薏米中酚類提取物測定及抗氧化能力指數(shù)分析

王立峰，何 榮，袁 建，鞠興榮

(1.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122；2.南京財經(jīng)大學食品科學與工程學院，江蘇 南京 210046)

薏米中酚類提取物測定及抗氧化能力指數(shù)分析

王立峰1,2，何 榮1，袁 建2，鞠興榮2

(1.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122；2.南京財經(jīng)大學食品科學與工程學院，江蘇 南京 210046)

選取3種薏米樣品，經(jīng)提取獲得游離型和結合型多酚類化合物，采用改進的Folin-Ciocalteu比色法及硼氫化鈉/氯醌(SBC)比色法，用酶標儀測定其多酚和黃酮含量；采用抗氧化能力指數(shù)(ORAC)方法，于熒光酶標儀中測定提取物中的總抗氧化活性。研究表明，游離型多酚含量中龍薏1號薏米顯著性高于貴州黑谷薏米和遼寧5號薏米，結合型多酚含量中龍薏1號薏米顯著性高于貴州黑米薏米和遼寧5號薏米，所有樣品中其平均結合型多酚含量占總多酚含量的45.28%；游離型黃酮含量中遼寧5號薏米顯著高于貴州黑谷薏米和遼寧5號薏米，結合型黃酮含量中龍薏1號薏米高于遼寧5號薏米和貴州黑谷薏米，總黃酮含量最高的是遼寧5號薏米?？偪寡趸芰χ笖?shù)(ORAC)最高的是龍薏1號薏米，其值是(668.0 ± 32.7)mg Trolox /100g樣品(以干質量計)，其次是貴州黑谷薏米和遼寧5號薏米，所有樣品中平均結合型ORAC值占總ORAC值的48.08%；3個品種的薏米其總多酚含量與總抗氧化能力指數(shù)之間相關系數(shù)為0.933，有顯著相關性(P＜0.05)。

薏米；多酚；黃酮；抗氧化能力指數(shù)

全谷物可以減少患一些慢性病的風險，例如心血管疾病[1]，Ⅱ型糖尿病[2]，肥胖癥[3]和一些癌癥[4]。氧化應激是許多慢性退行性疾病發(fā)生發(fā)展的主要機制[5]。近年來，由于天然植物化學物抗氧化能力及潛在的健康作用，探尋和研究具有抗氧化活性的天然植物化學物質用于防治氧化應激誘導的多種疾病，成為醫(yī)藥、植物化學等多個學術領域共同關注的課題。然而，由于很多研究低估了全谷物中的植物化學物質，其研究遠沒有果蔬中植物化學物得到足夠的重視[6-8]。薏米(Coix lachrymajobiL.)，又稱薏仁，是傳統(tǒng)的藥食兼用谷物資源，在中國、日本和越南廣泛種植，被譽為“世界禾本科植物之王”[9]。雖然薏米具有很好的生物活性和營養(yǎng)性，但其植物化學物的研究未見報道。因此深入了解薏米植物化學物的含量及體外抗氧化能力，對進一步研究薏米體內(nèi)生物活性，挖掘提高薏米的營養(yǎng)價值，發(fā)揮其保健作用具有重要意義。目前對薏米的研究報道不多，多集中于薏米的多重生理功能[10-12]。Chang Huichiu等[13]研究證明薏米可抑制老鼠中肉瘤-180腫瘤，具有抗癌效果。Kuo等[14]指出薏米殼的甲醇提取物對U937白血病細胞具有抗增殖效果。Chang Huichiu等[13]報道了薏米的甲醇提取物對A549肺癌細胞具有抗增殖效果。有研究報道薏米麩皮中總多酚含量在，但未區(qū)分游離型和結合型多酚含量比例[10,15]。目前對于薏米植物化學物及其體外抗氧化能力的研究國內(nèi)外尚未見報道。因此，為較清楚地了解薏米中多酚含量及其生理活性，挖掘提高薏米的營養(yǎng)價值，有必要對其進行多酚及抗氧化活性的分析。本實驗對薏米中游離型和結合型植物化學物質進行分析，同時測定分析各品種薏米抗氧化能力指數(shù)(oxygen radical absorbance capacity，ORAC)，旨在了解薏米中多酚及抗氧化能力，尤其是結合型多酚及其抗氧化能力，挖掘薏米的營養(yǎng)價值，并可為后續(xù)研究薏米抗癌作用提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

薏米樣品包括貴州黑谷薏米、遼寧5號薏米、龍薏1號薏米，均由南京財經(jīng)大學江蘇省糧油品控及深加工技術重點實驗室提供。樣品脫殼后經(jīng)旋風磨粉碎過篩，石油醚索式抽提去脂，－20℃避光保存?zhèn)溆谩Ｋ袠悠凡捎肁OAC方法于105℃干燥16h后稱得其質量，結果以干質量表示。

1.2 試劑與儀器

甲醇、乙醇、丙酮、正己烷、乙酸乙酯、鹽酸、氫氧化鉀、磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀 美國Mallinckrodt化學試劑公司；2,2＇-Azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (ABAP) 美國Wako化學試劑公司；沒食子酸 美國ICN生化試劑公司；抗壞血酸、2＇,7＇-Dichlorofluorescin diaacetate (DCFH-DA) 美國Sigma公司；96孔黑色和白色底部透明微孔板 美國Corning公司。

錘式旋風磨 上海嘉定糧油儀器有限公司；試驗礱谷機 日本佐竹公司；酶標儀 加拿大Dynex公司；多功能熒光分析儀 美國Thermo Electron 公司。1.3 游離型多酚類化合物的提取

薏米樣品中游離型多酚類化合物的提取采用改進的本實驗室前期報道的方法[16-18]。稱取4g樣品，加入80%預冷的丙酮30mL進行攪拌。充分混合后2500 ×g離心10min，收集上清提取液。濾渣用80%預冷的丙酮再次提取，重復3次。收集全部上清提取液后在45℃旋轉蒸發(fā)至干。用70%甲醇定容至10mL。提取液儲存于－40℃?zhèn)溆?。所有提取重復操?次。

1.4 結合型多酚類化合物的提取

薏米樣品中結合型多酚類化合物的提取采用改進的本實驗室前期報道的方法[16,18-19]。簡單的說，結合型多酚類化合物的提取是在前述游離型多酚類化合物提取后剩余殘渣的基礎上進行深度提取。首先將殘渣氮吹2min，然后室溫下向殘渣中加入2mol/L NaOH 20mL，振蕩1h進行消化處理?；旌衔镉脻恹}酸中和，并調整pH2。然后加入乙酸乙酯，靜置10min后2500×g離心10min，收集乙酸乙酯部分，重復此操作5次。將收集到的溶液在45℃旋轉蒸發(fā)至干，用70%甲醇定容至10mL。提取液儲存于－40℃?zhèn)溆?。所有提取重復操?次。

1.5 多酚含量的測定

每個品種的薏米多酚含量的測定采用Singleton 等[20]和本實驗室改進的Folin-Ciocalteu比色法[17,21]。所有提取液(游離型、結合型多酚類化合物提取液)按照1:20稀釋，使得其可讀取范圍在標準曲線0.0～600.0μg 沒食子酸/mL范圍之內(nèi)。提取液用Folin-Ciocalteu試劑反應，然后加入碳酸鈉終止反應。室溫下避光放置90min后，于波長760nm處用酶標儀測定吸光度。沒食子酸作為標準曲線，多酚含量以每100g干質量等同于沒食子酸的毫克數(shù)表示?？偠喾雍繛榉謩e測定的結合型多酚與游離型多酚含量之和。

1.6 黃酮含量的測定

每個品種的薏米黃酮含量測定采用本實驗室建立的硼氫化鈉/氯醌(SBC)比色法[22]。分別取1mL的樣品(游離型、結合型多酚類化合物提取液)提取物(氮氣吹干)和兒茶素標準品，現(xiàn)配使用(0.1～10.0mmol/L)，加入0.2mL的四氫呋喃-乙醇混合物(1:1，V/V)，然后加入0.1mL、50mmol/L的硼氫化鈉和0.1mL、74.6mmol/L的三氯化鋁。然后室溫振蕩30min，在提取物和標準品中分別再次加入0.1mL、5050mmol/L硼氫化鈉，室溫振蕩30min。加入0.4mL預冷的0.8mol/L的冰醋酸，避光振蕩15min。然后加入0.2mL、20mmol/L的氯醌，在95℃油浴振蕩加熱60min，冷卻后甲醇定容至1mL，然后加入0.2mL、1052mmol/L的香草醛，混合后加入0.4mL、12mol/L的鹽酸，避光振蕩反應15min，于96孔板上每孔加入200μL，在波長490nm處用酶標儀測定吸光度。黃酮含量以每100g干質量等同于兒茶素的毫克數(shù)表示。總黃酮含量為分別測定的結合型黃酮與游離型黃酮之和。

1.7 總抗氧化能力指數(shù)(ORAC)的測定

每個品種薏米總抗氧化能力的測定采用抗氧化能力指數(shù)(ORAC)以及本實驗室修正的方法[23-25]。薏米樣品首先用75mmol/L的磷酸緩沖液進行稀釋(pH7.4)，測定使用熒光96孔板進行，每個孔含有20μL樣品提取物(游離型、結合型多酚類化合物提取液)或者20μL Trolox 標準品(6.25～50 μmol/L)，以及200μL的Fluorescein(熒光指示劑，0.96μmol/L)，每個孔在熒光酶標儀中于37℃溫育20min，然后每個孔再加入20μL，119mmol/L的偶氮類化合物ABAP，利用熒光酶標儀在波長485nm處激發(fā)，每5min在波長520nm處釋放測定。ORAC值以每100g干質量等同于Trolox的毫克數(shù)表示。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2 結果與分析

2.1 總多酚含量

薏米品種的游離型多酚、結合型多酚和總多酚含量見表1。游離型多酚含量最高的是龍薏1號(P＜0.05)，其含量為(45.19 ± 0.91)mg 沒食子酸/100g樣品；結合型多酚含量最高的是龍薏1號(P＜0.05)，其含量為(30.86 ± 1.18)mg沒食子酸/100g樣品；總多酚含量最高的是龍薏1號(P＜0.05)，其含量為(76.04 ± 1.99)mg沒食子酸/100g樣品。3個品種薏米樣品間總多酚含量有顯著性差異(P＜0.05)。

表1 不同品種薏米多酚含量( －±s，n = 5)Table 1 Contents of total phenols in 3 adlay varieties( －±s，n = 5)

表1 不同品種薏米多酚含量( －±s，n = 5)Table 1 Contents of total phenols in 3 adlay varieties( －±s，n = 5)

注：肩標字母完全不同時，表示差異達顯著性水平(P＜0.05)。

品種 多酚含量/(mg 沒食子酸/100g樣品)游離型 結合型 總多酚貴州黑谷 31.23 ± 2.03ef 28.07 ± 0.44g 59.30 ± 2.06c遼寧5號 32.87 ± 0.71e 28.50 ± 0.90g 61.38 ± 0.90b龍薏1號 45.19 ± 0.91d 30.86 ± 1.18f 76.04 ± 1.99a

2.2 總黃酮含量

3個品種薏米樣品的游離型黃酮、結合型黃酮和總黃酮含量見圖1。游離型黃酮含量最高的是遼寧5號，其含量是(18.24±0.55)mg兒茶素/100g樣品，其次是龍薏1號薏米，其含量是(11.57±1.21)mg兒茶素/100g樣品和貴州黑谷薏米，其含量是(6.21±0.55)mg 兒茶素/100g樣品；結合型黃酮含量最高的是龍薏1號薏米，其含量是(35.27±3.66)mg 兒茶素/100g樣品，其次是遼寧5號薏米，其含量是(34.63±1.89)mg兒茶素/100g樣品和貴州黑谷薏米，其含量是(18.68±1.77)mg兒茶素/100g樣品；總黃酮含量最高的是遼寧5號薏米，其含量是(52.86± 1.85)mg 兒茶素/100g樣品，其次是龍薏1號薏米，其含量是(46.85±4.48 )mg兒茶素/100g樣品和貴州黑谷薏米，其含量是(24.88±2.06)mg 兒茶素/100g樣品。3個品種薏米樣品間總黃酮含量有顯著性差異(P＜0.05)，游離型黃酮含量中遼寧5號薏米顯著高于貴州黑谷薏米和龍薏1號薏米(P＜0.05)，此外，龍薏1號游離型黃酮含量顯著高于貴州黑谷薏米(P＜0.05)。在貴州黑谷薏米和龍薏1號薏米結合型黃酮含量之間沒有顯著性差異，但它們的結合型黃酮含量顯著高于貴州黑谷薏米(P＜0.05)。

圖1 不同品種薏米黃酮含量(n = 5)Fig.1 Contents of total flavonoids in 3 adlay varieties (n = 5)

2.3 總多酚中黃酮的貢獻率

圖2 不同品種薏米多酚中黃酮的貢獻率 (n = 5)Fig.2 Ratios between total flavonoids and total phenols in 3 adlay varieties (n = 5)

薏米樣品中總黃酮對總多酚含量的貢獻率見圖2。游離型黃酮含量占游離型多酚含量比例最大的是遼寧5號薏米，其比例為32.5%，其次為龍薏1號薏米，其比例為15.0%，貴州黑谷薏米，其比例為11.6%；結合型黃酮含量占結合型多酚含量比例最大的是遼寧5號薏米，其比例為71.2%，其次為龍薏1號薏米，其比例為66.8%，貴州黑谷薏米中其比例為39.0%。總黃酮含量占總多酚含量比例最大的是遼寧5號薏米，其比例為50.5%，其次是龍薏1號薏米，其比例為36.0%，貴州黑谷薏米，其比例為24.6%。

2.4 總抗氧化能力指數(shù)(ORAC)分析

圖3 不同品種薏米總抗氧化能力指數(shù) (n = 5)Fig.3 ORAC values of 3 adlay varieties (n = 5)

3個品種薏米樣品的游離型、結合型和總抗氧化能力指數(shù)(ORAC)見圖3。龍薏1號薏米和遼寧5號薏米游離型ORAC值(分別為(316.6±6.4)mg Trolox/100g 樣品和(291.1±31.5)mg Trolox/100g樣品)高于貴州黑谷薏米((231.9±13.3)mg Trolox/100g樣品)；結合型ORAC值最高的是龍薏1號薏米(P＜0.05)，其值為(351.4±36.3)mg Trolox/100g樣品，其次是遼寧5號薏米，其值為(217.3± 18.6)mg Trolox /100g樣品和貴州黑谷薏米，其值為(209.0± 10.1)mg Trolox /100g樣品；總ORAC值最高的是龍薏1號薏米(P＜0.05)，其值為(668.0±32.7)mg Trolox /100g樣品，其次是遼寧5號薏米，其值為(508.4±19.3)mg Trolox /100g樣品，3個測試品種中貴州黑谷薏米ORAC值最低，為(440.9 ± 22.2)mg Trolox /100g樣品。薏米品種的總ORAC值數(shù)據(jù)與它們的總多酚含量保持一致性。在3個品種的薏米中，其總ORAC值有顯著性差異(P＜0.05)。龍薏1號和遼寧5號薏米的游離型ORAC值顯著高于貴州黑谷薏米的游離型ORAC值(P＜0.05)，龍薏1號薏米的結合型ORAC值顯著高于遼寧5號和貴州黑谷薏米(P＜0.05)。

2.5 相關性分析和均值比較

圖4 總多酚、總黃酮和ORAC值的相關性Fig.4 Correlations between total phenol and total flavonoid contents, between total phenol content and ORAC value, and between total flavonoid content and ORAC value

總多酚含量、總黃酮含量和總ORAC值的相關性見圖4。在測試品種薏米樣品中，其總多酚含量與總ORAC值顯著相關(R2＝0.933)。總黃酮含量與總ORAC值的相關系數(shù)是R2＝0.935，總多酚含量與總黃酮含量相關系數(shù)為R2＝0.425，它們之間不存在顯著性相關。不同薏米品種中游離型和結合型的植物化學物質含量及抗氧化能力指數(shù)見表2。測試薏米品種中游離型多酚含量顯著高于結合型多酚含量(P＜0.05)，結合型黃酮含量顯著高于游離型黃酮含量(P＜0.05)，游離型和結合型ORAC值無顯著性差異。

表2 游離型、結合型的多酚和黃酮含量與ORAC值的均值比較Table 2 Average values of free, bound and total phenol, flavonoid and ORAC of 3 adlay varieties

3 結 論

全谷物食品及其產(chǎn)品的消費與降低一些慢性病(心血管疾病、糖尿病、某些癌癥等)的風險具有較大的聯(lián)系。這些益處部分的由于全谷物中含有的一些唯一的植物化學物質所引起。薏米及其產(chǎn)品主要在亞洲地區(qū)食用，本實驗主要報道了3個不同品種薏米的植物化學物質相關研究和抗氧化能力指數(shù)的評價。通過研究表明，薏米中含有較為豐富的植物化學物質和具有較強的抗氧化能力。樣品中結合型多酚貢獻了總多酚含量的45%，結合型黃酮貢獻了總黃酮含量的71%。薏米中的結合型植物化學物質對于結腸細菌發(fā)酵后導致的結腸具有特殊的健康益處，可為后續(xù)研究薏米抗癌作用提供一定的依據(jù)。

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Analysis of Phenols, Flavonoids and Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC) of Three Varieties of Adlay

WANG Li-feng1,2，HE Rong1，YUAN Jian2，JU Xing-rong2
(1. School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China；
2. School of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210046, China)

s ：In order to explore the phytochemical profile of three adlay varieties, the levels of total, free and bound phenols and flavonoids were determined using a microplate reader. Meanwhile, the oxygen radical absorbance capacity (ORAC) was measured as an indicator for total antioxidant capacity using a multifunctional fluorescence microplate reader. The contents of free ((45.19 ± 0.91) mg of gallic acid equivalent/100 g of dried samples) and bound ((30.86 ± 1.18) mg of gallic acid equivalent/100 g samples) phenols in Longyi I were significantly higher than those in Liaoning V and Guizhou Heigu (P＜ 0.05). For all these adlay varieties, bound phenols averagely accounted for 45.28% of total phenols. The content of free flavonoids in Liaoning V showed a significant increase as compared with Longyi I and Guizhou Heigu, and the content of bound flavonoids in Longyi I was higher than that of Liaoning V and Guizhou Heigu. The highest content of total flavonoids was found in Liaoning V. The adlay varieties were ranked in decreasing order of ORAC as follows: Longyi I ((668.0 ± 32.7) mg of Trolox equivalent/100 g of dried samples), Liaoning V and Guizhou Heigu. The average percentage of bound ORAC in total ORAC was 48.08%. A correlation coefficient (R2) of 0.933 was observed for the significant correlation (P＜ 0.05) between the total phenol content and total antioxidant capacity of each adlay variety.

adlay；phenols；flavonoids；oxygen radical absorbance capacity(ORAC)

TS201.1

A

1002-6630(2012)01-0072-05

2011-11-24

江蘇省“青藍工程”青年骨干教師項目；江蘇省政府留學獎學金項目

王立峰(1977—)，男，副教授，碩士，研究方向為食品安全與營養(yǎng)。E-mail：wanglifeng_8@163.com