(zhì)量濃度為0、1、5、10、15、20mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，分別進(jìn)行高效液相色譜分析。

2.2.4 方法檢測限

在基質(zhì)中加標(biāo)，逐級(jí)稀釋以3倍的信噪比確定檢出限為1μg/g。

2.2.5 方法的回收率和精密度

準(zhǔn)確稱取同一種空白樣品6份，每份5.00mL，共2組，分別定量加入甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加量分別為100mg/L和200mg/L，按上述本方法樣品處理、色譜條件及定性定量方法操作計(jì)算，回收率及精密度見表2。從表2可看出，不同樣品平均加標(biāo)回收率94.6%～101.4%，平均相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.94%～1.79%(n＝6)。

表2 樣品加標(biāo)回收率與精密度實(shí)驗(yàn)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 2 Recovery rates and RSDs for glycine determination in spiked samples (n=6)

2.3 氨基酸分析儀測定方法

氨基酸分析儀是通過離子交換色譜法分離具有共性而又有差別的各種氨基酸混合物分離進(jìn)行定量。甘氨酸與大多數(shù)蛋白質(zhì)氨基酸一樣，具有與水合茚三酮產(chǎn)生顯色反應(yīng)，生成藍(lán)紫色化合物，在570nm處有最大吸收[14]。

依據(jù)GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測定》方法[15]。采用準(zhǔn)確吸取0.200mL混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)，用pH2.2的緩沖液稀釋到5mL，此標(biāo)準(zhǔn)稀釋液濃度為5.00nmol/50μL，作為上機(jī)測定用的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)，用氨基酸自動(dòng)分析儀以外標(biāo)法測定試樣測定液的甘氨酸含量。方法檢測限為10pmol。

2.4 實(shí)際樣品測定

2.4.1 液相色譜法測定甘氨酸

圖1 標(biāo)準(zhǔn)樣品的液相色譜圖Fig.1 Liquid chromatogram of standard sample

圖1顯示，甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣品經(jīng)OPA衍生后測定，出峰時(shí)間再7.573min，圖2液體乳樣品的測定顯示，甘氨酸衍生物出峰時(shí)間在7.581min，出峰前后無其他氨基酸衍生物干擾，此方法可用作甘氨酸定性及定量的測定方法。

圖2 液體乳樣品中甘氨酸的液相色譜圖Fig.2 Liquid chromatogram of milk sample

2.4.2 氨基酸分析儀法測定甘氨酸

圖3 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)混合液測定圖Fig.3 Results obtained for determination of mixed amino acid standard samples by amino acid analyzer

由圖3可見，測定的是氨基酸標(biāo)準(zhǔn)混合液，甘氨酸出峰時(shí)間在10.37min，圖4中，第5個(gè)峰為液體乳樣品中甘氨酸峰，出峰時(shí)間在10.41min，甘氨酸后面峰為丙氨酸，分離較好，出峰無干擾。

圖4 液體乳樣品中氨基酸測定圖Fig.4 Results obtained for determination of amino acids in liquid milk sample by amino acid analyzer

3 結(jié) 論

OPA柱前衍生-HPLC法測定液體乳、含乳飲料等產(chǎn)品中游離甘氨酸的含量，具有方法簡單反應(yīng)快、靈敏，過量試劑不干擾檢測，不必除去，紫外、熒光均可檢測。缺點(diǎn)是反應(yīng)產(chǎn)物不穩(wěn)定，需要在線分析，但是目前行業(yè)中應(yīng)用的液相色譜分析儀，基本都具有在線自動(dòng)衍生功能，鑒于液相色譜儀的普及面廣，因此，此方法更易于推廣和應(yīng)用。

利用氨基酸分析儀分析法能準(zhǔn)確地測定液體乳、含乳飲料等產(chǎn)品中游離甘氨酸的含量，該方法樣品處理簡便易操作，可以對甘氨酸直接進(jìn)行分析，避免了衍生產(chǎn)物的多樣性，而且無需判斷降解物的來源，也不涉及樣品中氨基酸衍生不徹底等問題，能快速、準(zhǔn)確地判斷含乳飲料中是否添加了游離甘氨酸。

因此，在液體乳、含乳飲料等產(chǎn)品的甘氨酸測定應(yīng)用中，兩種方法均可采用，并且可作為互相驗(yàn)證的方法。

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Comparative Study of Determination Methods for Glycine in Foods

LIU Xiao-li
(National Food Quality & Safety Supervision and Inspection Center, Beijing 100094, China)

Glycine, as a non-essential amino acid in the human body, has the simplest structure among amino acid series. Glycine is widely used as a food additive with the maximum level of 1.0 g/kg in the food industry. Recent years, industrial grade glycine is illegally used in food products to substitute milk or improve protein content. In this paper, an HPLC method was established for the determination of glycine and compared with the amino acid analyzer method. Meanwhile, glycine contents in commercial milk, milk drink and plant protein products were determined by the HPLC method and the amino acid analyzer method. The results indicated that the amino acid analyzer method had advantages of stable and accurate results, low detection limit and simple operation procedures, while the HPLC method had the advantages of time saving and enough low detection limit compared with the routine fluorescence detection. Therefore, both methods can be applied for practical determination of glycine in food products as mutual authentication methods.

glycine；HPLC；amino acid analysis

TS252.7

A

1002-6630(2012)18-0254-04

2011-06-28

劉小力(1980—)，女，高級(jí)工程師，碩士，研究方向?yàn)槭称钒踩-mail：frida.liu@cfqs.org