篤斯越橘產(chǎn)品花色苷抗氧化活性評價(jià)

吳 杰，鄭 影，谷思云，王 萍，*，劉曉娜

（東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040）

篤斯越橘產(chǎn)品花色苷抗氧化活性評價(jià)

吳 杰1，鄭 影1，谷思云2，王 萍2，*，劉曉娜2

（東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040）

對篤斯越橘不同產(chǎn)品花色苷的抗氧化活性進(jìn)行了研究。首先用60%乙醇提取篤斯越橘產(chǎn)品花色苷，再用AB-8大孔樹脂分離，pH示差法測定花色苷含量，最后采用·OH和DPPH·體系對篤斯越橘產(chǎn)品的抗氧化活性和規(guī)律性進(jìn)行了測定和比較。結(jié)果表明，花色苷的抗氧化活性和花色苷含量成顯著正相關(guān)。果醬類產(chǎn)品中花色苷含量最高；不同篤斯越橘產(chǎn)品中花色苷抗氧化能力不同。清除·OH的IC50最小的為8.83μg/mL，最大的為43.24μg/mL；清除DPPH·的IC50最小的為10.48μg/mL，最大的為20.40μg/mL。

篤斯越橘產(chǎn)品，花色苷，抗氧化

篤斯越橘（Vaccinium uliginosum Linn.）為杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium spp.）植物，其成熟的漿果為藍(lán)色或藍(lán)黑色，外皮一層白粉，故俗稱為“藍(lán)莓”（Blueberry），黑龍江省產(chǎn)區(qū)也稱“都柿”，是越橘的一個(gè)資源品種[1]。篤斯越橘是藍(lán)莓的野生品種，在我國的東北地區(qū)大面積生長。篤斯越橘含有豐富的花色苷，花色苷是花青素與糖以糖苷鍵結(jié)合而成的一類化合物，具有抗氧化[2]、消除自由基、降低血清膽固醇、抗變異、抗腫瘤、抗癌、促進(jìn)視網(wǎng)膜上視紅素再合成等生理功能，可預(yù)防和治療青光眼和其他眼類疾病[3]，因此藍(lán)莓被聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）確定為人類五大健康食品之一[4]。隨著預(yù)防衰老、抗癌等越來越成為人們對飲食生活健康的追求，因此在市場上這類的野生漿果產(chǎn)品琳瑯滿目。而目前國內(nèi)對篤斯越橘的研究主要集中在鮮果上，對篤斯越橘產(chǎn)品的研究尚少?；ㄉ杖菀资艿礁鞣N因素影響而降解，如溫度、pH、光照、氧氣、酶，并且在各種加工步驟中也易發(fā)生降解反應(yīng)[5]。已有研究證明，當(dāng)藍(lán)莓加工成果汁和果汁濃縮液時(shí)有大量的花色苷和酚類物質(zhì)損失，特別是當(dāng)磨粉和脫果膠時(shí)由于被本身含有的多酚氧化酶氧化降解而產(chǎn)生最大的損失[6]。本實(shí)驗(yàn)選取以東北地區(qū)篤斯越橘為原料的產(chǎn)品，通過對花色苷進(jìn)行分離、純化，分析其體外抗氧化活性，對該產(chǎn)品的生產(chǎn)和消費(fèi)極具現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藍(lán)莓篤斯越橘產(chǎn)品 購于各大超市；氫氧化鈉、雙氧水、磷酸氫二鈉、冰乙酸、鹽酸、水楊酸、硫酸亞鐵、檸檬酸 均為分析純；AB-8大孔樹脂 天津波鴻樹脂科技有限公司；無水乙醇 天津市天力試劑有限公司；DPPH·（2，2-二（4-叔辛基苯基）-1-苦基肼，分子式C34H44N5O6，分子量618.74） 美國Sigma公司。

RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；722分光光度計(jì) 上海第三分析儀器廠；DK-98-1電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；開放式層析柱30mm×500mm 青島博陽儀器有限公司；PHS-3C雷磁精密pH計(jì) 上海精密儀器有限公司；T6紫外光譜掃描儀 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；JA2003電子天平 上海象平儀器儀表有限公司；TGL-16G高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)樣品 選購了11種以黑龍江地區(qū)篤斯越橘為原料的產(chǎn)品，其中7種果汁、1種原漿、3種果醬。產(chǎn)品的主要信息見表1。

1.2.2 篤斯越橘產(chǎn)品花色苷粗提物制備 量取一定量的篤斯越橘產(chǎn)品（果汁取20m L，果醬取10g，果漿取20m L），分別按照料液比1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16加入60%的乙醇溶液，提取溫度40℃、提取時(shí)間60m in。將經(jīng)過離心、抽濾、減壓濃縮后得到的不同料液比的溶液定容到相同的體積，測定吸光值[7]。吸光值最大的確定為最佳料液比。

根據(jù)產(chǎn)品規(guī)格取一定量產(chǎn)品，按最佳料液比浸提收集濾液。濾渣按同樣的提取條件重復(fù)浸提兩次，至篤斯越橘產(chǎn)品浸提液為無色或淺褐色。3次所得濾液合并后于50℃下減壓濃縮得到棕紅色的粗提液[8]。

1.2.3 AB-8大孔樹脂對花色苷粗提物的純化 預(yù)處理過的AB-8大孔樹脂[9]采用濕法上柱，用5%鹽酸溶液洗2h后用蒸餾水水洗至中性，用5%NaOH堿溶液洗2h，再用蒸餾水水洗至中性，備用?；ㄉ沾痔嵛镆?0m L/m in的流速通過層析柱，吸附至飽和后平衡吸附4h。用三倍柱體積的蒸餾水洗滌雜質(zhì)，用pH 2的70%乙醇洗脫液進(jìn)行洗脫，洗脫流速為1m L/m in[8]，收集所有紅色顏色的洗脫液（洗脫量大于95%）。洗脫液在50℃條件下減壓濃縮，定容。

1.2.4 純化篤斯越橘產(chǎn)品花色苷含量的測定

1.2.4.1 最大吸收波長 取1m L的花色苷純化液用9m L pH 3.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液稀釋，以1m L蒸餾水代替花色苷加9m L pH 3.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液稀釋作為參比[10]，采用紫外-可見光掃描儀于200～800nm下全波長掃描，確定其最大吸收波長為測定波長。

1.2.4.2 花色苷含量的計(jì)算 采用pH示差法，取1m L花色苷濃縮液，分別用pH1.0和pH4.5的緩沖液[11]稀釋到一定倍數(shù)，混勻。以1m L溶劑代替樣液作空白，分別在最大波長X和700nm處測定吸光值[12]。做3次平行實(shí)驗(yàn)?？偦ㄉ盏暮浚ㄒ允杠嚲丈?3-葡萄糖苷計(jì)）按下式計(jì)算：

式中，V：代表純化液的總體積，m L；Mw：代表矢車菊色素-3-葡萄糖苷的相對分子質(zhì)量，449.2mg/mol；Df：代表稀釋因子（樣品總的稀釋倍數(shù)）；ε：代表矢車菊色素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)，26900moL-1；l：代表光程，1cm；v：代表產(chǎn)品體積，m L；蒸餾水作參比；用A700nm來消除樣液渾濁的影響。

1.2.5 抗氧化活性測定

1.2.5.1 對·OH清除能力的測定 采用水楊酸法測定花色苷對·OH的清除能力[13]?；ㄉ諠舛葹?0、20、30、40、50、60μg/m L。按照表2添加藥品，最后加H2O2啟動(dòng)反應(yīng)，37℃反應(yīng)0.5h，以蒸餾水作參比，在最大波長下測定各濃度的吸光度。每一吸光值平行測3次，取其平均值?？箟难嶙麝栃詫φ铡?/p>

式中，A0：代表對照液的吸光度；A1：代表加入花色苷溶液后的吸光度；A2：代表不加顯色劑H2O2花色苷溶液的吸光度（花色苷本底值）。

1.2.5.2 對DPPH·清除能力的測定 花色苷對DPPH·清除能力的測定采用分光光度法[14-15]。所用DPPH·溶液濃度為2×10-4mol/L（95%的乙醇溶解），分別取不同濃度的花色苷溶液2m L及2m L DPPH·溶液加入同一具塞試管中，搖勻后放置30min，以乙醇作參比，分別測定517nm處的吸光度A1。同時(shí)測定2m L不同濃度花色苷溶液與2m L乙醇混合后517nm的吸光度A2，再測定2m L DPPH·溶液與2m L乙醇混合液517nm的吸光度A3。將根據(jù)公式計(jì)算其抑制率。每一吸光值平行測3次，取其平均值?？箟难嶙麝栃詫φ铡?/p>

表1 實(shí)驗(yàn)樣品Table 1 Experimental samples

式中，A1：代表加測定溶液后DPPH·的吸光度；A2：代表測定溶液在測定波長的吸光度；A3：代表未加測定溶液時(shí)DPPH·的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)樣品花色苷提取條件的最適料液比

隨著料液比的增加，花色苷的吸光值增大，趨于平緩后又降低。當(dāng)幾組料液比的花色苷吸光值差異不顯著時(shí)，考慮到溶劑用量過大而造成浪費(fèi)，本實(shí)驗(yàn)選取的為溶劑用量較少的最適料液比。11種樣品花色苷提取液的最適料液比見表3。

表3的結(jié)果表示，不同篤斯越橘產(chǎn)品中花色苷的最適料液比不同。原因是產(chǎn)品中花色苷含量、產(chǎn)品加工工藝、產(chǎn)品狀態(tài)不同。因?yàn)楫a(chǎn)品與鮮果相比含水量及組織狀態(tài)不同，本實(shí)驗(yàn)只對篤斯越橘產(chǎn)品的提取料液比進(jìn)行了探究，提取時(shí)間60min、提取溫度40℃為本校實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果，不再進(jìn)行探究。

2.2 實(shí)驗(yàn)樣品中花色苷含量的平均濃度

從表4可以看出花色苷含量較高的是果醬類產(chǎn)品，B3花色苷含量最高，A2花色苷含量最低。

篤斯越橘果汁產(chǎn)品中花色苷濃度范圍為15.820～ 44.370μg/m L，果醬（漿）產(chǎn)品中花色苷濃度范圍為69.254～119.027μg/m L。原漿C1的花色苷含量小于果醬B1、B2和B3，是因?yàn)楹V斯越橘產(chǎn)品原漿并非含有百分之百的原果，果醬中除篤斯越橘外，無含花色苷的其他物質(zhì)，采用pH示差法得出的結(jié)果為目標(biāo)物中單體花色苷，原漿花色苷含量小于果醬，原因?yàn)楫a(chǎn)品加工、貯藏過程中花色苷存在狀態(tài)變化所致。參照表1和表4，性價(jià)比較好的產(chǎn)品是B3、B1及A7，性價(jià)比較差的是A2。

2.3 篤斯越橘花色苷精制物抗氧化活性評價(jià)

2.3.1 清除·OH的能力

2.3.1.1 澄清果汁產(chǎn)品中花色苷對·OH的清除率 由圖1可以看出，4種產(chǎn)品中提取的花色苷對·OH的清除率均高于VC，并且隨質(zhì)量濃度增加其清除率增強(qiáng)。4種產(chǎn)品中，在有效濃度范圍10～60μg/m L內(nèi)，A2對·OH的清除能力最好，A7對·OH清除能力最差。當(dāng)花色苷濃度大于30μg/m L時(shí)，A 5和A1對·OH的清除能力相差不大。

圖1 澄清果汁類藍(lán)莓產(chǎn)品中花色苷對·OH的清除率Fig.1 The·OH scavenging rate of anthocyanins in clarified blueberry juice

2.3.1.2 帶果粒的果汁產(chǎn)品中花色苷對·OH的清除率 由圖2可以看出，3種產(chǎn)品中提取的花色苷對·OH的清除率均高于VC，并且隨質(zhì)量濃度增加其清除率增強(qiáng)。3種產(chǎn)品中，A6對·OH的清除能力最好。當(dāng)花色苷濃度小于30μg/m L時(shí)，A3對·OH的清除能力較A4好，當(dāng)花色苷濃度大于30μg/m L時(shí)，A3和A4對·OH的清除能力基本相當(dāng)。

2.3.1.3 果醬（漿）產(chǎn)品中花色苷對·OH的清除率由圖3可以看出，4種產(chǎn)品對·OH的清除均高于VC，并且隨著質(zhì)量濃度的增加其清除率提高。其中C1對· OH的清除能力最強(qiáng)。當(dāng)花色苷濃度小于20μg/m L時(shí)，B1、B2和B3對·OH的清除率增強(qiáng)的較平緩。當(dāng)花色苷濃度大于20μg/m L時(shí)，B3對·OH的清除能力最差，B1和B2的清除能力基本相當(dāng)。

表2 對·OH清除率測定方法的試劑添加順序Table 2 The addition order of the reagent in·OH assay

表3 花色苷提取條件的最適料液比Table 3 Themost suitable solid-liquid ratio of anthocyanin extraction conditions

表4 實(shí)驗(yàn)樣品中花色苷含量的平均濃度（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）Table 4 The average concentration of anthocyanins content in the experimental samples（mean±standard deviation）

圖2 帶果粒的果汁類產(chǎn)品中花色苷對·OH的清除率Fig.2 The·OH scavenging rate of anthocyanins in blueberry juice with full fruit

圖3 果醬類產(chǎn)品中花色苷對·OH的清除率Fig.3 The·OH scavenging rateofanthocyaninsin blueberry jams

2.3.2 清除DPPH·的能力

2.3.2.1 澄清果汁產(chǎn)品中花色苷對DPPH·清除率 由圖4可以看出，4種產(chǎn)品隨花色苷濃度增加其對DPPH·的清除率也提高。4種篤斯越橘果汁中對DPPH·清除能力最差的是A5，清除能力較強(qiáng)的是A1和A2，A1和A2為同一廠家生產(chǎn)。當(dāng)花色苷濃度小于10μg/m L時(shí)，4種果汁對DPPH·的清除率都比VC低，當(dāng)花色苷的濃度大于10μg/m L時(shí)，A1和A2的清除率比VC高。

圖4 澄清果汁類產(chǎn)品中花色苷對DPPH·的清除率Fig.4 The DPPH·scavenging rate of anthocyanins in clarified blueberry juice

2.3.2.2 帶果粒的果汁產(chǎn)品中花色苷對DPPH·的清除率 由圖5可以看出，3種帶果粒的篤斯越橘果汁中，A4對DPPH·的清除能力最差。當(dāng)花色苷的濃度小于5μg/m L時(shí)，3種果汁對DPPH·的清除能力均小于VC；當(dāng)花色苷的濃度大于15μg/m L時(shí)，A6的清除能力最強(qiáng)，A3和VC的清除能力基本相當(dāng)。

圖5 帶果粒的果汁類產(chǎn)品對DPPH·的清除率Fig.5 The DPPH·scavenging rate of anthocyanins in blueberry juice with full fruit

2.3.2.3 果醬（漿）產(chǎn)品中花色苷對DPPH·的清除率由圖6可以看出，隨著花色苷質(zhì)量濃度的增加，4種產(chǎn)品對DPPH·的清除率也隨之增強(qiáng)，C1對DPPH·的清除能力最差。當(dāng)花色苷的濃度小于5μg/m L時(shí)，4種產(chǎn)品對DPPH·的清除能力均小于VC；當(dāng)花色苷的濃度大于20μg/m L，B2對DPPH·的清除能力均高于其他3種產(chǎn)品。從總體4種產(chǎn)品對DPPH·的清除率而言，B2、B3和C1對DPPH·的清除效果相差不大。

圖6 果醬類產(chǎn)品對DPPH·的清除率Fig.6 The DPPH·scavenging rate of anthocyanins in blueberry jams

2.3.3 篤斯越橘產(chǎn)品花色苷清除·OH和DPPH·能力半數(shù)抑制濃度（IC50） 清除能力分別以花色苷提取物和VC標(biāo)準(zhǔn)品對·OH和DPPH·的清除率達(dá)到50%時(shí)對應(yīng)的濃度IC50值表示，結(jié)果見表5。

表5 篤斯越橘產(chǎn)品花色苷提取物清除·OH和DPPH·能力半數(shù)抑制濃度表Table 5 The IC50 of the anthocyanins in blueberry products in ·OH and DPPH·assay

·OH IC50值比較：VC＞B3＞A3＞A4＞B1＞A 7＞B2＞A5＞A6＞A1＞C1＞A2；DPPH·IC50值比較：A4＞A5＞A7＞

C1＞B2＞B1＞A3＞A2＞B3＞A1＞VC＞A6。由結(jié)果比較可以看出，11種篤斯越橘產(chǎn)品的花色苷提取液對·OH的清除能力均比VC強(qiáng)，A4、A5、A7、C1、B2、B1、A3、A2、B3、A1對DPPH·的清除能力較VC弱，是由于抗氧化機(jī)理不同造成的。從IC50值的大小可以看出，同種產(chǎn)品對·OH的清除能力比DPPH·弱。不同的藍(lán)莓產(chǎn)品類型與IC50關(guān)系不明顯。

2.4 花色苷濃度和抗氧化評價(jià)方法之間的相關(guān)性研究

2.4.1 花色苷濃度與·OH清除率之間的相關(guān)性 由表6可以看出，11種篤斯越橘產(chǎn)品的花色苷提取液及VC標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度與·OH清除率之間的R2均大于0.9，呈顯著的正相關(guān)性?；ㄉ諏ΑH清除率與花色苷含量的相關(guān)性分析濃度為5～60μg/m L。

表6 花色苷濃度與·OH清除率的相關(guān)性Table 6 The correlation between anthocyanins contentand the·OH scavenging rate

2.4.2 花色苷濃度與DPPH·清除率之間的相關(guān)性 由表7可以看出，11種篤斯越橘產(chǎn)品的花色苷提取液及VC標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度與DPPH·清除率之間的R2均大于0.8，呈顯著的正相關(guān)性?；ㄉ諏PPH·清除率與花色苷含量的相關(guān)性分析濃度為2～20μg/m L。

表7 花色苷濃度與DPPH·清除率之間的相關(guān)性Table 7 The correlation between anthocyanins contentand the DPPH·scavenging rate

3 結(jié)論

篤斯越橘產(chǎn)品的抗氧化活性研究結(jié)果表明，11種篤斯越橘產(chǎn)品花色苷都具有抗氧化活性，可以有效清除DPPH·及·OH。11種篤斯越橘產(chǎn)品中提取的花色苷的抗氧化能力和其花色苷的濃度之間存在著明顯的量效關(guān)系，且在不同的抗氧化體系中相同濃度下的不同產(chǎn)品的花色苷則表現(xiàn)出不同的抗氧化活性。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室的研究結(jié)果，篤斯越橘經(jīng)過加工后，與原果相比抗氧化能力降低；不同產(chǎn)品相同濃度花色苷抗氧化活性不同，說明花色苷結(jié)構(gòu)受到加工及環(huán)境條件的影響，但總體抗氧化能力降低較少。

[1]胡濟(jì)美，籍保平，周峰，等.大興安嶺篤斯越橘花色苷成分鑒定研究[J].食品科學(xué)，2009，30（10）：239-241.

[2]劉榮，冷梅，王振宇.三種漿果提取物體外抗氧化活性研究[J].食品工業(yè)科技，2012，33（11）：71-75.

[3]Ghosh D，Konishi T.Anthocyanins and anthocyanin-rich extracts：Role in diabetesand eye function[J].Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition，2007，16（2）：200-208.

[4]楊國放，楊宏，呂春茂，等.越橘果實(shí)花色苷及其抗氧化活性研究進(jìn)展[J].遼寧農(nóng)業(yè)科技，2011（5）：46-50.

[5]Margherita R，Elena G，Roberto M，et al.Effect of fruit blanching on phenolics and radical scavenging activity of highbush blueberry juice[J].Food Research International，2003，36：999-1005.

[6]Skrede G，Wrolstad R E，Durst RW.Changes in anthocyanins and polyphenolics during juice processing ofhighbush blueberries（Vaccinium corymbosum L.）[J].Journal of Food Science，2000，65：357-364.

[7]王原羚，郝睿，羅云波，等.黑寶石李果皮花色苷的提取工藝及其穩(wěn)定性研究[J].食品工業(yè)科技，2011，32（9）：243-245.

[8]孟憲軍，李穎暢，宣景宏，等.AB-8大孔樹脂對藍(lán)莓花色苷的動(dòng)態(tài)吸附與解析特性研究[J].食品工業(yè)科技，2007，28（12）：94-99.

[9]徐金瑞，張名位，劉興華，等.大孔樹脂對黑大豆種皮花色苷的純化研究[J].農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報(bào)，2006，37（4）：145-148.

[10]孫婧超，劉玉田，趙玉平，等.pH示差法測定藍(lán)莓酒中花色苷條件的優(yōu)化[J].中國釀造，2011（11）：171-174.

[11]楊兆艷.pH示差法測定桑葚紅色素中花青素含量的研究[J].食品科技，2007（4）：201-203.

[12]王少波，杜永峰，姚秉華.pH示差法測定黑豆皮中的花青素[J].化學(xué)分析計(jì)量，2008，17（1）：46-49.

[13]戈群妹，王新風(fēng)，楊芳，等.葎草水提液多酚的含量測定與抗氧化性研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科技，2009，37（9）：4118-4120.

[14]熊何健，龐杰，煙利亞，等.桑葚花色苷熱降解動(dòng)力學(xué)及清楚DPPH活性的熱穩(wěn)定性研究[J].南開大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010，45（5）：15-20.

[15]陳玉霞，劉建華，林峰，等.DPPH和FRAP法測定41種中草藥抗氧化活性[J].實(shí)驗(yàn)室研究與探索，2011，30（6）：11-14.

Assessment of the antioxidant activity of anthocyanins from V.uliginosum berry products

WU Jie1，ZHENG Ying1，GU Si-yun2，WANG Ping2，*，LIU Xiao-na2
（School of Forestry，Northeast Forestry University，Harbin 150040，China）

The antioxidantac tivity of anthocyanins in d ifferent V.uliginosum berry p roducts were analyzed.Firstly，the anthocyanins in V.uliginosum berry p roducts were extracted w ith 60%ethanol，and then separated by an AB-8 macroporous resin column and the pH d ifferential assay was used to determ ine the total anthocyanins content.Finally，the·OH assay and DPPH·assay were used to determ ine and compare the antioxidant capacity and the regular pattern of the V.uliginosum berry p roducts.The result showed that antioxidant capacity of the anthocyanins had a significant positive correlation w ith the anthocyanins content.The jam s had the largest anthocyanins content and the antioxidant capacity of anthocyanins in d ifferent V.uliginosum berry p roducts that was d ifferent.In·OH assay，the least IC50was 8.83μg/m L，and the largest was 43.24μg/m L.In DPPH·assay，the least IC50was 10.48μg/m L，and the largestwas 20.40μg/m L.

V.uliginosum berry p roducts；anthocyanins；antioxidant capacity

TS255.1

A

1002-0306（2012）22-0181-05

2012－05－11 *通訊聯(lián)系人

吳杰（1990-），女，大學(xué)本科，研究方向：食品基礎(chǔ)原料開發(fā)。

東北林業(yè)大學(xué)創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)基金（1110225012）。