酸水解冬蟲夏草胞外多糖的分子質(zhì)量變化及動力學(xué)研究

閆景坤，吳建勇，金 蓓，崔海英

(1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.香港理工大學(xué)應(yīng)用生物與化學(xué)科技系，香港；3.湛江師范學(xué)院化學(xué)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣東 湛江 524048)

酸水解冬蟲夏草胞外多糖的分子質(zhì)量變化及動力學(xué)研究

閆景坤1，吳建勇2，金 蓓3，崔海英1

(1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.香港理工大學(xué)應(yīng)用生物與化學(xué)科技系，香港；3.湛江師范學(xué)院化學(xué)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣東 湛江 524048)

以冬蟲夏草胞外多糖為研究對象，通過凝膠滲透色譜分析酸水解多糖的分子質(zhì)量、分子質(zhì)量降解率(MWDR)和多分散指數(shù)(MW/Mn)的變化規(guī)律，并在此基礎(chǔ)上探討酸水解動力學(xué)。結(jié)果表明：酸水解可得到高分子質(zhì)量和低分子質(zhì)量兩個多糖組分，高分子質(zhì)量多糖組分的含量、分子質(zhì)量和MW/Mn均隨酸解時間的增加而減小，而MWDR呈線性增加趨勢。低分子質(zhì)量多糖組分含量隨酸水解時間的增加而增加，分子質(zhì)量基本維持在3.0kD；MWDR在0.5h內(nèi)呈線性增加趨勢，大于0.5h后基本維持在0.25。胞外多糖的酸水解模式為中心鏈斷裂，符合假一級反應(yīng)動力學(xué)方程，反應(yīng)速率常數(shù)為3.24×10-2min-1，遠(yuǎn)小于隨機(jī)鏈斷裂的反應(yīng)速率常數(shù)。

冬蟲夏草；胞外多糖；酸水解；分子質(zhì)量；動力學(xué)

多糖作為一類重要的生物大分子主要應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域。然而，由于天然活性多糖的分子質(zhì)量大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、水溶性差，不利于生物吸收并發(fā)揮生物活性，極大地限制了多糖的應(yīng)用和發(fā)展。通過控制降解往往可以改善多糖本身的性能功效，從而擴(kuò)大產(chǎn)品的應(yīng)用或降低產(chǎn)品的毒副作用。目前，多糖降解主要通過酶解、氧化降解、熱處理、超聲波降解以及酸水解等多種方式[1-2]。其中酸水解操作較簡便，降解速度可控，是制備低聚物的有效方法，在實驗研究中普遍采用[3-5]。

冬蟲夏草(Cordyceps sinensis(Berk.) Sace.) 是我國珍稀的藥用真菌，具有廣泛的生理活性和藥用價值，多糖為其中主要活性成分。天然冬蟲夏草多糖分子質(zhì)量大，溶解性差，難以直接應(yīng)用，因而有必要通過降解優(yōu)化其性質(zhì)。筆者前期研究[6]發(fā)現(xiàn)，酸水解可以降低冬蟲夏草胞外多糖的分子質(zhì)量和黏度，且酸水解產(chǎn)物具有較好的清除自由基和體外抗氧化活性。然而，酸水解過程中分子質(zhì)量、MW/Mn和MWDR的變化規(guī)律及酸水解動力學(xué)等方面的研究還未涉及。因此，本實驗依據(jù)前期研究，對冬蟲夏草胞外多糖酸降解產(chǎn)物的分子質(zhì)量變化規(guī)律及動力學(xué)進(jìn)行深入探討和分析，旨在為冬蟲夏草多糖的開發(fā)和應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

經(jīng)乙醇沉淀、脫蛋白、脫色和透析等方法得到的冬蟲夏草胞外多糖由香港理工大學(xué)深圳研究院吳建勇副教授課題組提供。

T-系列葡聚糖 美國Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

分析天平 日本Shimadzu公司；電熱恒溫水浴鍋上海精宏實驗設(shè)備有限公司；pH計 德國WTW實驗室；冷凍干燥機(jī) 丹麥Heto-Holten A/S公司；凝膠滲透色譜儀(Breeze V3.3工作站，1525 Binary HPLC泵、717 plus 自動進(jìn)樣器、2414Refractive Index 檢測器) 美國Waters公司；TSK-G3000凝膠滲透色譜柱(7.8mm×300mm，5μm) 日本Tosoh公司；脫氣裝置 昆山市超聲儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 多糖的酸水解

冬蟲夏草胞外多糖的酸水解按照文獻(xiàn)[2]的方法并稍作修改：胞外多糖(exopolysaccharides，EPS)為經(jīng)脫蛋白、脫色和透析處理的冬蟲夏草胞外多糖，首先將其溶解在水中配成0.1g/100mL的溶液，80℃攪拌2h，室溫放置過夜。對于多糖的酸水解，20mL已處理好的EPS溶液置于50mL具塞離心管中，通過添加一定體積的1mol/L H2SO4使其多糖溶液的pH值為1.0，封管。多糖的水解在90℃水浴中反應(yīng)0.5～10h。水解結(jié)束后，酸性多糖溶液立即置于冰浴中冷卻，1mol/L NaOH調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH值至中性，冷凍干燥得酸水解產(chǎn)物，并依次命名為EPS-A、EPS-B、EPS-C和EPS-D。

1.3.2 凝膠滲透色譜(GPC)分析

胞外多糖及酸水解產(chǎn)物的分子質(zhì)量及分子質(zhì)量分布采用高效液相凝膠滲透色譜法(HPGPC)[7-8]。凝膠滲透色譜系統(tǒng)：色譜條件：TSK-G3000凝膠滲透色譜柱(7.8mm×300mm，5μm)；SWxl 凝膠色譜柱(4mm×6mm，7μm)與TSK-G5000柱串聯(lián)；流動相：0.02mol/L磷酸二氫鉀溶液；流速0.6mL/min；柱溫35℃；進(jìn)樣量20μL。樣品處理：準(zhǔn)確稱取4.0mg多糖樣品用流動相溶液配制成質(zhì)量濃度為2mg/mL，經(jīng)過10000r/min高速離心10min后，取上清液用0.45μm微孔濾膜過濾，立刻進(jìn)樣測定其分子質(zhì)量和分子質(zhì)量分布。已知分子質(zhì)量的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品系列：5.2～668kD。葡聚糖(GPC)校正曲線方程為lgMw＝10.614－0.386VE(VE為洗脫體積)，R2＝0.9701。在線Breeze V3.3分析軟件用于分析GPC圖，得到多糖樣品的重均分子質(zhì)量(Mw)、數(shù)均分子質(zhì)量(Mn)和分子質(zhì)量分布(MWD)。

1.3 多糖酸解產(chǎn)物的分子質(zhì)量降解率(MWDR)的計算

式中：Mt和M0分別表示酸解時間為tmin和0min的分子質(zhì)量。較大值的分子質(zhì)量降解率表明酸解引起分子質(zhì)量更大的減小或發(fā)生較大的分子降解。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸水解多糖的分子質(zhì)量變化

表1 EPS及酸水解產(chǎn)物的分子質(zhì)量及分子質(zhì)量分布Table 1 Molecular weight and molecular weight distribution of EPS and its hydrolysates as determined by GPC

表1為特定反應(yīng)溫度(90℃)和pH值、不同反應(yīng)時間(0.5、1、5、10h)條件下冬蟲夏草EPS及酸水解產(chǎn)物的Mw、Mn和MWD[6]。EPS經(jīng)酸水解產(chǎn)生了兩個峰，一個是高分子質(zhì)量峰，Mw范圍26～36kD；一個是低分子質(zhì)量峰，分子質(zhì)量維持在3.0kD左右。隨酸解時間的延長，酸解產(chǎn)物的MWD總體上表現(xiàn)為高分子質(zhì)量多糖的含量逐漸減少，而低分子質(zhì)量多糖的含量逐漸增多。此外，從峰面積可以發(fā)現(xiàn)，低分子質(zhì)量多糖的相對比例在酸解30min時從0%增加到18%；當(dāng)酸解10h時，低分子質(zhì)量多糖的相對比例高達(dá)92%。這表明酸水解產(chǎn)物分子質(zhì)量＞30kD的多糖組分在酸水解過程中被降解成低分子質(zhì)量的多糖分散在酸水解體系中且為具有特定分子質(zhì)量(3.0kD)的小分子多糖組分。

2.2 分子質(zhì)量降解率

圖1 EPS在pH1.0、90℃時隨酸水解時間變化的MWDRFig.1 Measured MWDR during acid hydrolysis of EPS at pH 1.0,90 ℃

EPS酸水解后較高分子質(zhì)量組分(峰1)和較低分子質(zhì)量組分(峰2)的MWRD隨酸水解時間的變化如圖1所示，隨酸水解時間的延長，高分子質(zhì)量組分的MWRD呈線性增加；另一方面，在酸處理0.5h時，較低分子質(zhì)量組分的MWRD迅速增加，然后趨于平緩且維持在0.25左右。這表明酸水解EPS主要得到兩種酸解產(chǎn)物(峰1和峰2)，且在酸水解0.5h內(nèi)是最有效的。較低分子質(zhì)量組分的MWDR在酸水解時間大于0.5h后趨于漸近線，在較長酸水解時間內(nèi)有限的MWDR導(dǎo)致降解得到的較低分子質(zhì)量多糖組分有較低的分子質(zhì)量分布，這可能是由于MWDR隨分子質(zhì)量的減小而減小的緣故[9]。這與前人[10-11]所報道的實驗結(jié)果相類似。此外，較高分子質(zhì)量組分的MWDR隨酸水解時間呈線性增加且R2＝0.98，表明酸水解主要獲得特定分子質(zhì)量大小(3.0kD)和較窄分子質(zhì)量分布(MW/Mn約為1.0)的降解產(chǎn)物。

2.3 多分散指數(shù)(MW/Mn)的變化

EPS酸水解后較高分子質(zhì)量組分(峰1)和較低分子質(zhì)量組分(峰2)的MW/Mn隨酸水解時間的變化如圖2所示，較高分子質(zhì)量組分(峰 1)的MW/Mn隨著酸水解時間的增加而逐漸減小，MW/Mn在1～2范圍內(nèi)變化，且隨酸水解時間的變化呈較好的線性關(guān)系(y＝－0.0431x＋1.4701，R2＝0.9799)。較低分子質(zhì)量(峰2)的MW/Mn在酸水解0.5h后基本不隨酸水解時間的變化而變化，近似為一漸近線且多分散指數(shù)值接近1.0，表明酸水解EPS，得到更窄、更一致的分子質(zhì)量分布的低分子質(zhì)量多糖組分。

圖2 EPS在pH 1.0、90℃時隨酸解時間變化的MW/MnFig.2 MW/Mn during acid hydrolysis of EPS at pH 1.0, 90 ℃

Casale等[12]指出多分散性依賴于反應(yīng)機(jī)理，也就是說，多糖鏈斷裂過程中特定與隨機(jī)的斷裂是相對的。多分散指數(shù)為2，表明反應(yīng)為隨機(jī)斷裂；Mw/Mn為1～2表明接近中心鏈斷裂。

綜合表1、圖1和圖2能夠發(fā)現(xiàn)：從冬蟲夏草EPS酸水解得到的單一且具有特定分子質(zhì)量的低分子質(zhì)量酸解產(chǎn)物，可以揭示EPS的酸水解是特定的、非隨機(jī)鏈斷裂過程。此外，Mw/Mn的變化揭示鏈斷裂機(jī)理[13]：中心鏈斷裂通常使Mw/Mn減小，而隨機(jī)鏈斷裂不能改變多分散指數(shù)，這與Casale等[12]所報道的結(jié)論相一致。因此，根據(jù)實驗結(jié)果及相關(guān)文獻(xiàn)資料，中心鏈斷裂被推測為EPS酸水解過程中鏈斷裂的主要模式。

2.4 酸水解動力學(xué)研究

前期研究[14-15]表明：不同多糖的酸水解反應(yīng)基本上是隨機(jī)鏈斷裂且遵循一級反應(yīng)動力學(xué)方程：

式中：L為水解多糖鍵的總數(shù)量；k為反應(yīng)速率常數(shù)；t為降解時間。水解多糖鍵的總數(shù)量在反應(yīng)時間為t時可以表達(dá)為：

式中：Mt為多糖的平均分子質(zhì)量；m為單糖的分子質(zhì)量；Nt為多糖分子的數(shù)目。如果Mt/m遠(yuǎn)大于1，那么多糖的Mw或Mn和水解時間可用下式來表示：

式中：k或k′為反應(yīng)速率常數(shù)；t為反應(yīng)時間/min；Mt和M0分別為反應(yīng)時間為tmin和0 min時的分子質(zhì)量；m為單體分子質(zhì)量。

在pH1.0和90℃條件下酸水解得到較高分子質(zhì)量多糖組分(峰1)的MW隨時間變化的倒數(shù)關(guān)系如圖3所示。較高分子質(zhì)量多糖組分MW的倒數(shù)和酸水解時間在反應(yīng)初期 (0～0.5h)呈一定的線性關(guān)系；但是，隨酸水解時間的延長，線性關(guān)系變差且整個酸水解時間內(nèi)相關(guān)系數(shù)(R2)僅為0.9295。因此，圖3的實驗結(jié)果與方程(4)存在一定偏差。

然而，Emsley等[13]指出高聚物在降解過程中不僅存在隨機(jī)鏈斷裂而且也存在中心鏈斷裂。隨機(jī)鏈斷裂不能顯著改變分子質(zhì)量分布的位置或產(chǎn)生新的峰，隨機(jī)鏈斷裂過程中Mw的倒數(shù)和酸水解時間的關(guān)系呈線性關(guān)系，且遵循一級反應(yīng)動力學(xué)方程；而中心鏈斷裂可以改變峰的位置、產(chǎn)生新峰和加寬峰，中心鏈斷裂往往導(dǎo)致Mw倒數(shù)和降解時間的關(guān)系產(chǎn)生曲率，可以用假一級反應(yīng)動力學(xué)方程來表達(dá)1/Mw和酸水解時間的數(shù)學(xué)關(guān)系。

圖3 在pH 1.0、90℃時高分子質(zhì)量組分的MW隨酸水時間的變化圖Fig.3 Plot of 1/ MW of HMWF versus hydrolysis time at pH 1.0, 90 ℃

此外，從圖1、2及表1的實驗結(jié)果中也可以揭示，冬蟲夏草EPS的酸水解為中心鏈斷裂。因此，假一級反應(yīng)動力學(xué)方程可以用來闡釋EPS酸水解過程，即方程(4)可近似表達(dá)為：

通過方程(5)和圖3得到相關(guān)數(shù)據(jù)：EPS在90℃、pH 1.0的條件下酸水解反應(yīng)速率常數(shù)k為3.24×10-2min-1(或k′＝0.26mol/(g·min))，酸水解時間為0時多糖的重均分子質(zhì)量MW(0)為38.0kD，這與Xu Chunlin等[2]所報道的酸解速率要小得多(k＝1.51min-1)，表明多糖在酸解過程中隨機(jī)鏈斷裂的反應(yīng)速率要遠(yuǎn)大于中心鏈斷裂的反應(yīng)速率。

3 結(jié) 論

冬蟲夏草EPS酸水解的分子質(zhì)量隨酸水解時間的延長，較高分子質(zhì)量多糖組分含量和分子質(zhì)量均逐漸減小，而較低分子質(zhì)量多糖組分含量逐漸增加，且分子質(zhì)量基本維持在3.0kD。

高分子質(zhì)量多糖組分MWDR成線性增加趨勢，而較低分子質(zhì)量多糖組分MWDR在降解0.5h內(nèi)迅速增加，當(dāng)大于0.5h，MWDR不隨酸水解時間變化而變化維持在0.25左右。

高分子質(zhì)量組分的MW/Mn隨著酸水解時間的增加而逐漸減小且呈較好的線性關(guān)系，且MW/Mn在1～2變化；低分子質(zhì)量多糖組分的多分散指數(shù)在酸水解0.5h后基本保持不變。EPS的酸水解模式為中心鏈斷裂，符合假一級反應(yīng)動力學(xué)方程1/Mt≈1/M0＋kt/m，反應(yīng)速率常數(shù)為k＝3.24×10-2min-1。

[1] 曾輝. 魔芋多糖的改性及其生物活性研究[D]. 無錫: 江南大學(xué), 2006.

[2] XU Chunlin, PRANOVICH A, VAHASALO L, et al. Kinetics of acid hydrolysis of water-soluble spruceO-acetyl galacto-glucomannans[J]. J Agric Food Chem, 2008, 56(7): 2429-2435.

[3] 張燕. 白及多糖酸水解動力學(xué)研究[D]. 蘇州: 蘇州大學(xué), 2010.

[4] EINBU A, GRASDALEN H, VA。RUM K M. Kinetics of hydrolysis of chitin/chitosan oligomers in concentrated hydrochloric acid[J]. Carbohydr Res, 2007, 342(8): 1055-1062.

[5] TOMMERAAS K, MELANDER C. Kinetics of hyaluronan hydrolysis in acidic solution at various pH values[J]. Biomacromolecules, 2008, 9(6): 1535-1540.

[6] YAN Jingkun, LI Lin, WANG Zhaomei, et al. Acidic degradation and enhanced antioxidant activities of exopolysaccharides fromCordyceps sinensismycelial culture[J]. Food Chem, 2009, 117(4): 641-646.

[7] ALSOP R M, VLACHOGIANNIS G J. Determination of the molecular weight of clinical dextran by gel chromatography on TSK PW type columns[J]. J Chromatogr, 1982, 246(2): 227-240.

[8] 袁辛婭, 黃莎莎. 高效凝膠滲透色譜法測定羥乙基淀粉200/0.5氯化鈉注射液的分子質(zhì)量[J]. 華西藥學(xué)雜志, 2010, 25(1): 83-84.

[9] LORIMER J P, MASON T J, CUTHBERT T C, et al. Effect of ultrasound on the degradation of aqueous native dextran[J]. Ultrasonics Sonochem, 1995, 2(Suppl1): 55-57.

[10] WANG Wei, BO Shuqin, LI Shuqing, et al. Determination of the Mark-Houwink equation for chitosans with different degrees of deacetylation[J]. Int J Biol Macromol, 1991, 13(5): 281-285.

[11] CHEN R H, CHANG J R, SHYUR J S. Effects of ultrasonic conditions and storage in acidic conditions on changes in molar mass and polydispersity of treated chitosan[J]. Carbohydrate Research, 1997, 299(4): 287-294.

[12] CASALE A, PORTER R S. Polymer stress reaction[M]. San Diego:Academic Press, 1978.

[13] EMSLEY A M, HEYWOOD R J. Computer modeling of the degradation of linear polymers[J]. Polymer Degradation and Stability, 1995, 49(1): 145-149.

[14] SINGGH S K, JACOBSSON S P. Kinetics of acid hydrolysis of κcarrageenan as determined by molar mass (SEC-MALLS-RI), gel breaking strength, and viscosity measurements[J]. Carbohydrate Polymers,1994, 23(2): 89-103.

[15] SIMHA R. Kinetics of degradation and size distribution of long chain polymers[J]. J Appl Phys, 1941, 12(7): 569-578.

Molecular Weight Changes and Kinetics of Acid Hydrolysis of Exopolysaccharides Isolated fromCordyceps sinensis

YAN Jing-kun1，WU Jian-yong2，JIN Bei3，CUI Hai-ying1
(1. School of Food and Biological Technology, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China；2. Department of Applied and Biology and Chemical Technology, Hongkong Polytechnic University, Hongkong, China；3. School of Chemistry Science and Technology, Zhanjiang Normal University, Zhanjiang 524048, China)

In this study, exoplysaccharides were isolated fromCordyceps sinensis. Gel permeation chromatography (GPC) was used to determine molecular weight (MW) and molecular weight distribution of exopolysaccharides subjected to acid hydrolysis.The results showed that high molecular weight fraction (HMWF) and low molecular weight fraction (LMWF) of exopolysaccharides were obtained by acid hydrolysis. The content,MW and polydispersity index (PDI) of HMWF decreased with increasing reaction time, but the molecular weight degradation ratio (MWDR) showed a linear increase. On the other hand,the content of LMWF increased with increasing reaction time, with mostly a molecular weight of 3.0 kD. The MWDR of LMWF showed a linear increase within the first half an hour of reaction. Afterwards, the MWDR kept constant at about 0.25. Acid hydrolysis of exopolysaccharides was systemetic scission, which followed the pseudo first-order kinetics. The obtained value of rate constantkwas 3.24 × 10-2min-1, which was much less than that of random scission.

Cordyceps sinensis；exopolysaccharides；acid hydrolysis；molecular weight；kinetics

TS201.2

A

1002-6630(2012)11-0082-04

2011-06-10

江蘇大學(xué)?；鹳Y助項目(105DG129)；廣東省高校優(yōu)秀青年創(chuàng)新人才培育項目(LYM09100)

閆景坤(1980—)，男，講師，博士，主要從事天然活性多糖的提取、分離純化、結(jié)構(gòu)表征及化學(xué)修飾研究。E-mail：jkyan_27@163.com