山西老陳醋多酚提取物抗氧化活性研究

陳樹(shù)俊，馮 斌，劉 誠(chéng)，蘇 靜，張海英，劉亞斌，吳夏花

(1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006；2.北京市食品研究所，北京 100162；3.山西省食品工業(yè)研究所，山西 太原 030024)

山西老陳醋多酚提取物抗氧化活性研究

陳樹(shù)俊1，馮 斌1，劉 誠(chéng)2，蘇 靜1，張海英3，劉亞斌1，吳夏花1

(1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006；2.北京市食品研究所，北京 100162；3.山西省食品工業(yè)研究所，山西 太原 030024)

采用不同體系研究山西老陳醋多酚提取物的體外抗氧化活性，并與沒(méi)食子酸和抗壞血酸做比較。結(jié)果顯示：老陳醋多酚提取物具有抗氧化功能，并且存在一定的效量關(guān)系，但在不同的體外抗氧化體系中活性有所差異。還原能力以及對(duì)羥自由基(·OH)的清除能力強(qiáng)弱順序均為老陳醋多酚提取物＞沒(méi)食子酸＞抗壞血酸；清除超氧陰離子自由基(O2－·)能力順序?yàn)槔详惔锥喾犹崛∥铮究箟难幔緵](méi)食子酸；清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH自由基)能力順序?yàn)闆](méi)食子酸＞老陳醋多酚提取物＞抗壞血酸；老陳醋多酚提取物清除亞硝酸鹽的能力低于抗壞血酸；總抗氧化能力(同質(zhì)量濃度比較時(shí))的順序?yàn)闆](méi)食子酸＞抗壞血酸＞老陳醋多酚提取物。

山西老陳醋；多酚；提取物；抗氧化性

山西老陳醋是全國(guó)馳名的食醋品牌，是具有悠久歷史和獨(dú)特地方特色的傳統(tǒng)精品。幾百年來(lái)憑“選料上乘、工藝獨(dú)特、品質(zhì)優(yōu)良、營(yíng)養(yǎng)豐富、色香味俱佳”而位列中國(guó)四大名醋之首，素有“天下第一醋”的盛譽(yù)[1]。山西老陳醋中含有許多對(duì)人體有益的活性物質(zhì)，多酚是其中重要的一類(lèi)。酚類(lèi)物質(zhì)由于能提供活潑的氫質(zhì)子故而能有效地清除自由基；同時(shí)還能夠與過(guò)氧化自由基結(jié)合成穩(wěn)定的化合物；另外它還可以通過(guò)抑制氧化酶和絡(luò)合金屬離子等起到抗氧化作用[2]。由于體外測(cè)定抗氧化活性的方法眾多，且在不同的測(cè)定體系中同一抗氧化劑會(huì)表現(xiàn)出不同的活性，所以對(duì)于一種抗氧化劑的活性進(jìn)行綜合性的評(píng)價(jià)就需要使用多種評(píng)價(jià)方法[3]。

目前老陳醋多酚類(lèi)物質(zhì)的生理功能研究報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)利用多種不同的體外評(píng)價(jià)體系對(duì)山西老陳醋多酚提取物的抗氧化活性進(jìn)行研究，以期為山西老陳醋的抗氧化保健功能研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山西老陳醋 山西老陳醋集團(tuán)有限公司。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 美國(guó)Sigma公司；總抗氧化能力(T-AOC)檢測(cè)試劑盒、羥自由基(·OH)試劑盒、抑制與產(chǎn)生超氧陰離子自由基(O2－·)試劑盒 南京建成生物工程有限公司；沒(méi)食子酸、抗壞血酸、鐵氰化鉀、三氯乙酸(TCA)、亞硝酸鈉、對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺等試劑均為分析純。Folin-Ciocalteu試劑為實(shí)驗(yàn)室自制[4-5]。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2800型紫外分光光度計(jì) 美國(guó)尤尼柯儀器有限公司；JA1203N型精密電子天平 上海良平儀器儀表有限公司；HRHS24 Haier電熱恒溫水浴鍋 青島海爾醫(yī)用低溫科技有限公司；TDL-5型臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；DHG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 老陳醋多酚提取物的制備

老陳醋在真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(40℃)中真空濃縮至黏稠。用乙醇作為溶劑，超聲波輔助提取老陳醋多酚類(lèi)物質(zhì)。提取條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，提取時(shí)間為15min，溫度為40℃，料液比1:2，提取一次[6]。

1.3.2 總酚含量的測(cè)定

按照參考文獻(xiàn)[7]的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 還原能力的測(cè)定

把樣品配制成一定的質(zhì)量濃度，均加1mL于10mL具塞刻度試管中。加入2.5mL PBS緩沖液(0.2mol/L，pH6.6)，1%鐵氰化鉀溶液2.5mL，混勻，50℃水浴條件下反應(yīng)20min。迅速冷卻，立即加入10% TCA溶液2.5mL終止反應(yīng)，3000r/min離心10min，取上清液2.5mL，加2.5mL蒸餾水，0.1% FeCl3溶液0.5mL混勻，反應(yīng)10min后于波長(zhǎng)700nm處測(cè)定吸光度[8]。以抗壞血酸、沒(méi)食子酸作為對(duì)照品。

1.3.4 對(duì)亞硝酸鹽清除能力的測(cè)定

參照參考文獻(xiàn)[9]的方法。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。按式(2)計(jì)算待測(cè)物對(duì)NO2－的清除率。

式中：A0為不加待測(cè)液時(shí)反應(yīng)體系的吸光度；A為加入待測(cè)液時(shí)反應(yīng)體系的吸光度。

測(cè)定波長(zhǎng)為540nm；根據(jù)清除率作曲線求出半數(shù)清除率質(zhì)量濃度(IC50)。

1.3.5 DPPH自由基清除活性的測(cè)定

參照參考文獻(xiàn)[10]的方法。準(zhǔn)確的將老陳醋多酚提取物配成一系列質(zhì)量濃度溶液，以沒(méi)食子酸、抗壞血酸為對(duì)照。按式(3)計(jì)算清除率。

式中：Ai為2mL DPPH溶液＋2mL 待測(cè)定樣品液的吸光度；Aj為2mL 無(wú)水乙醇＋2mL 待測(cè)定樣品液的吸光度；Ac為2mL DPPH溶液＋2mL 無(wú)水乙醇的吸光度。

測(cè)定波長(zhǎng)為517nm，根據(jù)清除率作曲線求出 IC50。

1.3.6 清除·OH活性測(cè)定

準(zhǔn)確的將老陳醋多酚提取物配成一系列質(zhì)量濃度，具體操作按照·OH測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以沒(méi)食子酸、抗壞血酸為對(duì)照品。

1.3.7 清除O2－·活性測(cè)定

準(zhǔn)確的將老陳醋多酚提取物配成一系列質(zhì)量濃度，具體按照抗O2－·試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，并以沒(méi)食子酸和抗壞血酸為對(duì)照品。

1.3.8 總抗氧化能力檢測(cè)

準(zhǔn)確的將老陳醋多酚提取物配成一系列質(zhì)量濃度，具體按照總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。計(jì)算方法：在37℃溫度條件下，以每分鐘每毫升樣品液使反應(yīng)體系OD值每增加0.01時(shí)為一個(gè)抗氧化能力單位，按式(4)計(jì)算總抗氧化能力(T-AOC)。

T-AOC/(單位/mL)＝(OD測(cè)定管－OD對(duì)照管)×反應(yīng)液用量/mL×樣品測(cè)定前稀釋倍數(shù)÷0.01÷30÷取樣體積/mL (4)

1.3.9 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 老陳醋中多酚物質(zhì)的提取結(jié)果

按照本實(shí)驗(yàn)室建立的最佳提取工藝，對(duì)1年陳釀手工老陳醋中的多酚物質(zhì)進(jìn)行提取，提取率為96.13%，多酚含量2.6mg/mL。

2.2 還原能力的測(cè)定結(jié)果

物質(zhì)的還原能力是評(píng)價(jià)其潛在抗氧化活力的重要指標(biāo)。還原力強(qiáng)弱與抗氧化能力大小呈正比。還原能力強(qiáng)的樣品是良好的電子和氫的供體，可以通過(guò)提供電子使自由基變?yōu)榉€(wěn)定的物質(zhì)，終止自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；同時(shí)，可與過(guò)氧化物的前體物質(zhì)相作用，阻止過(guò)氧化物的產(chǎn)生，從而起到抗氧化的作用[11-12]。反應(yīng)體系中樣品將Fe3+(鐵氰化鉀)還原為Fe2+(亞鐵氰化鉀)，然后再與Fe3+生成普魯士藍(lán)，在波長(zhǎng)700nm處的吸光度越高，表示還原力越強(qiáng)。

圖1 老陳醋多酚提取物、沒(méi)食子酸及抗壞血酸還原能力Fig.1 Reducing power of the polyphenolic extract, gallic acid and vitamin C

從圖1可見(jiàn)，所測(cè)樣品的還原能力均隨著質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，并呈現(xiàn)出顯著的量效關(guān)系，老陳醋多酚提取物、沒(méi)食子酸、抗壞血酸質(zhì)量濃度與還原力的線性方程分別為y＝0.0166x＋0.0501(R2＝ 0.9995)、y＝0.0165x＋0.0236(R2＝ 0.9996)、y＝ 0.0121x＋0.0261 (R2＝0.9992)。表明供試樣品都具有顯著的還原能力。從EC50(吸光度0.5時(shí)樣品的質(zhì)量濃度)的結(jié)果可以看出，提取物的還原力是最強(qiáng)的。還原能力從強(qiáng)到弱的順序是老陳醋多酚提取物(EC50＝27.10μg/mL)＞沒(méi)食子酸(EC50＝28.87μg/mL)＞抗壞血酸(EC50＝39.16μg/mL)。2.3 對(duì)亞硝酸鹽清除能力的測(cè)定結(jié)果

弱酸性條件下，NO2－與對(duì)氨基苯磺酸發(fā)生重氮化反應(yīng)，生成的重氮鹽與N-1-萘基乙二胺鹽酸鹽偶合生成紫紅色絡(luò)合物，可用分光光度法測(cè)定其在波長(zhǎng)540nm處的吸光度。亞硝酸鹽濃度與吸光度成良好的線性關(guān)系[13]。

圖2 老陳醋多酚提取物及抗壞血酸對(duì)亞硝酸鹽的清除能力Fig.2 Nitrite scavenging capacity of the polyphenolic extract and vitamin C

從圖2可見(jiàn)，所測(cè)樣品清除亞硝酸鹽的能力與樣品質(zhì)量濃度呈現(xiàn)顯著的量效關(guān)系。清除亞硝酸鹽的能力抗壞血酸(IC50＝85.01μg/mL)＞老陳醋多酚提取物(IC50＝269.72μg/mL)。

2.4 DPPH自由基清除活性的測(cè)定結(jié)果

DPPH自由基是一種很穩(wěn)定的自由基，在乙醇溶液中呈深紫色，在波長(zhǎng)517nm處有最大吸收峰；當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí)，其顏色減退，褪色程度與清除劑的清除能力及濃度相關(guān)[14]。

圖3 老陳醋多酚提取物、沒(méi)食子酸及抗壞血酸對(duì)DPPH自由基清除活性Fig.3 DPPH radical scavenging capacity of the polyphenolic extract, gallic acid and vitamin C

由圖3可見(jiàn)，不同質(zhì)量濃度的老陳醋多酚提取物、沒(méi)食子酸、抗壞血酸對(duì)DPPH自由基均有清除能力，且清除率與劑量相關(guān)。對(duì)DPPH自由基清除活性的高低順序?yàn)椋簺](méi)食子酸(IC50＝2.61μg/mL)＞老陳醋多酚提取物(IC50＝6.43μg/mL)＞抗壞血酸(IC50＝8.57μg/mL)。

2.5 清除·OH活性測(cè)定結(jié)果

·OH帶有一個(gè)不成對(duì)電子，性質(zhì)極活潑，其反應(yīng)性和毒性都很強(qiáng)，對(duì)生物體的損害最大。它可和活細(xì)胞中的任何分子發(fā)生反應(yīng)而造成損傷，而且反應(yīng)速度極快。

圖4 老陳醋多酚提取物、沒(méi)食子酸及抗壞血酸對(duì)·OH清除能力Fig.4 Hydroxyl radical scavenging capacity of the polyphenolic extract, gallic acid and vitamin C

由圖4可見(jiàn)，老陳醋多酚提取物、沒(méi)食子酸、抗壞血酸對(duì)·OH的清除率與劑量相關(guān)。對(duì)·OH清除活性的順序?yàn)椋豪详惔锥喾犹崛∥?IC50＝16.28μg/mL)＞沒(méi)食子酸(IC50＝160.43μg/mL)＞抗壞血酸(IC50＝238.70μg/mL)。

2.6 清除O2－·活性測(cè)定結(jié)果

O2－·可以轉(zhuǎn)化為其他氧自由基。因此，對(duì)O2－·的抑制可以有效地減少氧自由基的生成，具有非常重要的意義。

圖5 老陳醋多酚提取物、沒(méi)食子酸及抗壞血酸清除O－2·的能力Fig.5 Superoxide anion radical scavenging capacity of the polyphenolic extract, gallic acid and vitamin C

從圖5可見(jiàn)，3種物質(zhì)對(duì)O2－·均表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除效果，且隨著質(zhì)量濃度的增加，清除率也逐漸增強(qiáng)。對(duì)O2－·清除活性的高低順序?yàn)椋豪详惔锥喾犹崛∥?IC50＝ 4.70μg/mL)＞抗壞血酸(IC50＝6.35 μg/mL)＞沒(méi)食子酸(IC50＝56.49μg/mL)。

2.7 總抗氧化能力測(cè)定結(jié)果

按照南京建成試劑盒方法對(duì)樣品的總抗氧化能力進(jìn)行測(cè)定。沒(méi)食子酸及抗壞血酸質(zhì)量濃度均為1mg/mL，老陳醋多酚提取物中多酚質(zhì)量濃度為1mg/mL。

表1 老陳醋多酚提取物、沒(méi)食子酸及抗壞血酸的總抗氧化能力Table 1 Total antioxidant capacity of the polyphenolic extract, gallic acid and vitamin C

由表1可見(jiàn)，質(zhì)量濃度相同的各樣品的總抗氧化能力各不相同，總抗氧化能力高低順序?yàn)椋簺](méi)食子酸＞抗壞血酸＞老陳醋多酚提取物。

3 結(jié) 論

老陳醋多酚提取物的還原能力以及對(duì)·OH、O2－·的清除活性均低于沒(méi)食子酸和抗壞血酸；對(duì)DPPH自由基清除活性低于沒(méi)食子酸，強(qiáng)于抗壞血酸。清除亞硝酸鹽的能力低于抗壞血酸；總抗氧化能力低于抗壞血酸和沒(méi)食子酸。結(jié)果表明，老陳醋多酚有較強(qiáng)的體外抗氧化活性，老陳醋的保健價(jià)值值得進(jìn)一步研究和擴(kuò)展。

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Antioxidant Activity of Polyphenolic Extract from Shanxi Aged Vinegar

CHEN Shu-jun1，F(xiàn)ENG Bin1，LIU Cheng2，SU Jing1，ZHANG Hai-ying3，LIU Ya-bin1， WU Xia-hua1
(1. College of Life Science, Shanxi University, Taiyuan 030006, China；2. Beijing Food Research Institute,
B
eijing 100162, China；3.Shanxi Food Industrial Research Institute, Taiyuan 030024, China)

Thein vitroantioxidant activity of polyphenolic extract from Shanxi aged vinegar was investigated using different antioxidant evaluation systems and compared with that of gallic acid and vitamin C. The results showed that the polyphenolic extract possessed antioxidant activity in a dosage-dependent manner which varied with the type of model systems. The reducing power and hydroxyl free radical scavenging activity of the samples under investigation were found to decrease in the following order: the polyphenolic extract ＞ gallic acid ＞ vitamin C. The decreasing order of superoxide anion radical scavenging activity among the samples was the polyphenolic extract ＞ vitamin C ＞gallic acid. The DPPH radial scavenging activity was in the decreasing order of gallic acid ＞ the polyphenolic extract ＞ vitamin C. The nitrite scavenging activity of the extract was poorer than that of vitamin C. The samples decreased in total antioxidant capacity (at the same concentration) in the order of gallic acid ＞vitamin C ＞ the polyphenolic extract.

Shanxi aged vinegar；polyphenol；extract；antioxidant activity

TS264.2

A

1002-6630(2012)01-0031-04

2011-02-19

陳樹(shù)俊(1964—)，男，副教授，學(xué)士，研究方向?yàn)槭称沸鹿に嚺c食品安全。E-mail：chenshuj@sohu.com