酶法制備豆粕抗氧化蛋白肽的研究火麻乳飲料制漿工藝的研究

馬利華，秦衛(wèi)東，陳學(xué)紅

(徐州工程學(xué)院食品學(xué)院，江蘇徐州 221008)

酶法制備豆粕抗氧化蛋白肽的研究火麻乳飲料制漿工藝的研究

馬利華，秦衛(wèi)東*，陳學(xué)紅

(徐州工程學(xué)院食品學(xué)院，江蘇徐州 221008)

研究復(fù)合酶制備豆粕抗氧化蛋白肽的條件，采用響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化酶解工藝，并采用高效液相色譜法對多肽酶解液進(jìn)行分離純化及抗氧化性能的測定。結(jié)果表明:胰蛋白酶與堿性蛋白酶的比例為2∶1，制備豆粕抗氧化蛋白肽的最佳酶解條件為:溫度60℃，時(shí)間1.5h，底物濃度8%，酶用量0.4AU/g，得到蛋白肽含量14.08mg/g。高效液相色譜法分離出3個組分，且組分1的抗氧化效果好于其他組分。

復(fù)合酶，大豆多肽，響應(yīng)曲面，抗氧化性

大豆是我國大面積種植的油料作物，含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，尤其是蛋白質(zhì)、亞油酸以及一些必需氨基酸，對人體均有良好的調(diào)節(jié)、保健功能［1－2］。隨著生物技術(shù)的進(jìn)步和生命科學(xué)的發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)某些蛋白質(zhì)無生理活性或活性很低，而其水解后產(chǎn)生的肽類卻具有很強(qiáng)的生理活性［3］。近年來，研究人員利用酶技術(shù)得到的大豆酶水解物即大豆生物活性肽，具有營養(yǎng)全面、易消化吸收等諸多特性［4－6］，尤其是具有清除羥基自由基［7］、終止單線態(tài)氧的生成［8］、絡(luò)合促氧化的過渡［9］、抗氧化、降膽固醇、抗輻射、調(diào)節(jié)免疫、抗疲勞、增強(qiáng)肌肉運(yùn)動能力、抑制腫瘤等非特異性作用［10－12］，還能降低自動氧化速率和脂肪的過氧化物含量［13］等功效。因此，開發(fā)大豆生物活性肽可以大幅度提高大豆制品的附加值，拓寬大豆的用途，應(yīng)用前景十分廣闊。本實(shí)驗(yàn)以脫脂后的豆粕為原料，采用復(fù)合酶對豆粕進(jìn)行有效的酶解，并進(jìn)行抗氧化性的研究，使其成為豆粕高值化利用的有效途徑之一。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冰乙酸、無水乙醇、三氯乙酸、95%乙醇、考馬斯亮藍(lán)G－250、牛血清白蛋白、硫代巴比妥酸、硫酸亞鐵等 均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;胰蛋白酶、酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶 酶活均為15AU/g，無錫市雪梅酶制劑科技有限公司;DPPH 生化試劑，SIGMA。

DHG9140型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、7230G型可見分光光度計(jì)、精密酸度計(jì)PHS－3CA 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;Agilent100高效液相色譜儀 美國Agilent公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酶種類的確定 分別稱取酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶各1g，加入豆粕，調(diào)整酶用量為0.5AU/g，酶解溫度45℃，酶解時(shí)間2h，自然條件下酶解后，4000r/min離心15min，上清液在100℃的沸水中滅酶3min，測定多肽含量。

1.2.2 復(fù)配酶比例的確定［14］將選取的兩種酶調(diào)節(jié)為3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3的比例，加入豆粕，酶用量0.5AU/g，酶解溫度45℃，酶解時(shí)間2h，自然條件下酶解后，4000r/min離心15min，上清液在100℃的沸水中滅酶3min，測定多肽含量。

1.2.3 豆粕多肽酶解［15］調(diào)節(jié)酶用量分別為 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6AU/g，在自然條件下，加入蒸餾水，調(diào)節(jié)底物濃度分別為6%、7%、8%、9%、10%、11%，分別在40、45、50、55、60、65℃條件下酶解0.5、 1、1.5、2、2.5、3h后，4000r/min離心15min，上清液在100℃的沸水中滅酶3min，測定多肽含量。

根據(jù)上述單因素實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行響應(yīng)曲面(Design Expert 7.0)實(shí)驗(yàn)。以酶解溫度，底物濃度，酶解時(shí)間，酶用量做四因素三水平的響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of RAS test

1.2.4 超濾膜分離純化［16］蛋白溶液酶解之后，酶解產(chǎn)物分子量分布較廣，其中大分子肽含量高，束縛了肽在食品行業(yè)中的應(yīng)用，因此利用超濾膜的選擇性，使大分子溶質(zhì)和微粒被粒膜阻留，從而達(dá)到分離純化酶解液的目的。酶解產(chǎn)物用截流分子量為5000ku的超濾膜進(jìn)行處理。

1.2.5 HPLC對豆粕多肽的分離純化［17］流動相: A，90%乙腈(含0.1%TFA);B，去離子水(含0.1% TFA);洗脫條件:0～3min，10%～100%A，10～20min，100%A～0;進(jìn)樣量:10μL;流速:0.5mL/min;檢測波長:220nm。

1.2.6 蛋白肽抗氧化性測定

1.2.6.1 DPPH自由基清除活性 根據(jù) Brand－Williams等［18］的方法測定。稱取0.0128g DPPH加水溶解于小燒杯中，移至50mL容量瓶，定容，搖勻。取DPPH溶液5mL，加入樣品及參照液，用二次蒸餾水定容于 10mL容量瓶中，置于 20℃水浴鍋恒溫30min，于517nm波長下測定吸光度。

樣品對DPPH自由基的清除能力SA:

其中:A0:DPPH+80%乙醇溶液;Ai:DPPH+樣品溶液;Aj:樣品溶液+80%乙醇溶液。

1.2.6.2 羥基自由基清除活性 根據(jù)Zhang等［19］的方法測定。取8支具塞試管，每支試管各加入9mmol/L FeSO41mL，9mmol/L水楊酸一乙醇溶液2mL，按試管編號各加入不同濃度的多糖溶液2mL，最后加入8.8mol/L H2O22mL啟動反應(yīng)，37℃反應(yīng)0.5h。以蒸餾水作空白調(diào)零，在510nm處測定樣品的吸光度。

式中，A0－空白對照液的吸光度;AX－加入提取液的吸光度。

1.2.6.3 脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的抑制作用 根據(jù)秦衛(wèi)東等［20］的方法測定。用pH 7.4，0.1mol/L PBS配制1∶25稀釋的卵磷脂懸濁液，取此懸濁液lmL，分別加入

2mL不同濃度的樣品溶液，0.5mmol/L硫酸亞鐵溶液，用上述PBS補(bǔ)足至5mL，對照管除不加樣品溶液外其他試劑同前，并提前加入20%TCA溶液0.5mL，

對照管和樣品管37℃水浴15min，取出后加入20% TCA溶液 0.5mL，靜置 10min，于 3500r/min離心10min，取上清液2mL，分別加入0.8%硫代巴比妥酸1mL混勻，沸水浴15min，取出冷卻，在532nm測吸光值。

式中，A0－對照管的吸光度;A1－樣品管的吸光度。

1.2.7 豆粕蛋白肽含量測定 以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，參照魯偉等［21］的方法測定:

蛋白肽含量(mg/g)=蛋白肽液濃度×稀釋倍數(shù)×(提取液體積/測定時(shí)使用體積)/原料質(zhì)量

實(shí)驗(yàn)每組重復(fù)三次，每次取兩個平行樣，數(shù)據(jù)分析采用EXCEL軟件得到方程:Y=0.046C+0.0249，R2為0.9972。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶種類的確定

結(jié)果表明，每種酶水解豆粕后都能提高豆粕的蛋白肽含量，蛋白酶的來源不同，其酶學(xué)特性不同，對同一種蛋白質(zhì)的水解作用也會存在差異。本研究表明(圖1)，水解效果最好的酶依次為:堿性蛋白酶＞胰蛋白酶＞中性蛋白酶＞酸性蛋白酶＞木瓜蛋白酶。

2.2 兩種酶最佳比例的確定

酶反應(yīng)的專一性導(dǎo)致單一酶作用范圍小，本實(shí)驗(yàn)采用堿性蛋白酶和胰蛋白酶復(fù)合酶水解，可有效地提高蛋白質(zhì)的水解效果，本實(shí)驗(yàn)也證明了這點(diǎn)，通過比較圖1、圖2可知，不同蛋白酶混合后，水解效果均好于單一酶，且胰蛋白酶與堿蛋白酶比例為2∶1時(shí)豆粕多肽的水解效果最佳。

圖1 不同蛋白酶酶解效果比較Fig.1 The comparison of hydrolyzates effects of different prolease

2.3 豆粕多肽酶解

2.3.1 溫度對多肽提取的影響 酶催化反應(yīng)都有其最適溫度，一般在酶的最適溫度以下，隨著溫度的升高反應(yīng)物的能量和分子間有效接觸的頻率增加，因而反應(yīng)速度加快。超過最適溫度，則酶分子的空間結(jié)構(gòu)由于能量的增加而發(fā)生改變，導(dǎo)致酶活性減弱或喪失。由圖3可知，復(fù)合酶在55～65℃都具有較強(qiáng)的酶活性。

2.3.2 酶解時(shí)間對多肽提取的影響 從圖4可知，隨著酶作用時(shí)間的延長，水解出的蛋白肽越多，在2h后水解蛋白肽含量趨于穩(wěn)定。說明復(fù)合酶在作用2h后，其酶解作用基本完成。

圖2 不同比例復(fù)合酶酶解效果比較Fig.2 The comparison of hydrolyzates effects of different scale prolease

圖3 溫度對酶解效果的影響Fig.3 Influence of the temperature to extract the peptides

圖4 時(shí)間對酶解效果的影響Fig.4 Influence of the time to extract the peptides

2.3.3 底物濃度對提取多肽的影響 由圖5可知，在酶用量一定，且底物濃度在一定范圍內(nèi)，理論上講底物濃度越大則酶與底物之間作用越頻繁，酶解效果越佳。隨著底物濃度的增加，底物相對于酶的濃度減少，當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到9%(W/V)以后，底物的數(shù)量就趨于過剩，造成水解程度增加變緩慢。

圖5 底物濃度對酶解效果的影響Fig.5 Influence of the concentration to extract the peptides

2.3.4 酶用量對提取多肽的影響 由圖6可知，隨著酶量的增加，蛋白肽含量也不斷增加。當(dāng)酶量增加到一定值后，曲線的上升趨緩。酶用量的增加可以大大增加酶與底物結(jié)合的幾率，從而增強(qiáng)水解程度。但其本身也是蛋白，也會發(fā)生酶解，所以量太大了則會干擾酶解物的組成。因此確定酶用量為0.4AU/g左右。

圖6 酶用量對酶解效果的影響Fig.6 Influence of the enzyme dosage to extract the peptides

2.3.5 響應(yīng)曲面分析 根據(jù)Box－Benhnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以酶解溫度、酶解時(shí)間、底物濃度、酶用量為自變量，以蛋白肽含量為指標(biāo)，設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of response surface test

由表3看出，多肽含量整體模型的P值均＜0.0001，說明模型極顯著，失擬項(xiàng)的P值是0.0665(大于0.05)，說明實(shí)驗(yàn)方法是可靠的，使用這個模型模擬真實(shí)的四因素三水平的分析是可行的。相關(guān)系數(shù)R2=0.9819，表明水解效果的預(yù)測值與實(shí)際值之間具有較好的擬合度。其校正決定系數(shù)=0.9638，表明只有約3.37%的總變異不能用此模型來解釋，模型的信噪比為23.013＞4，進(jìn)一步說明本模型設(shè)計(jì)是非常成功的。酶用量對指標(biāo)的線性效應(yīng)顯著，影響順序?yàn)槊赣昧浚镜孜餄舛龋久附鉁囟龋久附鈺r(shí)間。

表3 蛋白肽含量方差分析表Table 3 Analysis of variance table

按照Box－Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的統(tǒng)計(jì)學(xué)要求，對實(shí)驗(yàn)進(jìn)行回歸擬合，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。利用Design Expert軟件，通過對表3中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到二次多項(xiàng)回歸方程分別為:

由回歸方程可求得此曲面響應(yīng)的最優(yōu)方案為:溫度為59.98℃，時(shí)間為1.5h，底物濃度為8%，酶用量為0.39AU/g。對響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn):溫度為60℃，時(shí)間為1.5h，底物濃度為8%，酶用量為0.4AU/g，在此條件下得到蛋白肽含量14.08mg/g，高于預(yù)測值3.15%。由此證明實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃侠?，?shí)驗(yàn)結(jié)果理想。

2.4 HPLC法分離純化豆粕多肽

采用HPLC法對豆粕多肽的酶解液進(jìn)行分離純化，得到的圖譜如圖7所示。

圖7 豆粕多肽的酶解液的HPLC圖譜Fig.7 HPLC chromatogram of hydrolyzates

經(jīng)HPLC法分析得出:豆粕多肽酶解液出現(xiàn)許多峰，說明存在許多組分，其中在2.0、5.4、18.4min左右分離出三個組分(組分1、2、3)峰值最大。

2.5 豆粕多肽抗氧化性的測定

2.5.1 DPPH法 由圖8可知，豆粕多肽的3個組分清除DPPH自由基的活性均與蛋白肽含量有良好的線性關(guān)系，得到各組分的擬合方程，組分1:Y1= 5.924X+16.532，R2=0.9028，IC50為5.65mg/g;組分2:Y1=4.3X+4.59，R2=0.9123，IC50為10.56mg/g;組分 3:Y1=3.906X+6.354，R2=0.9341，IC50為11.17mg/g;VC:Y1=7.192X+10.086，R2=0.938，IC50為5.55mg/g。表明在相同濃度下，組分1對清除DPPH自由基活性好于組分2、3，且與同濃度范圍的VC相當(dāng)。

圖8 豆粕多肽清除DPPH自由基活性Fig.8 Scavenging activity ofsoybean peptides on DPPH free radicals

2.5.2 脂質(zhì)過氧化反應(yīng)抑制作用 由圖9可知，豆粕多肽的3個組分對脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的抑制均與蛋白肽含量有良好的線性關(guān)系，得到各組分的擬合方程，組分 1:Y1=8.913X－1.933，R2=0.8982，IC50為5.83mg/g;組分2:Y1=5.948X－2.868，R2=0.8868，IC50為 8.83mg/g;組分 3:Y1=4.498X－1.318，R2= 0.8843，IC50為 11.41mg/g;VC:Y1=8.703X+0.951，R2=0.9465，IC50為5.64mg/g。表明在相同濃度下，組分1對脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的抑制作用好于組分2、3，略遜于VC。

2.5.3 清除羥基自由基 由圖10可知，豆粕多肽的3個組分對羥基自由基的清除作用均與蛋白肽含量有良好的線性關(guān)系，得到各組分的擬合方程，組分1: Y1=3.62X－2.572，R2=0.8429，IC50為14.52mg/g;組分2: Y1=2.895X－3.411，R2=0.827，IC50為18.45mg/g;組分3: Y1=2.078X－2.266，R2=0.8174，IC50為 25.15mg/g; VC:Y1=8.7X+8.09，R2=0.9372，IC50為4.82mg/g。表明相同濃度下組分1對脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的抑制作用好于組分2、3，但各組分清除羥基自由基能力均不如VC。

圖9 豆粕多肽對脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的抑制作用Fig.9 Inhibitory effect of soybean peptides on lipid peroxidation

圖10 豆粕多肽清除羥基自由基的活性Fig.10 Scavenging activity of soybean peptides on hydroxyl free radicals

2.5.4 各組分抗氧化性比較 由圖11可知，酶解后的豆粕多肽各組分表現(xiàn)出一定的抗氧化性，其中清除DPPH自由基和抑制脂質(zhì)過氧化物自由基能力較強(qiáng)，且分離出的組分1的抗氧化能力強(qiáng)于組分2、3，清除DPPH自由基和抑制脂質(zhì)過氧化物自由基能力與VC相當(dāng)。其原因可能主要由于各組分的分子量大小的影響。何榮等［22］在研究菜籽肽清除自由基能力時(shí)發(fā)現(xiàn)，分子質(zhì)量越小的菜籽肽對DPPH自由基的清除能力越強(qiáng)。龐宗文等［23］用毛霉發(fā)酵豆粕后所產(chǎn)大豆肽分子質(zhì)量主要集中在10ku以下。對于本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

圖11 各組分抗氧化性比較Fig.11 The comparison of antioxidation of components

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以脫脂豆粕為原料，采用復(fù)合酶法制備抗氧化肽。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)確定最佳酶解條件是:溫度為60℃，時(shí)間為1.5h，底物濃度為8%，酶用量為0.4AU/g，在此條件下得到蛋白肽含量14.08mg/g。

在此條件下制備的豆粕多肽液經(jīng)離心、超濾純化后，采用高效液相色譜法分離，得到主要的3個組分。以清除DPPH自由基和羥基自由基及對脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)物抑制作用等方法測定豆粕多肽的抗氧化性，結(jié)果表明:豆粕多肽的這3個組分均具有一定的抗氧化性，其中清除DPPH自由基和抑制脂質(zhì)過氧化物自由基能力較強(qiáng)，抗氧化活性與其質(zhì)量呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，且組分1的抗氧化效果好于其他組分，與VC相當(dāng)。

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Perparation of antioxidant peptides from soybean meal by complex enzyme

MA Li－h(huán)ua，QIN Wei－dong*，CHEN Xue－h(huán)ong
(Food Engineering College of Xuzhou Institute，Xuzhou 221008，China)

The optimal conditions of oxidationresist soybean peptides by complex enzyme were investigated with RSM.The zymohydrolysis supernatant of soybean peptide were separation and purification by HPLC and its inoxidability were determined.The results showed that the optimal zymohydrolysis proportion was:trypsinase:alkali protease 2∶1，temperature 60℃，time 1.5h，the concentration 8%，enzyme dosage 0.4AU/g，the contents of oxidationresist soybean peptides was 14.08mg/g.The zymohydrolysis supernatant of soybean meal were three component with HPLC，and fraction 1 was superior to others.

complex enzyme;soybean peptide;RSM;inoxidizability

TS201.2+1

B

1002－0306(2012)06－0340－06

2011－06－13 *通訊聯(lián)系人

馬利華(1966－)，女，碩士，副教授，研究方向:天然產(chǎn)物的研究與食品加工。