乳酸菌S-層蛋白及其黏附性相關(guān)研究技術(shù)

范郁冰，肖 榮，李宗軍*

(國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心功能食品分中心，食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128)

乳酸菌S-層蛋白及其黏附性相關(guān)研究技術(shù)

范郁冰，肖 榮，李宗軍*

(國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心功能食品分中心，食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128)

乳酸菌為人體的重要生理性細菌，在維持人體腸道生態(tài)環(huán)境、提高機體免疫力等方面起到重要的作用。然而，乳酸菌發(fā)揮這些生理功能的重要前提是黏附到腸細胞的表面。隨著研究的深入，越來越多的研究表明乳酸菌S-層蛋白對宿主細胞具有黏附性，如羅伊氏乳酸菌S-層蛋白可與黏蛋白及人結(jié)腸癌細胞HT-29進行黏附。在研究乳酸菌S-層蛋白對宿主細胞的黏附時，人們采用了不同的方法。一些常用的基本方法有SDS-PAGE、層析純化技術(shù)、顯微鏡觀察技術(shù)等。隨著新技術(shù)的應(yīng)用，表面等離子共振技術(shù)、免疫學(xué)技術(shù)等也用于研究S-層蛋白的黏附性。本文將著重介紹S-層蛋白及S-層蛋白黏附性研究的相關(guān)技術(shù)。

乳酸菌；S-層蛋白；黏附性；提取；純化

乳酸桿菌是人及動物腸道內(nèi)最重要的生理性細菌之一[1]，它不僅對人體腸道有益生的作用，同時也可以預(yù)防和治療腸道疾病[2]。進入腸道的乳酸菌通過黏附定殖于腸黏膜表面以保護腸黏膜細胞免受各種病原微生物的損傷，所以乳酸菌在腸道內(nèi)的黏附、定殖是其發(fā)揮生理作用的前提和基礎(chǔ)。乳酸桿菌和宿主腸上皮細胞的黏附與乳酸菌體表面成分作用有關(guān)，如脂磷壁酸(lipoteichoic acid，LTA)、細胞外多糖(exopolysaccharides，EPS)和細胞表面蛋白(surface layer protein，SLP)等，其中細胞表面蛋白起著重要的作用[3]。

研究乳酸菌表層蛋白的黏附性對于了解乳酸菌黏附腸細胞的機制有著關(guān)鍵的作用，本文對已應(yīng)用到乳酸菌表層蛋白黏附性研究的各種技術(shù)進行闡述，以便為以后的研究提供更好的基礎(chǔ)。

1 乳酸菌S-層蛋白

1.1 乳酸菌S-層蛋白的特點

細菌表面性質(zhì)和結(jié)構(gòu)在細菌對宿主的黏附中起著重要的作用[4]。過去30多年的研究發(fā)現(xiàn)，在古生菌和細菌中最常見的一種表面結(jié)構(gòu)是由單分子蛋白質(zhì)亞單位組成的晶狀體結(jié)構(gòu)，稱為S-層蛋白(圖1)[5]。在多數(shù)細菌中，S-層蛋白與胞外基質(zhì)(例如纖維蛋白、纖層蛋白或其他的膠原蛋白)均具有黏附作用[6]。S-層蛋白晶體有斜形、正方形和六邊形。根據(jù)不同的晶格類型，S-層蛋白可由1、2、4、5或6個蛋白質(zhì)亞基組成[7]。每個亞基中心距離為2.5～35nm。相對于表面而言，S-層蛋白的里面粗糙一些。S-層蛋白為網(wǎng)孔狀結(jié)構(gòu)，其覆蓋面積可達總面積的70%。

在嗜酸乳桿菌、布氏乳桿菌、瑞士乳桿菌、保加利亞乳桿菌及短乳桿菌中均發(fā)現(xiàn)S-層蛋白[8]。這些種屬中的S-層蛋白具有相同的特性，分子質(zhì)量在25～71kD之間[9]，等電點在9.35～10.04之間。盡管在許多革蘭氏陽性細菌中發(fā)現(xiàn)了S-層蛋白的糖基化結(jié)構(gòu)[10]，但是在大多數(shù)乳酸菌中S-層蛋白是非糖基化的，目前僅在布氏乳桿菌中發(fā)現(xiàn)有糖基化結(jié)構(gòu)[11]。許多乳酸菌含有1～2個編碼S-層蛋白的基因。由S-層蛋白的氨基酸分析可知，S-層蛋白含有較高的疏水性和酸性氨基酸。其中以賴氨酸為主，含有少量的精氨酸、蛋氨酸和組氨酸，在極少的S-層蛋白中發(fā)現(xiàn)含有半胱氨酸。到目前為止，所有已鑒定的乳酸桿菌表層蛋白都具有由 25～30 個氨基酸構(gòu)成的信號肽，這些信號肽的長度可以通過 von Heijne[12]所提供的方法進行預(yù)測。

圖1 電鏡下細菌表面S-層蛋白冰凍刻蝕照片[9]Fig.1 Electronic micrograph of bacterial surface S-layer proteins[9]

S-層蛋白具有一系列的功能，其基本功能有：維持細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；力的穩(wěn)定性；熱穩(wěn)定性；滲透壓穩(wěn)定性。亞功能：包裹細胞；提供周質(zhì)空間；形成網(wǎng)孔狀結(jié)構(gòu)與膜外蛋白相連；保護細胞免受外界環(huán)境因子的影響；防止微粒的進入；免疫功能；與外環(huán)境相互作用；離子交換、連接金屬及生物礦物質(zhì)；表面黏附；毒力因子；噬菌體受體。盡管對于S-層蛋白的結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成、組裝以及基因等方面已經(jīng)具有一定的了解，但是在對于S-層蛋白的特殊功能上的認識還不是很透徹。

1.2 乳酸菌S-層蛋白的黏附性

雖然對乳酸菌S-層蛋白的功能還不是很了解，但是隨著研究的深入，越來越多的研究表明乳酸菌S-層蛋白對宿主細胞具有黏附性。一些乳酸菌的S-層蛋白已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)具有黏附性，如羅伊氏乳酸菌S-層蛋白可與黏蛋白及人結(jié)腸癌細胞HT-29進行黏附，短乳桿菌ATCC 8287 S-層蛋白與細胞外基質(zhì)纖維連接蛋白具有較高的黏附性[13]，而瑞士乳桿菌的S-層蛋白與腸細胞的黏附可以有效抑制大腸桿菌對腸細胞的黏附。

2 黏附性相關(guān)研究技術(shù)

人們采用了不同的研究方法對乳酸菌S-層蛋白的黏附性進行研究，如免疫印記法、表面等離子共振法、熒光法等。下面將介紹幾種在研究S-層蛋白的黏附性時所用到的技術(shù)方法。

2.1 S-層蛋白提取分離純化技術(shù)

2.1.1 S-層蛋白的提取技術(shù)

人們對S層蛋白的提取最早是在1979年，Masuda等[15]用高濃度的尿素將S-層蛋白從短乳桿菌中提取出來。在1980年，Masuda等[16]又采用了高濃度的鹽酸胍提取短乳桿菌S-層蛋白。在2004年，Garrote等[17]利用高濃度的氯化鋰來提取開菲爾乳桿菌(Lactobacillus kefir)中的S-層蛋白。

大多數(shù)S-層蛋白可以通過利用高濃度的溶劑來破壞其氫鍵已達到分離的目的[6]。常用的溶劑有鹽酸胍和氯化鋰。一般的分離步驟為：將乳酸菌于MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，離心收集菌體；PBS沖洗2～3次，加入高濃度提取劑，靜置反應(yīng)一段時間；高轉(zhuǎn)速離心收集上清液；低溫透析過夜便可得到粗的S-層蛋白提取物。對于提取不同菌株中的S-層蛋白，可以采用不同的溶劑處理以達到更好的效果。

2.1.2 S-層蛋白的SDS-PAGE電泳分離技術(shù)

由于采用LiCl或鹽酸胍等溶劑從細菌表面提取出的S-層蛋白中會含有許多雜質(zhì)蛋白，因此，還需要采用進一步的方法對其進行純化。常用的方法為聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。

將初步分離得到的S-層蛋白懸浮于緩沖液中，煮沸5～10min后加入染色劑即可用于進行SDS-PAGE。在進行S-層蛋白的純化時，常用的凝膠的濃度為10%左右。圖2為利用SDS-PAGE分離純化得到的S-層蛋白，其分子質(zhì)量為46kD[18]。

圖2 SDS-PAGE分離得到的S-層蛋白條帶[18]Fig.2 SDS-PAGE analysis of selected S-layer proteins[18]

2.1.3 S-層蛋白的純化技術(shù)

對S-層蛋白進行研究時，可能需要進一步的獲得純的S-層蛋白，常采用的方法是層析純化的方法。層析純化包括凝膠過濾層析、離子交換層析、親和層析、疏水作用層析、聚焦層析等。

1993年，Boot等[19]采用了陽離子交換層析純化S-層蛋白。實驗將S-層蛋白粗提取物通過陽離子交換層析柱，用不同梯度濃度的緩沖液的沖洗，從而將S-層蛋白與雜質(zhì)蛋白分離，得到純度較高的S-層蛋白。除此之外，還可以利用S-層蛋白的其他性質(zhì)來選擇不同的層析方法，如已知S-層蛋白的分子質(zhì)量為40kD左右，則可以采用分辨率在其之間的凝膠來進行純化。

目前，隨著科學(xué)技術(shù)的進步，對蛋白質(zhì)的純化還可以采用高效液相層析。與傳統(tǒng)的層析方法向比，高效液相層析具有以下幾個優(yōu)點：介質(zhì)顆粒的變小，具有更高的分辨率；流速的提高使HPLC提供更快的分離速度；易于實現(xiàn)自動化。

2.2 黏附性顯微鏡觀察研究技術(shù)

2.2.1 原子力顯微鏡觀察技術(shù)

2005年，Andrea Azcarate-peril等[20]利用原子力顯微鏡對S-層蛋白進行了研究。原子力顯微鏡是一種利用原子、分子間的相互作用力來觀察物體表面微觀形貌的新型實驗技術(shù)。與普通的顯微鏡相比，原子力顯微鏡具有一定的優(yōu)點：可以構(gòu)建三維立體的結(jié)構(gòu)，可以以力的形式直接觀察S-層蛋白與基質(zhì)間黏附力的大小[21]，樣品的前處理簡單等。

2.2.2 熒光顯微鏡觀察技術(shù)

近幾年，熒光標記的方法在研究乳酸菌及其S-層蛋白的黏附性中有了一定的應(yīng)用。有的采用異硫氰酸熒光素標記乳酸菌S-層蛋白[18]，在熒光顯微鏡下檢測其對腸細胞的黏附情況；也有的采用細胞熒光素標記細胞，然后觀測乳酸菌對其黏附的情況。

2007年，Kathene等[22]運用熒光標記的方法檢測到瑞士乳桿菌的S-層蛋白可以降低大腸桿菌對腸細胞的黏附，從而表明瑞士乳桿菌的S-層蛋白可以與腸細胞黏附。如圖3所示，在添加了S-層蛋白之后，大腸桿菌與腸細胞的黏附降低了。

圖3 熒光顯微鏡觀察S-層蛋白的黏附性[22]Fig.3 Adhesion of S-layer protein under fluorescence microscope[22]

2.3 基于免疫學(xué)的黏附性研究技術(shù)

在測定S-層蛋白黏附性實驗中，運用的最多的免疫學(xué)技術(shù)為Western Blot雜交技術(shù)。Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳將分離的蛋白質(zhì)樣品轉(zhuǎn)移到固相載體(例如硝酸纖維素薄膜)上以作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性蛋白成分。

2005年，王斌等[23]就采用了Western Blot技術(shù)研究羅伊氏乳桿菌S-層蛋白對黏蛋白和人結(jié)腸癌細胞株HT-29的黏附性。在2008年，劉瓊等[24]利用Western Blot雜交技術(shù)對S-層蛋白表面展示載體進行檢測。

采用Western Blot技術(shù)時，是以S-層蛋白為抗原，以制備的標記了的黏蛋白和細胞為抗體，以DAB為顯色劑。Western Blot雜交技術(shù)主要步驟為將蛋白SDS-PAGE后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，分別用已標記的黏蛋白和HT-9細胞進行雜交反應(yīng)，沖洗去除未雜交的黏蛋白或HT-9細胞，DAB顯色即可觀察到S-層蛋白是否發(fā)生了黏附反應(yīng)。實驗結(jié)果表明，在羅伊氏乳酸菌中，分子質(zhì)量為29kD和14kD的S-層蛋白與黏蛋白和HT-9細胞均有黏附性。

2.4 用于黏附性的表面等離子共振(surface plasmon resonance，SPR)研究技術(shù)

表面等離子共振(SPR)近年來迅速發(fā)展為用于分析生物分子相互作用的一項技術(shù)[25]，其利用生物大分子間(抗體與抗原、酶與底物等)的特異性結(jié)合進行分子識別，并通過光激勵→分子識別→光輸出→電輸出的途徑，完成分子相互作用的信息傳遞與檢測[26]。

de Leeuw等[27]利用了SPR技術(shù)對S-層蛋白與細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)黏附性進行了研究。實驗將經(jīng)過LiCl提取透析后的純S-層蛋白于20000×g離心20min后，利用羥基琥鉑酰二胺將其共價偶聯(lián)到葡聚糖羧化物上，使S-層蛋白固定至載體表面。而未連接的非共價羥基琥鉑酰二胺酯則利用乙醇胺填滿。利用表面活性劑(10mmol/L HEPES、150mmol/L NaCl、3mmol/L EDTA、0.5g/mL表面活性劑P20，pH7.4)于25℃活化。將待測的ECM物質(zhì)(纖連蛋白、層黏連蛋白和膠原蛋白)注入至SPR中，控制流速20μL/min，BlAevaluation 4.1軟件分析。S-層蛋白與不同的ECM的黏附如表1所示。實驗表明，S-層蛋白與黏蛋白和層黏連蛋白具有較高的黏附性，而與膠原蛋白和纖維蛋白的黏附性很低。

運用SPR技術(shù)，可以直接的觀測到S-層蛋白與胞外基質(zhì)黏附性的情況，且采用這種技術(shù)，對樣品的需求量小，樣品無需標記、特異性強、靈敏度高[25]。但是，目前這種方法運用的并不是很普遍，因此，運用此方法可對人們研究S-層蛋白提供新的途徑。

表1 S-層蛋白與胞外基質(zhì)黏附情況Table 1 Binding characteristics of S-layer proteins to extracellular matrix

3 結(jié) 語

乳酸菌作為腸道的生理性細菌，在定殖、黏附于腸道上后對維持腸道的穩(wěn)定性具有重要的作用[28]。S-層蛋白作為乳酸菌的黏附因子之一，已經(jīng)越來越受到人們的關(guān)注。雖然目前對于乳酸菌S-層蛋白黏附性的研究還處于初步階段，但是隨著新的方法的不斷引入，人們對S-層蛋白及其黏附性也有了一定的認知。通過本文的闡述，人們已經(jīng)確定了S-層蛋白的黏附性并獲知了其可以與腸細胞黏蛋白、層黏連蛋白發(fā)生較好的黏附。然而，S-層蛋白的黏附機理仍未揭開。想要了解這一黏附機理，還需從不同的角度運用各種方法來進行進一步的研究。本實驗室也將從分子學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)的角度對乳酸菌S-層蛋白的黏附性進行更加深入的研究。

[1] SALIMINE S, VON W A, AXELSSON L, et al. Lactic bacteria: classification and physiology[M]. America: Lactic Acid Bacteria Microbiology and Functional Aspects, 1998: 1-172.

[2] PAOLA L, FRANCESCA V, STELLA L L. Study of adhesion and survival of lactobacilli and bifidobacteria on table olives with the aim of formulating a new probiotic food[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2005, 71(8): 4233-4240.

[3] JAKAVA-VILJANEN M, PALVA A. Isolation of surface (S) layer protein carryingLactobacillusspecies from porcine intestine and faeces and characterization of their adhesion properties to different host tissues[J].Veterinary Microbiology, 2007, 124(3/4): 264-273.

[4] NAVARRE W W, SCHNEEWIND O. Surface proteins of gram-positive bacteria and mechanisms of their targeting to the cell wall envelope[J].Microbiol Mol Biol Rev, 1999, 62(1): 174-229.

[5] SLEYTR U B. Regular arrays of macromolecules on bacterial cell walls:structure, chemistry, assembly and function[J]. Int Rev Cytol, 1978, 53: 1-64.

[6] BAUMEISTER W, WILDHABER I, PHIPPS B M. Principles of organization in eubacterial and archaebacterial surface proteins[J]. Can J Microbiol, 1989, 35(1): 215-227.

[7] TOCA-HERRERA J L, KRASTEV R, BOSIO V, et a1. Recrystallization of bacterial S-layers on flat polyelectrolyte surfaces and hollow polyelectrolyte capsules[J]. Small, 2005, 1(3): 339-348.

[9] SARA M, SLEYTR U B. S-layer proteins[J]. Bacteriol, 2000, 182(4):859-868.

[10] SHAFFER C, MESSNER P. Glycobiology of surface layer proteins[J].Biochimie, 2001, 83(7): 591-599.

[11] MASUDA K, KAWATA T. Distribution and chemical chracterization of regular arrays in the cell walls of strains of the genusLactobacillus[J].FEMS Microbiol Lett, 1983, 20(9): 145-150.

[12] von HEIJNE G. Signal sequences. the limits of variation[J]. J Mol Biol,1985, 184(10): 99-105.

[13] HYNONEN U, WESTERLUND-WIKSTROM B, PALVA A, et al.Fibronectin-binding function in the SlpA surface protein ofLactobacillus brevis[J]. J Bacteriol, 2002, 184(5): 3360-3367.

[14] BOOT H J, KOLEN C P, POT B, et al. The presence of two S-layer protein-encoding genes is conserved among species related toLactobacillus acidophilus[J]. Microbiology, 1996, 142(6): 2375-2384.

[15] MASUDA K, KAWATA T. Ultrastructure and partial chatacterization of a regular array in the cell wall ofLactobacillus brevis[J]. Microbiol Immunol, 1979, 23(10): 941-953.

[16] MASUDA K, KAWATA T. Reassembly of the regularly arranged subunits in the cell wall ofLactobacillus brevisand their reattachment to cell wall[J]. Microbiol Immunol, 1980, 24(4): 299-308.

[17] GARROTE G L, DELFEDERICO L, BIBILONI R, et al. Lactobacilli isolated from kefir grains: evidence of the presence of S-layer proteins[J].Dairy Res, 2004, 71(2): 222-230.

[18] JOUKO S, BEATRIZ M N, JENNI A, et al. Characterization of the collagen-binding S-layer protein CbsA ofLactobacillus crispatus[J].American Society for Microbiology, 2000, 182(22): 6440-6450.

[19] BOOT H J, KOLEN C P, van NOORT J M, et al. S-layer protein ofLactobacillus acidophilusATCC 4356: purification, expression inEscherichia coli, and nucleotide sequence of the corresponding gene[J].Journal of Bacteriology, 1993, 175(19): 6089-6096.

[20] ANDREA AZCARATE-PERIL M, McAULIFFE O, ALTERMANN E,et al. Microarray analysis of a two-component regulatory system involved in acid resistance and proteolytic activity inLactobacillus acidophilus[J].Applied and Environmental Microbiology, 2005, 71(10): 5794-5804.

[21] 李宗軍, 楊秀華, 劉元元, 等. 乳酸菌S-層蛋白的多樣性及其研究方法[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報, 2009, 28(6): 1673-1689.

[22] KATHENE C J H, KAREN E H, MAHSA G, et a1. Surface-layer protein extracts fromLactobacillus helveticusinhibit enterohaemorrhagicEscherichia coliO157:H7 adhesion to epithelial cells cellular[J]. Microbiol,2007, 9(2): 356-367.

[23] 王斌, 魏泓. 乳桿菌細胞壁表面黏附相關(guān)蛋白的提取和鑒定[J]. 世界華人消化雜志, 2005, 13(14): 1762-1766.

[24] 劉瓊, 王春鳳, 楊桂連, 等. 嗜酸乳桿菌S-層蛋白表面展示系統(tǒng)的構(gòu)建[C]//中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會動物微生態(tài)學(xué)分會第四屆第九次學(xué)術(shù)討論會論文集(上冊). 北京: 中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會, 2008: 451-457.

[25] 楊彥, 戴宗, 鄒小勇. 表面等離子體共振技術(shù)在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用研究中的應(yīng)用[J]. 分析測試學(xué)報, 2009, 28(11): 1344-1350.

[26] 劉國華, 常露, 張維, 等. SPR傳感技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用[J]. 儀表技術(shù)與傳感器, 2005(11): 1002-1840.

[27] de LEEUW E, LI Xiangqun, LU Wuyuan. Binding characteristics of theLactobacillus brevisATCC8287 surface layer to extracellular matrixproteins[J]. FEMS Microbiol Lett, 2006, 260(2): 210-215.

[28] SAARELA M, LAHTEENMAKI L, CRITTENDEN R, et al. Gut bacteria and health foods -the European perspective[J]. Food Microbiol,2002, 78(1/2): 99-117.

LactobacillusSurface Layer Proteins and Research Techniques for Their Adhesion: A Review

FAN Yu-bing，XIAO Rong，LI Zong-jun*
(Functional Foods Branch, National Research Center of Engineering Technology for Utilization of Functional Ingredients from Botanicals, Hunan Province Key Laboratory of Food Science and Biotechnology, Changsha 410128, China)

Lactobacillus, an important kind of physiological bacteria in the human body, plays an important role in maintaining human intestinal ecosystem environment and intestinal health. However, the most important premise forLactobacillusto execute its physiological functions is the adhesion on the surface of intestinal cells. More and more studies have showed that S-layer protein has the ability to adhere to intestinal cells. For example,Lactobacillus reuterican adhere to mucoprotein and HT-9 cells.Various methods such as SDS-PAGE, chromatographic purification, and microscopic observation have been successfully applied to study the adhesion ofLactobacillusto intestinal cells. The applications of surface plasma resonance and immunological techniques to study S-layer protein adhesion have gained extensive attention as a result of the development of new techniques.In this paper, recent research advances inLactobacillusS-layer proteins and their adhesion are reviewed.

Lactobacillus；S-layer protein；adhesion；extraction；purification

TS201.21

A

1002-6630(2012)01-0294-04

2011-01-22

國家“863”計劃項目(2007AA10Z347)

范郁冰(1987—)，女，碩士研究生，研究方向為營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)。E-mail：fan_yubing@163.com

*通信作者：李宗軍(1968—)，男，教授，博士，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：lizongjun@yahoo.com.cn