不同破壁方法對(duì)細(xì)菌蛋氨酸產(chǎn)量的影響

賈翠英，張玉輝，魏 娟

（河南科技學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003）

不同破壁方法對(duì)細(xì)菌蛋氨酸產(chǎn)量的影響

賈翠英，張玉輝，魏 娟

（河南科技學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003）

為考察不同破壁方法對(duì)細(xì)菌蛋氨酸產(chǎn)量的影響，分別采用堿解、溶菌酶、超聲波以及堿解與超聲波、溶菌酶與超聲波之間的復(fù)合破壁方法對(duì)一株產(chǎn)蛋氨酸細(xì)菌進(jìn)行細(xì)胞破壁，并用氯銨-T法分別測(cè)定胞外發(fā)酵液和各種破壁條件下胞內(nèi)蛋氨酸的含量。結(jié)果表明：發(fā)酵液中蛋氨酸為0.952mg/L，經(jīng)堿破壁、溶菌酶破壁、超聲波破壁、堿與超聲破復(fù)合破壁、溶菌酶與超聲波復(fù)合破壁后，蛋氨酸總產(chǎn)量分別提高了10.9%、12.0%、18.3%、19.6%、22.2%，上述結(jié)果表明細(xì)菌細(xì)胞破壁后，蛋氨酸產(chǎn)量明顯提高，且不同破壁方法提高程度不同，復(fù)合破壁方法與單一破壁方法相比，蛋氨酸產(chǎn)量提高效果顯著。

蛋氨酸，細(xì)胞破壁，蛋氨酸產(chǎn)量

蛋氨酸（Methionine，Met）分子量149.21，白色薄片狀結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，有特殊氣味，味微甜，熔點(diǎn)280～281℃（分解），對(duì)強(qiáng)酸不穩(wěn)定，可導(dǎo)致脫甲基作用，溶于水（3.3g/100m L，25℃），稀酸和稀堿，極難溶于乙醇，幾乎不溶于乙醚[1]。蛋氨酸是維持人和動(dòng)物正常發(fā)育所必需的一種限制性氨基酸，在飼料工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)、保健業(yè)及食品工業(yè)中具有廣泛的應(yīng)用[2-5]。近年來國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)對(duì)蛋氨酸的需求逐年增長(zhǎng)[6]，成為需求量增長(zhǎng)最快的氨基酸品種之一。然而我國(guó)目前還未實(shí)現(xiàn)蛋氨酸工業(yè)化生產(chǎn)，尤其是飼料用蛋氨酸主要依賴進(jìn)口。國(guó)際上蛋氨酸的生產(chǎn)主要采用化學(xué)合成法，近年來又開發(fā)出固-液相轉(zhuǎn)移催化法[7]。多數(shù)廠家采用化學(xué)合成法，這種方法存在著生產(chǎn)成本高、收率低、污染環(huán)境嚴(yán)重等缺點(diǎn)，導(dǎo)致許多以精氨酸為原料的產(chǎn)品價(jià)格居高不下，給人們的生活帶來不便。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)蛋氨酸是一種理想的選擇。然而，蛋氨酸作為微生物發(fā)酵后的產(chǎn)物，除了發(fā)酵液中存在，在發(fā)酵后菌體內(nèi)也有大量殘留，因此經(jīng)生物發(fā)酵后能否最大限度地提高蛋氨酸產(chǎn)量是一個(gè)比較重要的問題。將發(fā)酵后菌體離心并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破壁可提高蛋氨酸的總產(chǎn)量。目前，細(xì)胞破碎技術(shù)主要包括機(jī)械破碎、物理破碎、化學(xué)破碎和酶法破碎以及多種方法的聯(lián)合使用，機(jī)械破碎又包括高壓勻漿破碎、研磨破碎等，物理破碎包括反復(fù)凍融法、超聲波破碎法等，化學(xué)破碎包括酸、堿破碎以及有機(jī)溶劑破碎等[8-11]。因此，本實(shí)驗(yàn)考察并比較了不同細(xì)胞破壁方法對(duì)細(xì)胞蛋氨酸產(chǎn)量的影響，通過快速靈敏的蛋氨酸[12-14]測(cè)定方法來檢測(cè)菌株內(nèi)殘留的蛋氨酸的量，以便于有效提取胞內(nèi)的蛋氨酸，對(duì)增加蛋氨酸的產(chǎn)量具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

本實(shí)驗(yàn)所用的菌株 河南科技學(xué)院分離工程教研室提供；EDTA（0.5mg/m L） Augus，由0.1mol/L的pH8.0的磷酸鹽緩沖液配制，冷藏保存；氯銨-T（0.0lmol/L） Sigma-A ldrich，冷藏保存；5，5’一二硫代雙硝基苯甲酸（DTNB，4mg/m L） Sigma，由0.5mg/m L的EDTA溶液配制冷藏保存；焦碳酸二乙酯（DEPC）Sigma，冷藏保存；硼氫化鈉 北京化學(xué)試劑公司，分析純，室溫保存；NTB溶液（新鮮配制） DTNB貯液用少量硼氫化鈉還原，鹽酸溶液中和過量硼氫化鈉，直至無氣體產(chǎn)生，磷酸鹽緩沖液5～10m L調(diào)節(jié)pH至8.0；0.1mg/m L蛋氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 由0.5mg/m L EDTA溶液配制，冷藏保存；完全培養(yǎng)基 牛肉膏0.4%、蛋白胨1%、NaCl 0.5%，固體培養(yǎng)基另加1.5%瓊脂（pH 7.0～7.2）；種子培養(yǎng)基 葡萄糖5%、尿素0.3%、K2HPO40.06%、KH2PO40.10%、MgSO4·7H2O 0.05%、蛋白胨3%、酵母浸膏0.5%，pH 7.0～7.2；發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖4%、（NH4）2SO40.4%、尿素0.1%、KH2PO40.05%、MgSO4·7H2O 0.05%、FeSO4·7H2O 0.02%、MnSO4·H2O 0.02%、生物素8μg/100m L、硫胺素200μg/100m L（分消），固體培養(yǎng)基另加2%瓊脂（pH 7.0～7.2）。

10～100μL吉爾森移液槍 法國(guó)GILSON；S-450D超聲波破碎儀 美國(guó)BRANSON公司；JA1003電子天平 上海電子天平廠；HHB11電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津市三水科學(xué)儀器有限公司；HZ250L型恒溫?fù)u床 武漢瑞華儀器設(shè)備有限公司；潔凈工作臺(tái) 素凈集團(tuán)安泰公司；80-1離心沉淀器 上海手術(shù)器械廠；YXQLS-SH全自動(dòng)立式電熱壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；722N可見分光光度計(jì) 上海精美科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛋氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取0.1mg/m L的蛋氨酸標(biāo)準(zhǔn)液0、0.075、0.10、0.15、0.20、0.25m L于試管中，加EDTA溶液定容至1.0m L，同時(shí)均加入10μL DEPC作為掩蔽劑，室溫過夜；分別加入3.0m L磷酸鹽緩沖液和0.03m L的氯銨-T溶液，室溫反應(yīng)40m in后，再加入0.2m L NTB溶液，以試劑空白為對(duì)照，于412nm下測(cè)其OD值。繪制OD-蛋氨酸含量（μg）標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 菌種活化 將購(gòu)買的出發(fā)菌株接種于固體斜面培養(yǎng)基中，30℃恒溫培養(yǎng)48h，挑取一環(huán)接種于盛有30m L種子液體培養(yǎng)基的250m L三角瓶中，180r/min，30℃恒溫振蕩培養(yǎng)16～18h。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng) 將種子培養(yǎng)液按10%的接種量接入裝有50m L發(fā)酵液體培養(yǎng)基的250m L三角瓶中，30℃180r/m in搖床培養(yǎng)60h。

1.2.4 蛋氨酸含量測(cè)定 取發(fā)酵液10m L于離心管中，3500r/m in，離心15m in，取上清稀釋；將離心后的菌體收集，進(jìn)行破壁處理，離心取上清稀釋；分別向上述不同上清稀釋液中，加EDTA溶液定容至1.0m L，同時(shí)均加入1m L DEPC作為掩蔽劑，室溫過夜；加入3.0m L磷酸鹽緩沖液和0.03m L的氯銨-T溶液，室溫反應(yīng)40min后，再加入0.2m L NTB溶液，以試劑空白為對(duì)照，于412nm下分別測(cè)其OD值，計(jì)算蛋氨酸含量。

1.2.5 各種細(xì)胞破壁條件的確定

1.2.5.1 堿解破壁條件的確定 將10m L發(fā)酵液3500r/min離心15min，收集菌體，用緩沖液洗滌2～3次，再分別加入2m L 4mol/L NaOH混勻，分別在20、40、60℃水浴加熱條件下對(duì)每種濃度的氫氧化鈉分別加熱1、2、3h，每組做三個(gè)重復(fù)；水浴加熱結(jié)束分別加入HCl調(diào)pH至8.0，再加入緩沖液至10m L，5000r/min離心10m in，取上清再稀釋2倍，進(jìn)行蛋氨酸含量測(cè)定。

1.2.5.2 溶菌酶破壁條件確定 將10m L發(fā)酵液3500r/m in離心15m in，收集菌體，用緩沖液洗滌2～3次，分別加入10μg/m L溶菌酶2、4、6m L，用緩沖液定容到10m L，混勻，各濃度下分別30℃水浴反應(yīng)1、2、3h，重復(fù)三次；反應(yīng)結(jié)束后，5000r/min離心10min，取上清再稀釋2倍，進(jìn)行蛋氨酸含量測(cè)定。

1.2.5.3 超聲波破壁條件確定 將10m L發(fā)酵液3500r/m in離心15m in，收集菌體，用緩沖液洗滌2～3次，再用緩沖液定容到10m L，分別在15、20、25kHz的頻率下以4s的破停間隔分別破壁10、15、20m in，重復(fù)三次。超聲結(jié)束后，5000r/m in離心10m in，取上清再稀釋2倍，進(jìn)行蛋氨酸含量測(cè)定。

1.2.5.4 堿解和超聲波復(fù)合破壁 參考?jí)A解破碎最佳條件和超聲波破碎的最佳條件，將細(xì)胞進(jìn)行堿解和超聲波復(fù)合破壁，破碎后的菌懸液經(jīng)適當(dāng)稀釋后，測(cè)定蛋氨酸含量。

1.2.5.5 溶菌酶和超聲波復(fù)合破壁 參考溶菌酶破碎最佳條件和超聲波破碎的最佳條件，將細(xì)胞進(jìn)行溶菌酶解和超聲波復(fù)合破壁，破碎后的菌懸液經(jīng)適當(dāng)稀釋后，測(cè)定蛋氨酸含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

圖1 蛋氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve ofmethionine

圖1顯示了蛋氨酸含量與吸光值OD412之間的關(guān)系，由圖可知，蛋氨酸含量在7.5～25μg/4.24m L與吸光值OD412存在線性關(guān)系，蛋氨酸的計(jì)算公式為x=（y+ 0.10873）/0.04105，相關(guān)系數(shù)R2=0.99833，因此，所作標(biāo)準(zhǔn)曲線能夠用于蛋氨酸含量的測(cè)定與計(jì)算。由蛋氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程，以及蛋氨酸含量與吸光值OD412之間的關(guān)系，可測(cè)得并計(jì)算出原發(fā)酵液中蛋氨酸含量為0.952mg/L，即細(xì)胞破碎前發(fā)酵液中蛋氨酸含量。

2.2 各種破壁方法最佳條件確定

2.2.1 堿解破壁最佳條件確定 菌體經(jīng)1.2.5.1堿解破壁后，樣液于波長(zhǎng)412nm處測(cè)定測(cè)得的OD值如表1所示。

表1 堿解破壁條件的確定Table 1 Determination of cellwall disrupting condition with alkalinemethod

由表1可知，升高溫度有利于胞內(nèi)蛋氨酸的釋放，但是溫度的繼續(xù)升高可能破壞了蛋氨酸的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，使得所測(cè)得的蛋氨酸含量降低，此外，相同破碎溫度下，破碎時(shí)間的延長(zhǎng)有利于胞內(nèi)蛋氨酸釋放，但過長(zhǎng)時(shí)間也會(huì)導(dǎo)致蛋氨酸含量降低。從表1中的數(shù)據(jù)可知，堿解破壁的最佳條件是40℃水浴1h，在此條件下破壁可獲得蛋氨酸產(chǎn)量的OD412平均值為0.142，計(jì)算可得蛋氨酸含量為0.104mg/L，即細(xì)胞經(jīng)40℃水浴1h的堿解破壁后，與細(xì)胞破碎前相比，蛋氨酸總產(chǎn)量增加了10.9%。

2.2.2 溶菌酶破壁最佳條件確定 菌體經(jīng)1.2.5.2溶菌酶破壁后，樣液于波長(zhǎng)412nm處測(cè)定測(cè)得的OD值如表2所示。

表2 溶菌酶最佳破壁條件確定Table 2 Determination of cellwall disrupting condition with lysozymemethod

由表2可知，所用溶菌酶濃度越大越有利于胞內(nèi)蛋氨酸的釋放。另外，以相同溶菌酶濃度進(jìn)行細(xì)胞破碎，破碎時(shí)間的延長(zhǎng)有利于胞內(nèi)蛋氨酸釋放，但當(dāng)溶菌酶濃度高于4μg/m L時(shí)，延長(zhǎng)溶菌時(shí)間會(huì)導(dǎo)致蛋氨酸含量降低。原因可能是低濃度溶菌酶對(duì)細(xì)胞破碎程度小，但通過延長(zhǎng)破碎可提高破碎效果；高濃度溶菌酶對(duì)細(xì)胞破碎程度大，如繼續(xù)延長(zhǎng)破碎時(shí)間可能對(duì)蛋氨酸也造成一定破壞，從而影響檢測(cè)結(jié)果。從表2中的數(shù)據(jù)可知，溶菌酶破壁的最佳條件是4μg/m L溶菌酶30℃水浴2h，在此條件下破壁可獲得蛋氨酸產(chǎn)量的OD412平均值為0.166，計(jì)算可得蛋氨酸含量為0.114mg/L，即經(jīng)溶菌酶30℃水浴2h破壁后，與細(xì)胞破碎前相比蛋氨酸總產(chǎn)量增加了11.9%。

2.2.3 超聲波破壁最佳條件確定 菌體經(jīng)1.2.5.3超聲波破壁后，樣液于波長(zhǎng)412nm處測(cè)定測(cè)得的OD值如表3所示。

由表3可知，所用超聲波的頻率越大越有利于胞內(nèi)蛋氨酸的釋放，但是超聲時(shí)間也影響到胞內(nèi)蛋氨酸的釋放，當(dāng)超聲時(shí)間為10～15m in時(shí)，隨著超聲波頻率增大，細(xì)胞破碎效果越明顯，即越有利于胞內(nèi)蛋氨酸的釋放。但是當(dāng)超聲時(shí)間為20min時(shí)，超聲波超聲頻率的增大反而降低了蛋氨酸含量，原因可能是高頻率長(zhǎng)時(shí)間超聲破碎，會(huì)產(chǎn)生相當(dāng)?shù)臒崃?，造成?duì)蛋氨酸的破壞而影響檢測(cè)結(jié)果。從表3中的數(shù)據(jù)可知，超聲波破碎最佳條件是20kHz超聲20min，在此條件下破壁可獲得蛋氨酸產(chǎn)量的OD412平均值為0.312，計(jì)算可得蛋氨酸含量為0.174mg/L，即經(jīng)溶菌酶30℃水浴2h破壁后，與細(xì)胞破碎前蛋氨酸總產(chǎn)量增加了18.3%。

2.2.4 堿解與超聲波復(fù)合破壁 菌體經(jīng)1.2.5.4堿解與超聲波復(fù)合破壁后，樣液于波長(zhǎng)412nm處測(cè)定測(cè)得的OD值如表4所示。

表3 超聲波最佳破壁條件確定Table 3 Determination of cellwall disrupting condition with ultrasonicmethod

表4 堿解與超聲波復(fù)合破壁的結(jié)果Table 4 Results of cellwall disruption with alkali-ultrosonic complexed method

從表4中的數(shù)據(jù)分析可知，經(jīng)堿解與超聲波復(fù)合破壁后，樣液中可獲得OD412平均值為0.343的蛋氨酸產(chǎn)量，計(jì)算可得蛋氨酸含量為0.187mg/L，即經(jīng)堿解與超聲波復(fù)合破壁后，與細(xì)胞破碎前蛋氨酸總產(chǎn)量增加了19.6%，可見復(fù)合破碎更有利于胞內(nèi)蛋氨酸的釋放。

2.2.5 溶菌酶與超聲波復(fù)合破壁 菌體經(jīng)1.2.5.5溶菌酶與超聲波復(fù)合破壁后，樣液于波長(zhǎng)412nm處測(cè)定測(cè)得的OD值如表5所示。

表5 溶菌酶與超聲波復(fù)合破壁的結(jié)果Table 5 Results of cellwall disruptingwith lysozyme-ultrosonic complexed method

從表5中的數(shù)據(jù)分析可知，經(jīng)溶菌酶與超聲波復(fù)合破壁后，樣液中可獲得OD412平均值為0.401的蛋氨酸產(chǎn)量，計(jì)算可得蛋氨酸含量為0.211mg/L，即經(jīng)溶菌酶30℃水浴2h破壁后，與細(xì)胞破碎前蛋氨酸總產(chǎn)量增加了22.2%。

2.3 不同破壁方法的比較

通過以上五種破壁方法破壁后所測(cè)得的蛋氨酸總產(chǎn)量高低進(jìn)行比較，結(jié)果如表6所示。

如表6分析可知，溶菌酶與超聲波復(fù)合破壁、堿解與超聲波復(fù)合破壁、超聲波破壁這三種方法對(duì)蛋氨酸總產(chǎn)量的提高比例為18.3%～22.2%左右，且表6還顯示復(fù)合破壁方法對(duì)蛋氨酸產(chǎn)量的提高比例顯著優(yōu)越于單一破壁方法。

表6 不同破壁方法細(xì)胞蛋氨酸總產(chǎn)量的比較結(jié)果Table 6 Comparison results of yield ofmethionine after cell wall being disrupted with differentmethods

3 結(jié)論

細(xì)胞的破壁方法有很多種，主要分為物理破碎、化學(xué)破碎、生物破碎三種，物理破碎中的高壓勻漿法、珠磨法、反復(fù)凍融法、干燥法等對(duì)設(shè)備資源的要求較高，故選用了較常用的超聲波破碎法?；瘜W(xué)破碎法中，表面活性劑法、抗生素法等對(duì)菌種類型、產(chǎn)物類型要求較嚴(yán)格，且成本較高，又因?yàn)榈鞍彼嵩谒嵝詶l件下不穩(wěn)定，因此，本實(shí)驗(yàn)選用了NaOH破壁較為簡(jiǎn)單且廉價(jià)的方法進(jìn)行破壁。生物破壁方法主要是溶菌酶破壁，本實(shí)驗(yàn)也選用了此方法。為了提高細(xì)胞破壁率，本實(shí)驗(yàn)先進(jìn)行單一方法破壁，然后進(jìn)行復(fù)合破壁實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明復(fù)合破壁效果較好。

考慮到應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐中的生產(chǎn)成本、生產(chǎn)工藝等問題如溶菌酶價(jià)格比較高，復(fù)合破壁比較復(fù)雜，堿解破壁已造成污染，建議選用超聲波破壁方法。目前，蛋氨酸生產(chǎn)成本較高，產(chǎn)量較低，導(dǎo)致許多以蛋氨酸為原料的產(chǎn)品價(jià)格居高不下，給人們的生活帶來不便。從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來看，蛋氨酸生產(chǎn)株在完成發(fā)酵時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的蛋氨酸含量也相當(dāng)可觀，研發(fā)出較為可行的方法將細(xì)胞內(nèi)的蛋氨酸提取出來，必將為提高蛋氨酸的生產(chǎn)效率做出貢獻(xiàn)。

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Effect of different disintegrated cellwallmethods on methionine yield of bacterium

JIA Cui-ying，ZHANG Yu-hui，WEI Juan

（School of Life Science and Technology，Henan Institute of Science and Technology，Xinxiang 453003，China）

Differentmethods inc lud ing alkali-hyd ro，lysozyme，ultrasonic method，alkali-ultrasonic synergic and lysozyme-ultrasonic synergic method were respectively used in order to investigate the effect of d ifferent cell walld isrup tingmethods onmethionine yield ofbacterium.Ammonium chloride-Tmethod was used to respectively determ ine the yield ofmethionine in fermentation b roth and in cell.The results showed that in original fermentation b roth there was 0.952mg/L ofmethionine.And after the cellwall being d isrup ted by d ifferentmethods such as alkali-hyd ro，lysozyme，ultrasonic method，alkali-ultrasonic method and lysozyme-ultrasonic method，the total yield ofmethionine enhanced 10.9%，12.0%，18.3%，19.6%and 22.2%respec tively.Allof above results im p roved further that d ifferentmethods disp layed different efficiency for enhancing methionine yield，especially multip le and synergic d isrup ting method were better than sing le disrup ting method.

methionine；cellwalldisrup ting methods；yield ofmethionine

TS201.2+4

B

1002-0306（2012）09-0325-04

2011－08－01

賈翠英（1974－），女，博士，講師，研究方向：生物化工與生物制藥。

河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目（082102220001）。