龍膽內(nèi)生菌的分離鑒定及其對(duì)蘋果腐爛病菌的拮抗作用

黃海東，李曉雁，楊紅澎，盧顯芝，韓 影

（天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)系，天津 300384）

龍膽內(nèi)生菌的分離鑒定及其對(duì)蘋果腐爛病菌的拮抗作用

黃海東，李曉雁，楊紅澎，盧顯芝，韓 影

（天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)系，天津 300384）

從云霧龍膽中分離到內(nèi)生菌LD－b1，通過形態(tài)觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)和16S rDNA系統(tǒng)進(jìn)化分析，鑒定其為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）。該菌株的發(fā)酵上清液對(duì)蘋果腐爛病菌的生長(zhǎng)有顯著的拮抗作用，拮抗活性物質(zhì)對(duì)80℃以下的溫度有一定耐受能力;在pH 5～10之間均有一定活性，對(duì)低pH更敏感;50μg/mL的蛋白酶K在37℃條件下處理1h可以使其抑菌活性完全喪失。抑菌曲線測(cè)定結(jié)果表明，搖瓶發(fā)酵48h時(shí)內(nèi)生菌LD－b1的抑菌活性最高，在蘋果果實(shí)上對(duì)腐爛病斑也具有明顯的抑制作用。

龍膽，內(nèi)生菌，蘋果腐爛病菌，拮抗作用

蘋果腐爛病俗稱爛皮病，是一種對(duì)蘋果危害嚴(yán)重的病害，而且越靠北部寒冷地區(qū)越嚴(yán)重，目前防治蘋果腐爛病多采用化學(xué)試劑，雖然見效快、防治效果好，但長(zhǎng)期使用化學(xué)殺菌劑不但會(huì)導(dǎo)致病菌對(duì)其產(chǎn)生抗藥性［1－2］，而且蘋果上殘留的化學(xué)藥劑也會(huì)對(duì)公眾健康造成威脅并污染環(huán)境，為此，各國(guó)科學(xué)家都在積極探索能代替化學(xué)農(nóng)藥的防病新技術(shù)［3］。植物內(nèi)生菌（endophyte）是指生活在植物活組織內(nèi)而不引起任何直接和明顯植物病變的一大類微生物，包括寄生或共生在植物體內(nèi)的真菌和細(xì)菌。植物內(nèi)生細(xì)菌是植物病害生物防治的天然資源菌，具有廣闊的理論研究?jī)r(jià)值和開發(fā)應(yīng)用前景［4－5］。云霧龍膽（Gentiana nubigena）是龍膽科龍膽屬的植物，具有抗炎、利膽等作用［6］，本文對(duì)云霧龍膽內(nèi)生菌進(jìn)行了分離鑒定，研究了內(nèi)生菌對(duì)蘋果腐爛病菌的抑制效果，并對(duì)抑菌活性成分性質(zhì)進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

云霧龍膽 由青海省藏醫(yī)藥研究院藥物研究所提供;蘋果腐爛病菌（Valsa mali Miyabe et Yamada）

由天津農(nóng)學(xué)院園藝系田小衛(wèi)博士提供;改良馬丁培養(yǎng)基 蛋白胨5g，葡萄糖20g，酵母粉2g，K2HPO41g，MgSO40.5g，蒸餾水1000m L，pH 6.4±0.2;篩選培養(yǎng)基1 蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，云霧龍膽浸提液1m L，瓊脂15g，蒸餾水1000m L，pH 7.0～7.5;篩選培養(yǎng)基2 馬鈴薯200g，葡萄糖20g，云霧龍膽浸提液1m L，瓊脂15g，蒸餾水1000m L，pH 7.0～7.5;發(fā)酵培養(yǎng)基 蔗糖30g，蛋白胨2g，K2HPO40.3g，NaCl 0.1g，蒸餾水1000m L，pH 7.0～7.5;UNIQ－10試劑盒，pGEM－T Easy載體 Promega公司。

Biofuge型高速冷凍離心機(jī) Heraeus公司; Tgradient型PCR儀 Biometra公司;DYY－6B型電泳儀和WD－9403F型紫外分析儀 北京六一儀器廠;LRH－150B型生化培養(yǎng)箱 廣東醫(yī)療器械廠; HYG－III回旋式搖床 上海新蕊公司;HH－Z4型恒溫水浴鍋 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)公司;752型紫外光柵分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 龍膽內(nèi)生菌的分離 取一段云霧龍膽的莖，無菌水沖洗2次，用無菌濾紙吸干水分;在70%乙醇溶液中浸泡2m in，再用0.1%升汞浸泡30s，無菌水沖洗3次。在無菌條件下用刀片將外皮削去，并截成1cm左右的小段，置于篩選培養(yǎng)基表面，30℃培養(yǎng)4～8d。待平板有菌長(zhǎng)出后，平板劃線純化，直至得到單菌落，斜面保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 內(nèi)生菌發(fā)酵液的制備 250m L三角瓶裝100m L發(fā)酵培養(yǎng)基，接種后置于旋轉(zhuǎn)式搖床上，180r/min、30℃培養(yǎng)48h，發(fā)酵液在6000 r/m in下離心10m in，取上清液用于抗菌活性測(cè)定。

1.2.3 抗菌活性測(cè)定 將蘋果腐爛病菌活化和擴(kuò)大培養(yǎng)，稀釋制成106孢子/m L的懸液，取0.2m L孢子懸液與滅菌改良馬丁培養(yǎng)基15m L混合制成平板，凝固后，用滅過菌的1cm直徑打孔器在每個(gè)平板上打孔，除去孔內(nèi)瓊脂并向孔中加入0.1m L發(fā)酵上清液，以無菌蒸餾水和云霧龍膽浸提液［7］為對(duì)照，28℃培養(yǎng)4d后，測(cè)量抑菌圈直徑。為了確保結(jié)果的準(zhǔn)確性，每平板設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.4 龍膽內(nèi)生菌的分類鑒定

1.2.4.1 形態(tài)特征 取固體平板上培養(yǎng)48h的菌株進(jìn)行革蘭氏染色、芽孢染色、鞭毛染色，觀察內(nèi)生菌的形態(tài)特征。

1.2.4.2 生理生化特征 氧化酶、接觸酶、H2S產(chǎn)生、吲哚、硝酸鹽還原、脲酶等實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)［8］進(jìn)行。

1.2.4.3 16S rDNA序列測(cè)定及系統(tǒng)進(jìn)化分析 將菌株LD－b1于30℃培養(yǎng)24h，離心后，用0.5mol/L NaCl洗1次，用1mg/m L溶菌酶溶液懸浮菌體，37℃作用30min，用UNIQ－10試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA。以菌株LD－b1的基因組DNA為模板，用細(xì)菌16S rDNA通用引物27F（5'－GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3'）和1541R（5'－AAGGAGGTGATCCAGCCGCA－3'）擴(kuò)增得到目的基因片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化后與pGEM－T Easy載體連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5a，用X－gal平板篩選含有插入DNA片段的白色轉(zhuǎn)化子，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切鑒定后送北京華大公司測(cè)序。將得到的16S rDNA序列與 GenBank中的核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，搜索得到與其同源性最高的相關(guān)序列，采用軟件Clustal X1.8對(duì)所獲得的核苷酸序列進(jìn)行分析，得到序列之間的相似值;用軟件MEGA2.0計(jì)算出序列的系統(tǒng)進(jìn)化距離，采用鄰位相連法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹［9］。

1.2.5 抑菌活性曲線的測(cè)定 將內(nèi)生菌LD－b1種子液按照2%的接種量接入100m L液體培養(yǎng)基，30℃，180r/min振蕩培養(yǎng)，每隔6h取樣，測(cè)定OD600光吸收值，并取上清液進(jìn)行抗蘋果腐爛病菌的活性檢測(cè)。

1.2.6 溫度、pH、蛋白酶對(duì)抗菌物質(zhì)活性的影響 內(nèi)生菌發(fā)酵液在8000 r/m in條件下離心15m in后，上清液經(jīng)0.22μm濾膜過濾后，分別作以下處理:a.分別經(jīng)20、40、60、80、100℃處理1h和121℃處理30m in; b.將pH分別調(diào)至4.0～11.0;c.加入蛋白酶K，使其終濃度達(dá)到50μg/m L，37℃水浴0.5、1、2、4h。經(jīng)上述處理后測(cè)定抗蘋果腐爛病菌的活性，每處理重復(fù)3次。

1.2.7 在蘋果果實(shí)上的抑菌實(shí)驗(yàn) 將紅富士蘋果用70%酒精消毒，晾干后，用接種針在蘋果上刺一個(gè)6mm（深）×4mm（直徑）的傷口，分別加入200μL的LD－b1發(fā)酵上清液和無菌水，2h后分別接種105孢子/m L的蘋果腐爛病菌200μL，將果實(shí)放于果盤中，果盤用保鮮膜包裹，25℃放置，一周后觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 龍膽內(nèi)生菌的分離及抗菌效果測(cè)定

從云霧龍膽中分離得到多株內(nèi)生細(xì)菌，制備內(nèi)生菌發(fā)酵液，以無菌水為陰性對(duì)照，云霧龍膽提取液［7］為陽性對(duì)照，用混菌瓊脂平板打孔法測(cè)定抑菌活性。結(jié)果篩選到一株龍膽內(nèi)生細(xì)菌LD－b1，其發(fā)酵上清液能明顯抑制平板上蘋果腐爛病菌的生長(zhǎng)（圖1），而龍膽提取液也有一定的抑菌作用。

圖1 菌株LD－b1對(duì)蘋果腐爛病菌的抑制作用Fig.1 Antibiotic activity toward V.mali of strain LD－b1

2.2 菌株LD－b1的分類鑒定

2.2.1 形態(tài)特征 在固體平板上30℃培養(yǎng)1d，菌株LD－b1形成乳白色不透明菌落，菌落近似圓形，邊緣不整齊，中間有小突起，直徑0.6～1.1cm，不分泌色素;LD－b1菌體細(xì)胞為短桿狀，大小0.5～0.6μm× 1.5～2.1μm，革蘭氏陽性，有芽孢。

2.2.2 生理生化特性 菌株LD－b1好氧生長(zhǎng)，生長(zhǎng)的溫度范圍為8～50℃，pH范圍5.5～8.5，NaCl濃度范圍0～7%;能夠利用的碳源有:葡萄糖、蔗糖、乳糖、樹膠醛糖、木糖、半乳糖、甘露醇、N－乙酰－葡糖胺、葡糖酸鹽;不能利用淀粉、糊精、蜜二糖、鼠李糖和山梨醇。其他生理生化指標(biāo)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

2.2.3 16S rDNA序列測(cè)定及系統(tǒng)進(jìn)化分析 PCR擴(kuò)增得到菌株LD－b1的16S rDNA片段，經(jīng)DNA測(cè)序長(zhǎng)度為1444bp，在GenBank/EMBL/DDBJ中的序列登記號(hào)為JF932295。將16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行 BLAST比對(duì)，結(jié)果表明菌株LD－b1與芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）的同源性較高，且與 Bacillus pum ilus KNUC389和 Bacillus pum ilus KNUC235的同源性最高，分別為達(dá)到 99.8%和99.7%。將其與芽孢桿菌屬9個(gè)相近的種進(jìn)行遺傳距離計(jì)算，用鄰位相連法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2），可以看出，菌株 LD－b1與短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）劃分在同一簇內(nèi)，結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化特征指標(biāo)，確定云霧龍膽內(nèi)生菌LD－b1為短小芽孢桿菌。

表1 菌株LD－b1的生理生化特征Table 1 Physio－biochemical characteristics of strain LD－b1

圖2 菌株LD－b1的16S rDNA序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylognetic tree of LD－b1 16S rDNA sequences

2.3 內(nèi)生菌LD－b1對(duì)蘋果腐爛病菌的抑菌曲線

由圖3中內(nèi)生菌LD－b1的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線可以看出，培養(yǎng)48h的OD600最大，之后進(jìn)入衰亡期;而抑菌圈直徑也隨著內(nèi)生菌的生長(zhǎng)而變大，在36～48h之間LD－b1的抑菌活性最大，說明后期研究中，應(yīng)該將搖瓶發(fā)酵周期控制在此時(shí)間段內(nèi)。

圖3 菌株LD－b1對(duì)蘋果腐爛病菌的抑菌活性曲線Fig.3 Antibiotic activity curve toward V.mali of strain LD－b1

2.4 溫度、pH、蛋白酶K對(duì)抗菌物質(zhì)活性的影響

內(nèi)生菌LD－b1的無菌濾液經(jīng)不同溫度處理后進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)，由圖4可以看出，抗菌物質(zhì)對(duì)熱有一定的耐受能力，20℃的抑菌活性與對(duì)照（發(fā)酵液不經(jīng)熱處理）相同，40℃處理1h后樣品抑菌活性為對(duì)照樣品的91%，100℃以上的處理后樣品無抑菌活性。

由圖5可知，菌株LD－b1產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)對(duì)低pH更敏感，對(duì)偏堿環(huán)境有一定的耐受能力。在pH為8時(shí)抗菌活性降低22.5%，pH為9時(shí)抗菌活性降低48.7%，在pH小于4或大于11的條件下，抗菌活性完全喪失。

圖4 溫度對(duì)胞外抗菌物質(zhì)活性的影響Fig.4 Effect of temperature on the antibiotic activity of extracellularmetabolite

圖5 pH對(duì)胞外抗菌物質(zhì)活性的影響Fig.5 Effect of pH on the antibiotic activity of extracellularmetabolite

在樣品中加入蛋白酶K，30℃處理30m in后，抑菌圈直徑減少為對(duì)照的38.9%，處理時(shí)間大于1h，則抑菌活性完全消失，結(jié)合其對(duì)溫度和pH的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，判斷內(nèi)生菌LD－b1產(chǎn)生的抗菌成分為蛋白類物質(zhì)。

2.5 內(nèi)生菌LD－b1在蘋果果實(shí)上的抑菌效果

從圖6可以看出，內(nèi)生菌LD－b1產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)能夠顯著地抑制蘋果腐爛病菌對(duì)果實(shí)的侵蝕。接種病菌后室溫放置 6d，對(duì)照果實(shí)的病斑直徑為17.5mm，LD－b1樣品處理后果實(shí)的病斑直徑為2.4mm，僅為對(duì)照的13.7%。

圖6 不同處理蘋果的病斑Fig.6 Decay lesion of apples after different inoculation

3 結(jié)論

中藥內(nèi)生菌能產(chǎn)生具有抗菌等多種活性的代謝產(chǎn)物，是植物病害生物防治的重要微生物資源。目前，對(duì)蘋果腐爛病的生防研究主要使用放線菌中的鏈霉菌屬和內(nèi)生真菌，內(nèi)生細(xì)菌對(duì)該種病害拮抗作用的報(bào)道相對(duì)較少［10－11］。芽孢桿菌屬是常見的內(nèi)生細(xì)菌種類，可以產(chǎn)生桿菌肽、環(huán)脂、氨基酸類、核酸類、類噬菌體顆粒等多種抗菌物質(zhì)，能抑制多種植物及人類病原菌［12］;而且芽孢桿菌具有生長(zhǎng)快、營(yíng)養(yǎng)簡(jiǎn)單、抗逆性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，非常適合開發(fā)成防菌劑。本研究從云霧龍膽中分離篩選到一株對(duì)蘋果腐爛病菌有顯著拮抗作用的內(nèi)生菌:短小芽孢桿菌LD－b1。該菌株產(chǎn)生的抗菌成分為蛋白類物質(zhì)，搖瓶發(fā)酵48h的抗菌活性最強(qiáng)，在蘋果果實(shí)上對(duì)腐爛病斑也具有明顯的抑制作用，說明其在蘋果腐爛病菌防治方面有很好的應(yīng)用前景。該菌株產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的發(fā)酵條件優(yōu)化、環(huán)境安全評(píng)估等仍有待進(jìn)一步的深入研究。

［1］王署文，代永剛，牛紅紅，等.國(guó)內(nèi)外果蔬生物保鮮技術(shù)的研究進(jìn)展［J］.農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊，2008，157（12）:110－113.

［2］鮑敏達(dá)，王娟.蘋果腐爛病重發(fā)原因分析及防治對(duì)策［J］.甘肅林業(yè)科技，2009，34（2）:64－66.

［3］吳士云，孫力軍，周聲，等.內(nèi)生菌EJS防治油桃采后病害的研究［J］.食品科技，2007（6）:239－242.

［4］石晶盈，陳維信，劉愛媛.植物內(nèi)生菌及其防治植物病害的研究進(jìn)展［J］.生態(tài)學(xué)報(bào)，2006，26（7）:2395－2401.

［5］文才藝，吳元華，田秀玲.植物內(nèi)生菌研究進(jìn)展及其存在的問題［J］.生態(tài)學(xué)雜志，2004，23（2）:86－91.

［6］曹裴華，李沖.龍膽屬植物化學(xué)成分及藥理作用的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)新藥雜志，2008，17（1）:27－29.

［7］黃海東，楊紅澎，王玉，等.云霧龍膽內(nèi)生菌的分離鑒定及抗菌活性分析［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2010，37（7）:1017－1021.

［8］東秀珠，蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)［M］.北京:科學(xué)出版社，2001:267－295.

［9］Francois J，Julie D.Multiple sequence alignment with Clustal X［J］.Trends in Biochemical Sciences，1998，23（10）:403－405.

［10］展麗然，張克誠，冉隆賢，等.蘋果腐爛病菌拮抗放線菌的分離與鑒定［J］.河北林果研究，2008，23（2）:182－186.

［11］鄧振山，趙龍飛，張薇薇，等.銀杏內(nèi)生真菌的分離及其對(duì)蘋果腐爛病病原菌的拮抗作用［J］.西北植物學(xué)報(bào)，2009，29 （3）:608－613.

［12］蒙顯英，黎起秦，馮家勛，等.芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)植保導(dǎo)刊，2004，24（12）:13－15.

Identification of endophyte from Gentiana nubigena and antagonism on the Valsa mali

HUANG Hai－dong，LIXiao－yan，YANG Hong－peng，LU Xian－zhi，HAN Ying

（Department of Agronomy，Tianjin Agricultural University，Tianjin 300384，China）

Endophytic strain LD－b1 was isolated from Gentiana nubigena.Accord ing to the characteristics of morphology，physiology and biochem istry tests and the com parison of 16S rDNA sequence，strain LD－b1 was identified as Bacillus pum ilus.The fermentation broth of LD－b1 showed antagonism activities against Valsamali.The antibiotic active substance was stab le to the tem perature lower than 80℃，and the pH range from 5 to 10，butmore suscep tib le to lower pH.The antifung la activity lost under the treatmentw ith 50μg/m L p roteinase K in the cond itions of 37℃ longer than 1h.The results of shaking flask fermentation curves showed antibiotic ac tivities reached the maximum at48h.The lesion d iameter was smaller obviously when app le fruits were treated w ith LD－b1.

Gentiana;endophyte;Valsa m ali;antagonism

TS201.3

A

1002－0306（2012）06－0215－04

2011－06－01

黃海東（1972－），男，副教授，主要從事資源細(xì)菌及工程方面的研究。

天津市高等學(xué)校科技發(fā)展基金（20100604）;天津市科委基礎(chǔ)重點(diǎn)項(xiàng)目（11JCZDJC16600）。