珍珠粟響應(yīng)水楊酸處理的基因表達譜分析

張莉，于浩泉，高德鵬，王曉東，和天天，蘇曼琳，韓淵懷

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物工程研究所，山西 太谷030801；2.北京林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，北京100083）

珍珠粟（Pennisetum glaucum）屬于禾本科黍族狼尾草，為糧食飼料兼用的一年生草本植物，又稱蠟燭稗或御谷。珍珠粟在谷類中被認(rèn)為是世界上第六大重要熱帶食物，其主要生長在非洲西部和印度等半干旱地區(qū)。在貧瘠的沙土和干旱地區(qū)，珍珠粟是唯一可靠的糧食和飼料作物；在非洲和亞洲的干旱地區(qū)，珍珠粟是主要的糧食作物；在南美等熱帶和亞熱帶地區(qū)，珍珠粟被廣泛的用于夏季牧場作物［1］。

作物的產(chǎn)量在很大程度上會受一些環(huán)境條件的影響，如干旱、高溫、低溫、高鹽等。作物在這些非生物因子的脅迫下，會產(chǎn)生各種不同的生理和分子響應(yīng)，包括基因表達、新陳代謝、滲透壓調(diào)節(jié)、誘導(dǎo)修復(fù)系統(tǒng)改變，以及對于病菌侵染時的響應(yīng)等，這些過程影響著作物的分布、生長和產(chǎn)量。早在1985年，Guy等就通過研究在低溫條件下基因的表達變化，以了解植物中的非生物脅迫應(yīng)答通路［2］。通過不同的文庫篩選，研究者在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了RD29A等脫水應(yīng)答基因。不久，研究者又通過單酵母雜交系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，脫水應(yīng)答元件結(jié)合因子（DDREB）結(jié)合于RD29A啟動子的脫水應(yīng)答元件（DRE）上［3，4］。使用相似的方法，在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了一系列低溫應(yīng)答基因［5］。前期關(guān)于脅迫相關(guān)通路的研究主要以前基因組時代的表達譜方法為主，如：先進行不同文庫的篩選，再進行分子和生物學(xué)功能分析的方法。以全基因組表達譜為代表的表達譜芯片技術(shù)為全基因組表達研究提供了可能。Kreps等通過包含約8000個基因的表達譜芯片，研究了擬南芥在受到傷害脅迫時的表達譜變化。研究表明，其中17個受傷害等生物脅迫誘導(dǎo)的基因，在低溫、干旱、高鹽和ABA處理的非生物脅迫條件下也會受到誘導(dǎo)，這些基因包括經(jīng)常出現(xiàn)在非生物脅迫應(yīng)答中的CBF1和CBF2基因和一些水通道蛋白，而大多傷害應(yīng)答基因與病菌應(yīng)答通路中的基因一致［6～8］。

除了非生物脅迫外，病菌、害蟲、寄生植物等生物脅迫對植物的產(chǎn)量也有著很大的影響。已有研究表明，植物的病菌抗性可以被茉莉酸（JA）、水楊酸（SA）、乙烯（ET）和硫代葡萄糖苷及他們的水解產(chǎn)物等調(diào)節(jié)。生物脅迫往往會引起JA、SA、ET等相關(guān)信號通路的變化，JA、SA、ET等會作為信號分子來激發(fā)一些植物的抗性反應(yīng)，來響應(yīng)或抵抗外來的生物脅迫。通過研究擬南芥的c DNA表達譜分析研究表明，在擬南芥受到黑斑菌侵染或用防衛(wèi)相關(guān)信號分子，如：SA、茉莉酸甲酯（MeJA）、ET等一種或多種處理下，705個mRNA分子的表達都發(fā)生了變化，其中包括已知的及預(yù)測的防衛(wèi)相關(guān)基因和106個還沒有任何功能或同源注釋的基因。調(diào)節(jié)防衛(wèi)反應(yīng)的169個基因可以被多種處理或防衛(wèi)通路調(diào)控。在SA和MeJA處理后，一些基因表現(xiàn)為共誘導(dǎo)或共抑制，可見在植物的防衛(wèi)反應(yīng)中，不同的防衛(wèi)信號通路水楊酸和茉莉酸通路存在相互或協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)網(wǎng)路［9］。Rayapuram等通過分析煙草在受到動物傷害時JA和SA的水平來研究生物脅迫對防御系統(tǒng)的影響。研究表明，當(dāng)用SA處理煙草時，Na NPR1基因的轉(zhuǎn)錄水平會升高，而當(dāng)將Na NPR1基因沉默，植物就更易受到動物和病菌傷害的影響。通過生物芯片分析表明，在NPR1基因沉默的植物中，一些JA誘導(dǎo)基因下調(diào)，而一些SA合成基因上調(diào)。所以，可以推斷，當(dāng)植物受到動物傷害時，NPR1基因調(diào)控SA的產(chǎn)生量，進而引起JA介導(dǎo)的防御反應(yīng)，在NPR1基因沉默的植物中，SA產(chǎn)量增加，JA相關(guān)防御減弱使得植物更易受到動物的影響［10］。

在所有谷類作物中，珍珠粟是最耐熱和干旱的植物。即使在高溫和干旱環(huán)境下，珍珠粟相對于玉米，甚至高粱，仍會有較高產(chǎn)量［11］。雖然珍珠粟相比玉米與高粱具有更好的抗病害能力，但其產(chǎn)量也會受到病害的影響，其中一種病害就是由寡紋柄銹菌（Puccinia substriata，P.substriata）導(dǎo)致的銹病。本文通過分析珍珠粟在受到SA處理后，與寡紋柄銹菌下共表達的基因，來分析SA處理對生物脅迫的影響，為防治病菌提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本文所分析的基因芯片數(shù)據(jù)來源于NCBI中的 GEO數(shù)據(jù)庫（http：／／www.ncbi.nl m.nih.gov／geo／），序列號為 GSE13481。該c DNA 文庫由Van den Ber g等人創(chuàng)建［12］，是珍珠粟中對各種防御響應(yīng)的基因芯片序列。在1920個c DNA中，有355個c DNA在脅迫響應(yīng)中進行差異表達。Van den Berg等將其中135個在SA和MeJA處理下差異表達最顯著的c DNA挑選出來進行測序，得到的序列信息在NCBI上比對，得到66個非重復(fù)序列。這些c DNA序列儲存在GENBANK db EST數(shù)據(jù)庫中，序號為GD180624～GD180688。

1.2 試驗方法

1.2.1 聚類分析與共表達分析

將Van den Ber g等比對到的各物種GI號，間接比對到擬南芥的基因上，對其中的所有基因進行聚類分析，采用Spear man秩相關(guān)分析，質(zhì)心連鎖的聚類方法得到表達數(shù)據(jù)的聚類。同樣利用Spear man秩相關(guān)，檢驗各個基因間的相關(guān)系數(shù)（p＜0.05）構(gòu)成相關(guān)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.2 差異基因分析與功能注釋

利用超幾何分布對上調(diào)和下調(diào)的差異基因進行功能注釋分析，F(xiàn)isher精確概率檢驗計算P值，Benjamini－Yekutieli方法對多重檢驗結(jié)果進行校正，篩選其中表達差異2倍及以上，并且FDR＜0.05富集的Go Terms。

2 結(jié)果

2.1 聚類及共表達分析

水楊酸和寡紋柄銹菌處理后，對珍珠粟中差異表達2倍或以上的c DNA進行層次聚類分析（圖1），結(jié)果表明，相較于不同處理下的樣本表達概型，每種處理內(nèi)部的時序樣本表達概型之間更加相近。

圖1 水楊酸和寡紋柄銹菌處理后，珍珠粟中c DNA差異表達2倍或以上的層次聚類分析Fig.1 Hierarchical cluster of sequenced pearl millet c DNAswitht wofold or more changes in transcript abundance in response to SA or Puccinia substriata treat ment

同樣利用Spear man秩相關(guān)檢驗各個基因間的相關(guān)系數(shù)（p＜0.05）構(gòu)成相關(guān)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖（圖2）。由 圖 可 見 GAPC1，LOS2，ALF5，HSP70，RD22等基因有顯著的共表達關(guān)系，他們共同參與了化學(xué)刺激響應(yīng)和脅迫響應(yīng)等多種生物過程。AT 1G54290、AT 5G60390、ALAAT 2、AT 3G14770、LOS2、GAPC1等基因均與其他多個基因有共表達關(guān)系，預(yù)示著這些基因在植株各種生物過程中可能發(fā)揮重要作用。

2.2 差異表達基因分析

由表1可以看出，經(jīng)SA處理過的植株，其體內(nèi)多個與脅迫相關(guān)的基因表達量顯著上調(diào)，這些基因有 HSP70、ALF5、AT1G66100、PPC2、PGK、LOS2、 GAPC1、 AT4G24690、 AT1G54290、AT3G14770、RD22和NPQ4。

表1 差異基因列表（相對于t＝0 h的差異倍數(shù)（比值））Table 1 Differential expression genes in pearl millet（relative to t＝0 h）

圖2 共表達網(wǎng)絡(luò)分析圖Fig.2 Co－expression net wor k analysis

2.3 差異基因的功能注釋

利用超幾何分布對上調(diào)和下調(diào)的差異基因進行功能注釋分析，F(xiàn)isher精確概率檢驗計算P值，并用Benjamini－Yekutieli方法［13］對多重檢驗結(jié)果進行校正，篩選其中表達差異2倍及以上，并且FDR＜0.05富集的GoTerms（表2、表3）。

表2 上調(diào)基因集在GO在生物學(xué)過程中的注釋分析（前10個）Table 2 GO Ter ms enrich ment analysis in biological process with the up－regulated genes（top 10）

表3 下調(diào)基因集在GO在生物學(xué)過程中的注釋分析（前10個）Table 3 GO Ter ms enrich ment analysis in biological process with the down－regulated genes（top 10）

3 結(jié)論與討論

病原體在宿主植株上的是否能成功發(fā)揮毒性體現(xiàn)在病原體逃避或者操作宿主反應(yīng)的能力上［11～14］。SA預(yù)處理提高了植株對銹病侵染的耐受性，說明SA誘導(dǎo)出的防御反應(yīng)相關(guān)基因表達在植株對銹病侵染的抵抗過程中發(fā)揮著重要的作用。我們推測P.substriata病毒在侵染的過程中可以成功抑制宿主體內(nèi)SA誘導(dǎo)的防御反應(yīng)。我們觀察到可能的SA介導(dǎo)的防御關(guān)鍵基因包括HSP70、AT3G25570、ALF、AT1G66100、PPC2、PGK、ALAAT2、LOS2、GAPC1、AT4G24690、AT5G60390、AT1G54290、AT3G14770、RD22 和NPQ4。這些基因在病毒侵染過程中被抑制或者沒有被誘導(dǎo)。它們很可能成為病原體在植株中產(chǎn)生毒性效應(yīng)的可操作的靶標(biāo)，這與以往研究描述一致［15］。

SA預(yù)處理過的植株誘導(dǎo)出若干差異表達基因在多種應(yīng)急響應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用，包括鹽脅迫響應(yīng)、溫度刺激響應(yīng)、滲透脅迫響應(yīng)、化學(xué)刺激響應(yīng)、干旱響應(yīng)、毒素響應(yīng)、脫落酸響應(yīng)、病毒響應(yīng)、有機質(zhì)響應(yīng)等，說明眾多應(yīng)激響應(yīng)有部分類似的機制。其中共同高頻出現(xiàn)的基因包括：LOS2、GAPC1、NPQ4、ALF5、AT1G66100、HSP70 和RD22。這些關(guān)鍵基因多分布于細(xì)胞膜、細(xì)胞外周和胞間部分。病毒介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)證明，HSP70基因是植物防御信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要成分［16］。LOS2是一個響應(yīng)冷脅迫的基因，在植物抗凍響應(yīng)中具有重要的作用［17］。RD22是一個脫水應(yīng)答基因，其表達受脫水、高鹽、ABA誘導(dǎo)，但不受冷、熱脅迫誘導(dǎo)［18］。

在差異表達的基因中，ADR1－L 1、AVP1、AT4G02610、AT1G62290、RPT2A、T15 M6、HRE1、BGLU11、AT3G27210、PR1、UGT 74F1 和SCPL 6都不同程度的在P.substriata病毒接種植株中的表達量高于SA預(yù)處理的植株。尤其是若干基因看似由SA介導(dǎo)，但卻在P.substriata病毒接種植株中表現(xiàn)出極高的表達量，例如：編碼病程相關(guān)蛋白的基因PR1（表達量上調(diào)接近50倍），編碼UDP糖基轉(zhuǎn)移酶74F1的UGT 74F1基因（表達量上調(diào)70多倍）及編碼絲氨酸羧基肽酶類6的SCPL6基因（表達量上調(diào)近92倍）。

［1］Gold man J J，Hanna W W，F(xiàn)leming G，etal.Fertile transgenic pearl millet［Pennisetu m gl aucu m （L.）R.Br.］plants recovered through micr opr ojectile bo mbar d ment and phosphinot hricin selection of apical meristem－，inflorescence－，and i mmature embryo－derived embryo－genic tissues［J］.Plant cell reports，2003，21（10）：999－1009.

［2］Guy C L，Niemi K L，Brambl R.Altered gene expression during cold accli mation of spinach［J］.Procedings of the national academy of sciences of the USA，1985，82（11）：3673－3677.

［3］Yamaguchi－Shinozaki K，Shinozaki K.Characterization of the expression of a desiccation－responsive r d29 gene of Ar abidopsis thaliana and analysis of its promoter in transgenic plants［J］.Molecular and general genetics，1993，236（2－3）：331－340.

［4］Liu Q，Kasuga M，Sakuma Y，etal.Two transcription factors，DREB1 and DREB2，with an EREBP／AP2 DNA binding domain separate t wo cell ular signal transduction pathways in drought－and low－temperature－responsive gene expression，respectively，in Arabidopsis［J］.Plant cell，1998，10（8）：1391－1406.

［5］Thomashow M F.Plant cold accli mation：Freezing tolerance genes and regulatory mechanisms［J］.Plant physiology and plant molecular biology，1999，50：571－599.

［6］Kreps J A，Wu Y J，Chang H S，etal.Transcript o me changes for Arabidopsis in response to salt，osmotic，and cold stress［J］.Plant physiol，2002，130（4）：2129－2141.

［7］Chen W，Pr ovart N J，Glazebrook J，etal.Expression profile matrix of Ar abidopsis transcription factor genes suggests their putative f unctions in response to envir on mental stresses［J］.Plant Cell，2002，14（3）：559－574.

［8］Cheong Y H，Chang H S，Gupta R，etal.Transcriptional pr ofiling reveals novel interactions bet ween wounding，pat hogen，abiotic stress，and hor monal responses in Arabidopsis［J］.Plant Physiol，2002，129（2）：661－677.

［9］Schenk P M，Kazan K，Wilson I，etal.Coordinated plant defense responses in Ar abidopsis revealed by microarray analysis［J］.Procedings of the national academy of sciences of the USA，2000，97（21）：11655－11660.

［10］Rayapura m C，Bald win I T.Increased SA in NPR1－silenced plants antagonizes JA and JA－dependent direct and indirect defenses in her bivore－attacked Nicotiana attenuata in nature［J］.Plant jour nal，2007，52（4）：700－715.

［11］Cra mpton B G，Hein I，Berger D K.Salicylic acid confers resistance to a biotr ophic r ust pat hogen，Puccinia substriata，in pearl millet（Pennisetu m gl aucu m）［J］.Molecular plant pat hology，2009，10（2）：291－304.

［12］N van den Berg，B G Cra mpton，I Hein，etal.High－t hr oughput screening of suppression subtractive hybridization c DNA libraries using DNA microarray analysis［J］.Biotechniques，2004，37（5）：818－824.

［13］Benja mini Y，Yekutieli D.The control of the false discovery rate in multiple testing under dependency［J］.The annals of statistics，2001，29：1165－1188.

［14］Jones J D G，Dangl J L.The plant i mmune system［J］.Nat ure，2006，444（7117）：323－329.

［15］Tr u man W，Bennett M H，Kubigsteltig I，etal.Arabidopsis systemic i mmunity uses conser ved defense signaling pat h ways and is mediated by jas monates［J］.Pr oceedings of the national academy of sciences，2007，104（3）：1075－1080.

［16］Kanzaki H，Saitoh H，Ito A，etal.Cytosolic HSP90 and HSP70 are essential components of INF1－mediated hypersensitive response and non－h(huán)ost resistance to Pseudo monas cichorii in Nicotiana bentha miana［J］.Molecular plant pat hology，2003，4（5）：383－391.

［17］Lee H，Guo Y，Ohta M，etal.LOS2，a genetic locus required for cold－responsive gene transcription encodes a bi－f unctional enolase［J］.The EMBO jour nal，2002，21：2692－2702.

［18］Kasuga M，Liu Q，Miura S，etal.Impr oving plant dr ought，salt，and freezing tolerance by gene transfer of a single stress－inducible transcription factor［J］.Nat ure a merica inc，1999，17：287－291.