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    脂肪氧化對蛋白質結構的影響

    2012-10-27 08:02:52章銀良安巧云
    食品科學 2012年1期
    關鍵詞:體系

    章銀良,安巧云,楊 慧

    (鄭州輕工業(yè)學院食品與生物工程學院, 河南 鄭州 450002)

    脂肪氧化對蛋白質結構的影響

    章銀良,安巧云,楊 慧

    (鄭州輕工業(yè)學院食品與生物工程學院, 河南 鄭州 450002)

    為了探索脂肪氧化對蛋白質結構的影響,利用不同條件下制備的氧化脂肪,加入蛋白后在同樣條件下作用一定時間,測定蛋白質的各項指標。結果表明:加入蛋白后硫代巴比妥酸值(TBA)值下降,蛋白氧化值升高(羰基含量),表面疏水性增加且最大發(fā)射波長(λmax)發(fā)生紅移,二級結構變化明顯。說明脂肪氧化對蛋白質結構產生了影響。

    氧化脂肪;蛋白質;TBA值;蛋白氧化值;表面疏水性;二級結構

    脂肪氧化分為脂肪氧化酶引起的酶催化氧化和非酶氧化[1]。引起非酶氧化的原因很多,包括自動氧化和光敏氧化。影響脂類非酶氧化的主要因素包括氧濃度、溫度、脂類濃度以及助氧化劑、輻射能等。

    在食品中,一般都包括糖類、脂肪和蛋白質三大類營養(yǎng)物質。而目前已發(fā)現(xiàn)脂肪存在時發(fā)生氧化會對蛋白質產生影響。例如Saeed 等[2]利用電子自旋共振(ESR)發(fā)現(xiàn)從大西洋鯖魚中提煉出來的油脂氧化后會使蛋白質包括卵溶菌酶、雞蛋卵清蛋白、魚類肌球蛋白和氨基酸(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)受到破壞。脂肪氧化大大縮短了冷凍魚許多品種的貨架保質期,特別是多脂肪的魚類易產生惡臭不利于消費[3]。研究表明冷凍儲存的脂肪氧化產品會使魚的組織蛋白變硬、聚集。此外,還損失了一些氨基酸,如半胱氨酸、賴氨酸、組氨酸和蛋氨酸,以及損害其他色素蛋白質,如細胞色素C和血紅蛋白[4]。

    脂類的過氧化產物與蛋白質的共價結合和脂類誘導的蛋白質聚合反應可能包括兩種機理:自由基反應和羰氨反應[5]。目前脂肪氧化的程度以及氧化產物的種類如何引起蛋白質變性和具體的變性程度卻還沒有得到深入研究。本實驗擬采用不同氧化條件對亞油酸進行氧化,加入牛血清蛋白初步探究氧化產物種類與蛋白質變性聚集程度之間的關系,以期為肉類加工的品質提高提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    牛血清蛋白(BSA,生物試劑) 北京Solarbio試劑公司;亞油酸(LA,含量≥99%) 北京百靈威公司;吐溫-20(化學純) 中國醫(yī)藥(集團)上?;瘜W試劑公司;2-硫代巴比妥酸(TBA)、冰乙酸、乙酸乙酯、無水乙醇、NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·2H2O、2,4-二硝基苯肼(DNPH)、三氯乙酸(TCA)、鹽酸胍、8-苯氨基-1-萘磺酸(ANS);以上均為分析純。

    1.2 儀器與設備

    T6型紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;F-7000型熒光分光光度計 日本Hitachi公司;Nicolet 5700型FT-IR傅里葉紅外光譜儀 美國Thermo公司;CoolSafe 55-4型真空冷凍干燥機 丹麥Labogene公司 ;GL-22M型高速冷凍離心機 賽特湘儀離心機儀器有限公司;HH-W420型數(shù)顯三用恒溫水箱金壇市醫(yī)療儀器廠。

    1.3 方法

    在不同條件下制得的脂肪氧化產物種類和脂肪氧化程度可能各不相同,在此氧化物基礎上再加入蛋白原樣,固定反應時間和條件,以此鑒定不同的脂肪氧化產物對蛋白的不同影響。即實驗只改變脂肪的氧化條件而固定加入蛋白后的反應條件。以下反應體系均用40mL蒸餾水做溶液,20μL吐溫-20做表面活性劑。

    1.3.1 氧化脂肪的制備

    1.3.1.1 不同氧濃度條件下的氧化脂肪的制備

    選用實驗組A和對照組a共2組平行體系,其中每組中設4個體系都加入20μL LA,間歇振蕩搖勻,使LA及吐溫-20均充分溶于水中,之后分別置于轉速為0、50、100、150r/min的25℃恒溫搖床中,氧化時間均為4h。4個體系按轉速由低到高分別記為1~4組。一般轉速越高,氧濃度也相應升高。

    1.3.1.2 不同溫度條件下的氧化脂肪的制備

    選用實驗組B和對照組b共2組平行體系,其中每組中設4個體系都加入20μL的LA,間歇振蕩搖勻,使LA及吐溫-20均充分溶于水中,之后分別置于溫度為-18、0、25、40℃條件下,氧化時間均為4h。4個體系按溫度由低到高分別記為1~4組。

    1.3.1.3 不同時間條件下的氧化脂肪的制備

    選用實驗組C和對照組c共2組平行體系,其中每組中設4個體系都加入20μL的LA,間歇振蕩搖勻,使LA及吐溫-20均充分溶于水中,置于25℃的水浴鍋中,反應時間分別為2、4、6、8h。4個體系按時間由長到短分別記為1~4組。

    1.3.1.4 不同脂肪含量條件下的氧化脂肪的制備

    選用實驗組D和對照組d 共2組平行體系,其中每組中設4個體系分別添加LA的量為10、20、30、40μL。間歇振蕩搖勻,使LA及吐溫-20均充分溶于水中,溫度均為25℃,氧化時間均為4h。4個體系按LA含量由低到高分別記為1~4組。

    1.3.2 氧化脂肪與蛋白模擬體系的配制

    上述各組體系反應后A、B、C、D組分別加入80mg的BSA,振蕩混勻,25℃條件下反應4h,測定脂肪TBA值的變化。

    平行組(a、b、c、d)組不加BSA,同樣25℃條件下反應4h。作為對照組比較脂肪TBA值的變化。

    1.3.3 油脂硫代巴比妥酸值(TBA值,即丙二醛含量)的測定

    參照Witte等[6]的方法略做修改:精密量取20mL的液體樣品,將其轉入到常量凱氏蒸餾瓶中,加入2mL 6mol/L鹽酸溶液(使pH值為1.5左右),以蒸餾水蒸氣,準確收集50.0mL蒸餾液。之后移取5.0mL蒸餾液于20mL比色管中,以蒸餾水作空白對照,加入濃度為0.02mol/L的TBA醋酸溶液5.0mL,加蓋密封,充分混合均勻,95℃水浴40min,再快速用冷水沖洗冷卻(約10min)至室溫。用分光光度計測量其在波長532nm處的吸光度。

    式中:A為吸光度;155為吸光系數(shù)/(L/(mmol·cm));L為光徑/cm;m為樣品質量/g。

    1.3.4 蛋白質氧化值的測定

    參考Levine等[7]的方法略作修改,將樣液稀釋3倍配成0.9~1.2mg/mL的蛋白溶液。取1mL蛋白溶液與1mL 10mmol/L的DNPH(用2mol/L的HCl溶解)混勻,并用不含DNPH的2mol/L HCl溶液作空白對照;將各個反應體系置于黑暗中放置1h,每隔10min漩渦1次;反應完畢后,加入1mL 20%的TCA溶液沉淀蛋白質腙衍生物,4℃條件下,以12000×g離心15min,棄上清;得到的沉淀用1mL乙醇和乙酸乙脂混合物(體積比1:1) 洗滌3次除去未結合的DNPH,最后的沉淀用3mL 6mol/L 的鹽酸胍溶解(37℃,水浴15min);12000 ×g離心15min除去不溶物質,取上清,在波長370nm處測吸光度。1.3.5 表面疏水性的熒光強度測定

    采用熒光探針ANS。將0.5mL樣液與1.5mL含0.6mol/L KCl的磷酸鹽緩沖溶液(pH7.0)混勻,使其蛋白質量濃度在0~1mg/mL范圍內,取2mL上述溶液,加入10μL 8mmol/L ANS,混合均勻在暗處放置10min,測定條件為激發(fā)波長374nm(狹縫2.5nm),掃描速度為1200nm/min,掃描范圍為400~600nm,測定其熒光強度[8]。

    1.3.6 蛋白質二級結構的測定

    取各體系樣品1和4做FI-IR分析。將樣液首先放入-70℃冰箱中冷凍約8h,再放入真空冷凍干燥機中干燥10h可得干燥粉末。利用傅里葉紅外光譜儀,將干燥后的樣品粉末均勻地鋪滿ATR采樣器附件的Ge晶片上,進行掃描收集樣品光譜,掃描范圍650~4000cm-1,掃描次數(shù)256次,分辨率4cm-1。

    2 結果與分析

    2.1 TBA值對蛋白質影響

    圖1 TBA值變化對蛋白質影響Fig.1 Effect of TBA value change on protein structure

    從圖1可見,無論是實驗組還是對照組中TBA值均逐漸增大。圖1a中轉速達到50r/min后得到的氧化脂肪TBA值迅速上升;圖1b中溫度超過0℃后得到的氧化脂肪TBA值也上升較快;圖1c中不同反應時間中4h內得到的氧化脂肪TBA值變化較大,之后趨于緩慢;圖1d中隨著LA含量的增大得到的氧化脂肪TBA值一直呈增大趨勢,表明脂肪氧化產物丙二醛量都有不同程度的增加。

    最重要的是添加蛋白質的反應組TBA值均比對照組減小了,統(tǒng)計學得出圖1a中轉速為0的實驗組與對照組差異不顯著(P=0.053>0.05),其他轉速均有顯著性差異;圖1b中-18℃條件下的P=0.226,實驗組與對照組無顯著差異,其他溫度條件下都有顯著性差異;圖1c的氧化時間4h時的P=0.07,實驗組與對照組無顯著差異,其他氧化時間條件下都有顯著性差異;圖1d中的LA含量條件為30μL時P=0.081,實驗組與對照組無顯著差異,其他含量下都有顯著性差異。說明丙二醛一部分與蛋白質發(fā)生了反應,導致蛋白質交聯(lián)[9]。脂類氧化產物與蛋白質的作用機理其一即是羰氨反應:脂質氧化的次生產物(醛類或者酮類化合物)的羰基可與蛋白質分子的氨基等側鏈基團發(fā)生反應,導致多肽鏈的鏈內交聯(lián)和鏈間交聯(lián)[10]。脂肪TBA值的變化側面反映了脂肪氧化產物對蛋白質變性的影響。

    2.2 蛋白質氧化值(羰基含量)的測定結果

    比色法是測定蛋白質羰基含量的經典方法。DNPH法工作原理是蛋白質被氧化后羰基含量會增多,羰基可與DNPH結合,反應生成2,4-二硝基苯腙,腙類物質為紅棕色的沉淀,用鹽酸胍溶解后在波長370nm處有一定的吸光度,從而可以測得蛋白質的羰基含量[11]。

    表1 各組中蛋白質的氧化值Table 1 Oxidation value of BSA in each group

    由表1可見,不同氧濃度條件下引起的蛋白質氧化值變化差異較顯著;-18℃和0℃對結果的影響不夠明顯;隨著時間增加到6h與8h沒有顯著差異,LA含量同樣為30μL和40μL沒有顯著差異。各組體系中的羰基含量都增加,原因是脂質過氧化反應中產生的自由基可使蛋白質變性[12]:幾乎組成蛋白質的所有氨基酸對羥自由基(·OH)及超氧陰離子自由基(O2-·)的攻擊都很敏感,尤其是在側鏈上帶有NH或NH2的氨基酸對羥自由基更為敏感。在反應過程中,這些敏感基團被自由基攻擊轉化成羰基基團[13-14],從而導致羰基含量的增加。之后還會進一步引起蛋白質分子的肽鍵的斷裂、聚合等變化,并使蛋白質與脂類結合,生成聚合物。表1中氧濃度組測得的羰基含量最高,也說明含氧量多的脂肪更易產生自由基促進蛋白質變性。此方面結論和蛋白質與脂類作用機理中的自由基作用相一致。

    2.3 蛋白質表面疏水性的測定結果

    蛋白質分子中的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸殘基能受到激發(fā)而產生熒光,激發(fā)后可在304、348nm(激發(fā)波長280nm)和282nm(激發(fā)波長260nm)測定其熒光強度,而其他氨基酸則不產生內源熒光。利用蛋白質的外源熒光性質研究獲得更多關于蛋白質分子的信息[9]。因為蛋白質的表面疏水性與蛋白質的空間結構、蛋白質所呈現(xiàn)的表面性質和脂肪結合能力等有關,更能反映出它同水、其他化學物質產生作用時的實際情況。測定外源熒光最常用的熒光探針是ANS[15]。

    圖2 各組中蛋白質表面疏水性的變化Fig.2 Change in surface hydrophobicity of BSA in each group

    由圖2可見,各組中熒光強度都逐漸升高,也就是表面疏水性升高。原因可能是蛋白質分子解折疊,使肽鏈斷裂或結構伸展,分子的內部疏水基團暴露(包括疏水性的芳香族和芳香性氨基酸側鏈基團暴露)導致表面疏水性的增加。從圖2還可以看出,最大發(fā)射波長都隨著熒光強度的增加不同程度的向長波方向(紅移)移動,表明蛋白質分子解折疊造成色氨酸殘基暴露于表面,而熒光強度的增加說明此時暴露的色氨酸殘基還沒有被氧化[16]。

    2.4 蛋白質二級結構分析

    蛋白質和多肽的二級結構在紅外區(qū)的9個特征吸收帶中,酰胺Ⅰ帶(1600~1700cm-1) 對于研究二級結構最有價值。通常認為1600~1640cm-1為β-折疊(β-sheet);1640~1650cm-1為無規(guī)卷曲(random);1650~1658cm-1為α-螺旋(α-helix);1660~1695cm-1為β-轉角(β-turn)[17]。

    圖3 樣品A1和A4紅外圖譜經過自動去卷積后的酰胺I帶分布圖Fig.3 Distribution of amide I band in infra-red fourier selfdeconvolved spectra of samples A1 and A4

    通過對蛋白質酰胺吸收帶的去卷積、二階導數(shù)和擬合分析,在變性條件下觀察到蛋白質新構象的產生、部分或全部去折疊引起的二級結構的破壞、二級結構相對含量的變化。對4個體系的樣品1和4蛋白質的FT-IR圖譜選擇在波數(shù)1600~1700cm-1范圍用Peakfit 4.12軟件分析,得到紅外圖譜經過自動去卷積后的酰胺I帶分布及二級結構各成分面積比例的變化。

    表2 樣品A1和A4不同體系中蛋白質酰胺I帶的分析Table 2 Analysis of amide I band in FT-IR spectra of samples A1 and A4

    由圖3和表2可見,氧濃度組(A組),從樣品A1到A4結構穩(wěn)定的α-螺旋減少為0,大部分轉向了不穩(wěn)定的β-轉角,而且還出現(xiàn)了32.89%的無規(guī)卷曲,可以看出氧濃度不同引起的氧化脂肪對蛋白質二級結構引起了較大的變化。

    圖4 樣品B1和B4紅外圖譜經過自動去卷積后的酰胺I帶分布圖Fig.4 Distribution of amide I band in infra-red fourier selfdeconvolved spectra of samples B1 and B4

    表3 樣品B1和B4不同體系中蛋白質酰胺I帶的分析Table 3 Analysis of amide I band in FT-IR spectra of samples B1 and B4

    由圖4和表3可見,溫度組(B組),從樣品B1到B4,β-折疊稍有減少,α-螺旋從65.89%減少到36.13%,β-轉角也相對增加,說明蛋白質由穩(wěn)定的結構逐漸變得不穩(wěn)定,這與2.3節(jié)提到的表面疏水性結果相一致,蛋白質分子發(fā)生了解折疊,導致肽鏈斷裂或結構伸展等。

    圖5 樣品C1和C4紅外圖譜經過自動去卷積后的酰胺I帶分布圖Fig.5 Distribution of amide I band in infra-red fourier selfdeconvolved spectra of samples C1 and C4

    表4 樣品C1和C4不同體系中蛋白質酰胺I帶的分析Table 4 Analysis of amide I band in FT-IR spectra of samples C1 and C4

    由圖5和表4可見,時間組(C組),從樣品C1到C4,規(guī)則的α-螺旋減少了大約一半,主要轉化成了不規(guī)則的β-轉角,說明蛋白的二級結構隨著時間的變化也發(fā)生了變化。

    圖6 樣品D1和D4紅外圖譜經過自動去卷積后的酰胺I帶分布圖Fig.6 Distribution of amide I band in infra-red fourier selfdeconvolved spectra of samples D1 and D4

    表5 樣品D1和D4不同體系中蛋白質酰胺I帶的分析Table 5 Analysis of amide I band in FT-IR spectra of samples D1 and D4

    由圖6和表5可見,樣品D1和D4蛋白質的二級結構變化程度也不同。表明不同氧化程度和不同氧化產物對蛋白的變性程度也有所影響。

    3 結 論

    利用不同條件下制備的氧化脂肪,加入蛋白后在相同條件下作用一定時間,測定蛋白質的各項指標。結果表明,加入蛋白后TBA值下降,蛋白氧化值升高(羰基含量),表面疏水性增加且最大發(fā)射波長(λmax)發(fā)生紅移,蛋白質二級結構變化明顯。由此推論脂肪氧化對蛋白質結構產生了影響,脂肪氧化產物和蛋白質作用的兩種可能機理:羰氨反應和自由基反應。

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    Effect of Lipid Oxidation on Protein Structure

    ZHANG Yin-liang,AN Qiao-yun,YANG Hui
    (School of Food and Bioengineering, Zhengzhou University of Light Industry, Zhengzhou 450002, China)

    This paper deals with the effect of lipid oxidation on protein structure. Oxidized lipid products were prepared by oxidizing linoleic acid under different conditions and allowed to react with bovine serum albumin (BSA) under the same conditions (25 ℃, 4 h). Changes in various properties of BSA were determined during the reaction with oxidized lipid products. The results showed that oxidized lipid products revealed a decrease in thiobarbituric acid value (TBA) after reaction with BSA, while the oxidation value (carbonyl group content) and surface hydrophobicity of BSA increased. Meanwhile, the maximum emission wavelength of the protein showed a red shift and the secondary structure varied obviously. Therefore, lipid oxidation has a significant impact on protein structure.

    lipid oxidation;protein;TBA value;protein oxidation value;surface hydrophobicity;secondary structure

    TS201.2

    A

    1002-6630(2012)01-0025-06

    2011-02-13

    鄭州輕工業(yè)學院博士基金項目(2007BSJJ007)

    章銀良(1963—),男,教授,博士,研究方向為食品化學與食品質量安全。E-mail:zhyinliang@163.com

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