槐糖脂對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌機(jī)理

胡 靜，趙小慧，朱春玉，胡風(fēng)慶，回 晶*

(遼寧大學(xué)生命科學(xué)院生物材料與生物制藥實(shí)驗(yàn)室， 遼寧 沈陽 110036)

槐糖脂對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌機(jī)理

胡 靜，趙小慧，朱春玉，胡風(fēng)慶，回 晶*

(遼寧大學(xué)生命科學(xué)院生物材料與生物制藥實(shí)驗(yàn)室， 遼寧 沈陽 110036)

通過測(cè)定槐糖脂抑制金黃色葡萄球菌最低抑菌質(zhì)量濃度和生長(zhǎng)曲線，探討槐糖脂對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌機(jī)理，同時(shí)利用掃描電鏡和透射電鏡觀察金黃色葡萄球菌顯微形態(tài)。結(jié)果表明：槐糖脂能有效抑制金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)，且抑制作用體現(xiàn)質(zhì)量濃度依賴特性，最小抑菌質(zhì)量濃度(MIC)為1.5625mg/mL。酸性和高溫條件不影響槐糖脂抑菌性，表明其具有很好的穩(wěn)定性。電鏡結(jié)果表明，槐糖脂對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制可能源于其對(duì)菌體細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的破壞作用。

槐糖脂；抑菌；最小抑菌質(zhì)量濃度；掃描電鏡；透射電鏡

槐糖脂是由球擬酵母屬(Torulopsis)和假絲酵母屬(Candida)的一些酵母菌產(chǎn)生的糖脂表面活性劑，由于其產(chǎn)量較高，具有很好的表面性能，并且低毒、生物可降解等很多優(yōu)點(diǎn)，在食品、醫(yī)藥、石油、化工和環(huán)境修復(fù)等許多領(lǐng)域中得到了不同程度的應(yīng)用[1]?，F(xiàn)代研究表明槐糖脂具有抗腫瘤、抑菌、抗炎、抗病毒[2-8]等多種生物活性。

金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)是一種可引起人類和動(dòng)物化膿感染的重要致病菌，也是造成人類食物中毒的常見致病菌之一[9]。本實(shí)驗(yàn)基于槐糖脂的相關(guān)報(bào)道[3-6]，針對(duì)常見的病原細(xì)菌和植物病原菌，對(duì)槐糖脂的抑菌作用及在不同溫度和pH值條件下槐糖脂的穩(wěn)定性進(jìn)行研究，并針對(duì)槐糖脂對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌機(jī)理進(jìn)行探究，旨在為今后槐糖脂的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、菌株與培養(yǎng)基

槐糖脂：由假絲酵母菌(Candida bombicola)利用葡萄糖為底物發(fā)酵產(chǎn)生。發(fā)酵液經(jīng)乙酸乙酯抽提后，減壓干燥，正己烷洗滌，干燥得到槐糖脂[10]。

病原細(xì)菌：大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)、單增李斯特菌(Listeria monocytogene)、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)為本實(shí)驗(yàn)室保存。

植物病原菌：番茄葉霉病菌(Fulvia fulva)、煙草赤星病菌(Alternaria alternata)、玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)、小麥赤霉病菌(Fusarium graminearum)、茄子黃萎病菌(Verticillium daliae) 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理系。

LB培養(yǎng)基：氯化鈉10g、胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、瓊脂粉15g、水1000mL，pH7.0；PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂粉20g、水1000mL，自然pH值。

1.2 儀器與設(shè)備

KYKY-EM3200數(shù)字化掃描電子顯微鏡 北京中科科儀技術(shù)發(fā)展有限責(zé)任公司；H-7650透射電鏡 日本日立公司。

1.3 菌株的培養(yǎng)條件

除特殊指出的影響因素以外，抑菌作用研究中所有條件均為菌體生長(zhǎng)的最適條件，即細(xì)菌均采用LB培養(yǎng)基，E.coli，37℃；S.aureus，37℃；P.putida，30℃；L.monocytogenes，37℃[11]；植物病原菌均采用PDA培養(yǎng)基，28℃[12]。

1.4 槐糖脂對(duì)各供試菌株的抑菌作用

利用濾紙片法[13]和液體倍比稀釋法[14]對(duì)病原微生物的抑菌作用及最小抑菌質(zhì)量濃度(MIC)進(jìn)行測(cè)定。

1.5 pH值與溫度對(duì)槐糖脂抑制金黃色葡萄球菌的影響

1.5.1 pH值

測(cè)定槐糖脂在3、4、5、6、7、8、9共7種不同pH值情況下對(duì)S.aureus的抑菌作用，以槐糖脂質(zhì)量濃度為0時(shí)作為對(duì)照。

1.5.2 溫度

測(cè)定槐糖脂分別在60、100、120℃的條件下保溫30min后對(duì)S.aureus的抑菌作用，以未處理的樣品作對(duì)照[15]。

1.6 槐糖脂對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌機(jī)理分析

1.6.1 對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線的影響

將S.aureus培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組加入3.125mg/mL槐糖脂，之后與對(duì)照組同步繼續(xù)培養(yǎng)，用分光光度計(jì)檢測(cè)槐糖脂作用后S.aureu菌量的變化，繪制生長(zhǎng)曲線[16]。

1.6.2 掃描及透射電鏡觀察

菌體制備同1.6.1節(jié)，設(shè)定藥物作用時(shí)間分別為4h和8h，取1.5mL樣品溶液，按掃描電鏡[17]及透射電鏡生物樣品制備法[18]制樣，在電鏡下觀察菌體外觀形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 槐糖脂對(duì)病原微生物的抑菌作用

從表1可以看出，槐糖脂對(duì)大腸桿菌、嗜水氣單胞菌和植物病原菌沒有抑制作用。對(duì)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、惡臭假單胞菌、單增李斯特菌具有較好的抑制作用，其中對(duì)S.aureus的抑菌作用最明顯，最低抑菌質(zhì)量濃度為1.5625mg/mL。Yoo等[4]也報(bào)道了槐糖脂能夠強(qiáng)烈抑制革蘭氏陽性菌如Bacillus、Staphylococcus和Streptococcussp.的生長(zhǎng)，但對(duì)大腸桿菌(Escherichia coli)的生長(zhǎng)沒有抑制作用。這主要是由于細(xì)菌細(xì)胞壁組成及結(jié)構(gòu)的差異，生物表面活性劑對(duì)革蘭氏陽性菌比革蘭氏陰性菌有更顯著的抑制作用[19]。

2.2 pH值和溫度對(duì)槐糖脂抑制金黃色葡萄球菌的影響

2.2.1 pH值對(duì)槐糖脂抑菌作用的影響

槐糖脂是一種可降解的生物表面活性劑，具有較高的選擇性，其表面活性受極端溫度、pH值、鹽度等條件影響小[20]。如表2所示，槐糖脂對(duì)S.aureus的MIC表現(xiàn)為：酸性及中性情況抑菌作用穩(wěn)定，堿性情況抑菌作用次之。分析其原因，可能是pH值呈堿性時(shí)改變了槐糖脂的結(jié)構(gòu)。不同類型的槐糖脂有共同的結(jié)構(gòu)特征，每個(gè)分子由親水性和疏水性兩部分構(gòu)成，親水性部分是槐糖，疏水性部分是飽和或不飽和的長(zhǎng)鏈ω-(或ω-1)羥基脂肪酸。區(qū)別在于它們所含脂肪酸碳鏈的長(zhǎng)度不同、飽和程度不同、乙?；潭炔煌约笆欠翊嬖趦?nèi)酯化作用[20]。當(dāng)pH值呈堿性時(shí)，一方面有可能與脂肪酸形成酯，另一方面有可能使原有的內(nèi)酯化作用破壞。因此，槐糖脂宜在酸性條件下使用，其抑菌pH值范圍為3～7。

表1 槐糖脂對(duì)不同病原微生物的抑菌作用Table 1 Antibacterial activity of sophorolipids against different pathogenic microorganisms mm

表2 pH值對(duì)槐糖脂抑菌活性的影響Table 2 Effect of pH on antibacterial activity of sophorolipids against Staphylococcu aureus

2.2.2 溫度對(duì)槐糖脂抑菌作用的影響

表3 溫度對(duì)槐糖脂抑菌活性的影響Table 3 Effect of temperature on antibacterial activity of sophorolipids against Staphylococcu aureus

由表3可知，槐糖脂經(jīng)不同溫度處理后接種的平板未見菌落長(zhǎng)出，且與處理前樣品的最小抑菌質(zhì)量濃度一樣。說明經(jīng)熱處理后槐糖脂仍然具有很好的抑菌效果，表明槐糖脂具有良好的耐熱性，高溫處理并不改變槐糖脂的性質(zhì)。

2.3 槐糖脂抑制金黃色葡萄球菌機(jī)理分析結(jié)果

2.3.1 槐糖脂對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的影響

圖1 槐糖脂對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線的影響Fig.1 Effect of the growth curve of sophorolipids against Staphylococcu aureus

如圖1所示，與正常S.aureus相比，當(dāng)加入槐糖脂后其生長(zhǎng)曲線明顯變化。正常S.aureus20h內(nèi)呈正常生長(zhǎng)曲線，實(shí)驗(yàn)組不能形成生長(zhǎng)曲線，且作用明顯。該對(duì)比生長(zhǎng)曲線表明，槐糖脂主要抑制了S.aureus對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌體分裂[21]。在細(xì)菌生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)加入槐糖脂，菌體數(shù)目顯著減少，并沒有達(dá)到正常的生長(zhǎng)高峰，之后進(jìn)入衰亡期，其菌量?jī)H達(dá)到了正常生長(zhǎng)菌的1/4。

2.3.2 槐糖脂對(duì)金黃色葡萄球菌超微結(jié)構(gòu)的影響

圖2 掃描和透射電鏡下金黃色葡萄球菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)Fig.2 Morphology of S. aureus examined by scanning electron microscope (SEM) and transmission electron microscope (TEM)

細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的觀察是研究抑菌機(jī)理不可缺少的直接證據(jù)。掃描電鏡下觀察，正常的S.aureus細(xì)胞表面光滑、圓潤(rùn)，呈球狀，細(xì)胞與細(xì)胞間界限分明，細(xì)胞排列呈明顯的葡萄串狀(圖2A)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[22]。經(jīng)槐糖脂處理4h后，金黃色葡萄球菌的排列變得松散，無規(guī)律，不能聚集成葡萄狀(圖2B)。經(jīng)槐糖脂處理8h后，細(xì)胞間的界限略變模糊，部分菌體發(fā)生結(jié)團(tuán)現(xiàn)象(圖2C)。細(xì)胞間的界限變模糊，說明部分菌體細(xì)胞壁已經(jīng)被破壞，細(xì)胞壁的降解物多糖類物質(zhì)在菌體細(xì)胞附近聚集，從而使細(xì)胞黏結(jié)成團(tuán)塊狀。

透射電鏡下觀察，正常的S.aureus菌體飽滿近圓形，邊緣清晰，細(xì)胞質(zhì)分布均勻(圖2D)。經(jīng)槐糖脂處理4h后的菌體，菌體有些變形，位于細(xì)胞膜區(qū)出現(xiàn)一些小的空泡(圖2E)。經(jīng)槐糖脂處理8h后，金黃色葡萄球菌細(xì)胞質(zhì)固縮，空腔增大，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)許多空腔，細(xì)胞嚴(yán)重受損(圖2F)。這表明，槐糖脂能夠?qū)е耂. aureus細(xì)胞質(zhì)固縮，形成空洞，細(xì)胞代謝無法正常進(jìn)行，最終導(dǎo)致菌體死亡。

3 結(jié) 論

抑菌實(shí)驗(yàn)表明槐糖脂對(duì)大腸桿菌、嗜水氣單胞菌和植物病原菌沒有抑制作用。對(duì)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、惡臭假單胞菌、單增李斯特菌具有較好的抑制作用，其中金黃色葡萄球菌的作用最明顯，最低抑菌質(zhì)量濃度為1.5625mg/mL。槐糖脂的最佳抑菌pH值范圍為3～7，且熱穩(wěn)定性良好。

槐糖脂對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌機(jī)理實(shí)驗(yàn)表明，槐糖脂抑菌主要是在細(xì)菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，經(jīng)槐糖脂作用后的菌體出現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)固縮、凝集成塊，出現(xiàn)空腔等現(xiàn)象，說明菌體細(xì)胞膜和細(xì)胞壁被破壞是槐糖脂抑菌的機(jī)理之一。

[1] 陳靜, 張?jiān)迫? 宋欣. 槐糖脂的生產(chǎn)及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2007, 28(8): 525-528.

[2] CHEN Jing, SONG Xin, ZHANG Hui, et al. Sophorolipid produced from the new yeast strainWickerhamiella domercqiae, induces apoptosis in H7402 human liver cancer cells[J]. Appl Microbiol Biot, 2006, 72(1): 52-59.

[3] KIM K J, YOO D S, KIM Y B, et al. Characteristics of sophorolipid as an antimicrobial agent[J]. J Microbiol Biotechn, 2002, 12(2): 235-241.

[4] YOO D S, LEE B S, KIM E K. Characteristics of microbial biosurfactant as an antifungal agent against plant pathogenic fungus[J]. J Microbiol Biotechn, 2005, 15(6): 1164-1169.

[5] SHAV V, BADIA D, RATSEP P. Sophorolipids having enhanced antibacterial activity[J]. Antimicrob Agents Ch, 2007, 51(1): 397-400.

[6] 陳靜, 宋欣, 曲音波, 等. 酵母胞外槐糖脂產(chǎn)生條件優(yōu)化及其抑菌作用[J]. 山東大學(xué)學(xué)報(bào): 理學(xué)版, 2005, 40(3): 116-120.

[7] NAPOLITANO L M. Sophorolipids in sepsis: anti-inflammatory or antibacterial[J]. Crit Care Med, 2006, 34: 258-259.

[8] SHAH V, DONCEL G F, SEYOUM T, et al. Sophorolipids, microbial glycolipids with anti-human immunodeficiency virus and sperm-immobilizing activities[J]. Antimicrob Agents Ch, 2005, 49(10): 4093-4100.

[9] 何洋, 周黎黎, 劉紅露. 應(yīng)用基因芯片技術(shù)檢測(cè)食品中金黃色葡萄球菌[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2007, 33(6): 108-110.

[10] RICHARD D A, JONATHAN A Z, DANIEL K Y. et al. Biopolymer scaffolds for use in delivering antimicrobial sophorolipids to the acnecausing bacteriumPropionibacterium acnes[J]. New Biotechnol, 2011, 28(1): 24-30.

[11] 鄭春英, 陸欣媛, 王滿玉, 等. 藥用植物五味子內(nèi)生真菌的分離及其抑菌活性研究[J]. 中國(guó)藥學(xué)雜志, 2009, 44(9): 661-664.

[12] 朱春玉, 朱俊豐, 馬杰良, 等. 生防鏈霉菌F-15搖瓶發(fā)酵條件的優(yōu)化[J]. 植物保護(hù), 2010, 36(6): 58-61.

[13] 宋發(fā)軍, 吳士筠, 梁建軍. 巴東冬凌草的抗菌活性研究[J]. 中南民族大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2002, 23(4): 9-11.

[14] 馬緒榮, 蘇德模. 藥品微生物學(xué)檢驗(yàn)手冊(cè)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2001: 210-215.

[15] 陳靜. 槐糖脂產(chǎn)生菌的篩選及槐糖脂抑菌和抗腫瘤作用的研究[D].濟(jì)南: 山東大學(xué), 2006.

[16] 潘凌子, 那杰, 邢卓, 等. 蜂毒肽對(duì)農(nóng)作物病原菌的抑殺作用[J]. 科學(xué)通報(bào), 2007, 52(3): 291-296.

[17] 李文鎮(zhèn). 圖解掃描電子顯微鏡技術(shù)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 1984: 1-50.

[18] 張景強(qiáng), 樸英杰, 蔡?；I, 等. 生物電子顯微技術(shù)[M]. 廣州: 中山大學(xué)出版社, 1987: 113-132.

[19] 何海洋, 陸利霞, 姚麗麗, 等. 糖脂類生物表面活性劑的性質(zhì)及其潛在應(yīng)用進(jìn)展[J]. 化工進(jìn)展, 2011, 30(3): 607-612.

[20] 劉青芝, 郭學(xué)平, 朱希強(qiáng). 槐糖脂的微生物合成及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 食品與藥品, 2009, 11(11): 51-55.

[21] 韓永斌, 朱洪梅, 顧振新, 等. 紫甘薯花色苷色素抑制金黃色葡萄球菌作用初探[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(10): 59-62.

[22] 于慶華, 殷文政, 艾啟俊, 等. 鹿蹄草素對(duì)金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌的抑制效果觀察[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(4): 90-93.

Inhibitory Effect and Mechanisms of Sophorolipids againstStaphyloccocus aureus

HU Jing，ZHAO Xiao-hui，ZHU Chun-yu，HU Feng-qing，HUI Jing*
(Laboratory of Biomaterials and Biopharmaceuticals, School of Life Sciences, Liaoning University, Shenyang 110036, China)

To explore antibacterial mechanisms of sophorolipids againstStaphylococcus aureus, the minimum inhibitory concentration (MIC) of sophorolipids againstS. aureusand the growth curves ofS. aureuswere determined. The microscopic structure ofS. aureuswas observed through scanning electron microscope (SEM) and transmission electron microscope (TEM). Results showed that sophorolipids effectively inhibited the growth ofS.aureus. The inhibitory effect of sophorolipids was a concentration-depended mode, and the MIC of sophorolipids was 1.5625 mg/mL. However, the inhibitory effect of sophorolipids was stable at acid and high temperature condition, indicating that it had excellent stability. Furthermore, sophorolipids should pay antibacterial role through destroying cell membrane and cell wall according to SEM and TEM.

sophorolipids；antibacterial；MIC；scanning electron microscope (SEM)；transmission electron microscope (TEM)

Q935

A

1002-6630(2012)05-0033-04

2011-03-14

沈陽市發(fā)展與改革委員會(huì)高技術(shù)研發(fā)基金項(xiàng)目(2010-16)；遼寧省教育廳科學(xué)基金項(xiàng)目(L2010150)；遼寧大學(xué)青年基金項(xiàng)目(2009LDQN25)

胡靜(1983—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸飳W(xué)。E-mail：hujing628@163.com

*通信作者：回晶(1977—)，女，講師，博士研究生，研究方向?yàn)樯镏扑幣c生物材料。E-mail：huijing@lnu.edu.cn