海沃德獼猴桃?guī)€基蛋白酶的催化特性

張 倩，陳 彥，2，*，林曉艷，2，林金鳳

(1.西南科技大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽(yáng) 621010;

2.生物質(zhì)材料教育部工程研究中心，四川綿陽(yáng) 621010)

海沃德獼猴桃?guī)€基蛋白酶的催化特性

張 倩1，陳 彥1，2，*，林曉艷1，2，林金鳳1

(1.西南科技大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽(yáng) 621010;

2.生物質(zhì)材料教育部工程研究中心，四川綿陽(yáng) 621010)

對(duì)以海沃德獼猴桃殘次果提取的巰基蛋白酶進(jìn)行了動(dòng)力學(xué)研究，考察了一些外加劑對(duì)酶活的影響，同時(shí)初步探討了酶液的穩(wěn)定性。結(jié)果表明:以酪蛋白為底物的獼猴桃?guī)€基蛋白酶的 Km值為6.56×10－3mmol，Vmax為163.93mg·mL－1·min－1;在其底物濃度為1.0g/L時(shí)，該酶的最適溫度和pH分別為55℃和5.5;L－半胱氨酸、2－巰基乙醇、硫代硫酸鈉、EDTA以及葡萄糖等外加劑對(duì)酶具有明顯的激活效果，且EDTA的激活作用最強(qiáng);抗壞血酸、碘乙酸和過(guò)氧化氫等外加劑對(duì)酶則具有抑制作用。在最適酶促反應(yīng)條件下，于4℃溫度存放的酶液活性隨時(shí)間延長(zhǎng)呈急劇的降低，并以pH為3.5存放條件下的降低最少，約可保存80%的酶活性。

獼猴桃，巰基蛋白酶，催化，抑制劑，激活劑

1959年Arcus從獼猴桃果實(shí)中首次分離獲得獼猴桃蛋白酶，因其分子中含有巰基，故也稱獼猴桃?guī)€基蛋白酶(Thiol Protease，TP)，其在許多功能特性方面與同屬巰基蛋白酶的木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶等類似［1］。國(guó)內(nèi)外對(duì)其分子量、等電點(diǎn)、Km值、催化功能基團(tuán)、機(jī)理及激活動(dòng)力學(xué)、胍脲和SDS導(dǎo)致的構(gòu)象與活力變化等進(jìn)行了較為廣泛的研究［1，2－5］。TP可用于降解奶過(guò)敏原α乳白蛋白和β乳球蛋白［6］，亦可代替木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶等用于生產(chǎn)果凍、啤酒澄清、美容祛斑、農(nóng)殘洗滌等食品、醫(yī)藥和化工等領(lǐng)域［7－9］。海沃德(Hayward)獼猴桃(Actinidia chinensis Planch.)在獼猴桃生產(chǎn)中占有較大的比重，無(wú)論是產(chǎn)中還是產(chǎn)后均有大量的殘次果，如何針對(duì)其開(kāi)展相關(guān)的利用研究，提高資源效益是一個(gè)重要的研究課題［10－12］。針對(duì)海沃德獼猴桃殘次果巰基蛋白酶進(jìn)行相關(guān)動(dòng)力學(xué)及穩(wěn)定性研究可為其資源開(kāi)發(fā)提供依據(jù)與參考，目前未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

pHS－25數(shù)顯pH計(jì) 上海理達(dá)儀器廠;Allegra 64R高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特;SHA－B水浴恒溫振蕩箱 金壇市醫(yī)療儀器廠;MD10－14透析袋 直徑為16mm，壓平寬度為25mm，截留分子量為14000ku，北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司; SHZ－D(Ⅲ)循環(huán)真空泵 鞏義市英峪予華儀器廠; U－3900紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本日立科技公司; RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海愛(ài)明儀器有限公司; LGJ－18真空冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酶提取方法 參照文獻(xiàn)［13］法修改，即取獼猴桃汁，以1∶6的汁液比加入5%的乙醇液并在25℃下水浴振蕩40min經(jīng)旋轉(zhuǎn)減壓蒸發(fā)除去溶劑，將pH調(diào)至6并用飽和度為80%硫酸銨進(jìn)行沉淀，最后將沉淀高速離心后的固態(tài)部分裝入透析袋透析濃縮，再真空冷凍干燥得獼猴桃蛋白酶。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密稱取已在105℃干燥至恒重后的酪氨酸，并用0.1mol/L鹽酸液配100μg/mL的酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，對(duì)其進(jìn)行波長(zhǎng)掃描。以儲(chǔ)備液配0～100μg/mL的11個(gè)等梯度酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液并在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度，以酪氨酸量為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 酶活相關(guān)定義 以特定條件下每分鐘水解酪蛋白生成1μg酪氨酸所需的酶量為一個(gè)活力單位(U)，以單位酶的活力即酶比活表示酶蛋白活性大小(U/μg)。

1.2.4 酶活測(cè)定 用分光光度法［9］，即稱1.2.1所得酶0.015g，以磷酸緩沖液定容25mL后移取20mL定容至100mL放置(供試酶液)，移取供試酶液1mL置于具塞試管中，加外加劑1mL后在(40±0.2)℃水浴中保溫10min，再移取同溫保存的酪蛋白液5mL混勻反應(yīng)10min后加同溫保存三氯乙酸溶液5mL終止反應(yīng)并搖勻過(guò)濾，以供試酶液、外加劑和三氯乙酸的乙酸－乙酸鈉緩沖液等反應(yīng)10min后加酪蛋白液的濾液作對(duì)照，0.1mol/L鹽酸液為空白，在最大吸收波長(zhǎng)測(cè)定其吸光度。酶比活計(jì)算式為:

(2)Do not say that for which you lack adequate evidence.

式中，A為供試酶反應(yīng)混合液與對(duì)照液的吸光度差;AS和CS分別為酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度與濃度(μg/mL);12為反應(yīng)混合液毫升數(shù)，1為供試酶液毫升數(shù);n為供試酶的酶液稀釋倍數(shù);10為反應(yīng)時(shí)間(min);m為供試酶質(zhì)量(μg)。

1.2.5 酶動(dòng)力學(xué) 分別以不同pH的磷酸緩沖液、溫度、底物濃度等對(duì)提取的TP進(jìn)行基礎(chǔ)動(dòng)力學(xué)研究。

1.2.6 酶穩(wěn)定性 測(cè)定TP溶于不同pH緩沖液并在特定溫度下放置一定時(shí)間或一定溫度條件放置不同時(shí)間的酶活。

1.2.7 外加劑的影響 測(cè)定添加2－巰基乙醇、L－半胱氨酸、葡萄糖、硫代硫酸鈉、AA、EDTA、碘乙酸和過(guò)氧化氫等后酶的活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大波長(zhǎng)的測(cè)定

對(duì)酪氨酸標(biāo)液在200～400nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果如圖1所示。

圖1 酪氨酸吸光度掃描光譜Fig.1 Tyr absorbency scanning spectrum

由圖1可看出，酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)液的最大吸收波長(zhǎng)為282.5nm。以此波長(zhǎng)測(cè)定酪氨酸工作液所得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.0004x－0.0011，其相關(guān)系數(shù)為0.9968。

2.2 反應(yīng)條件

2.2.1 pH 以40℃的溫度對(duì)獼猴桃?guī)€基蛋白酶在pH 2.5～7.0范圍內(nèi)的酶活進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可看出，TP酶活在pH 5.5時(shí)最大，達(dá)到108U/μg，其他pH下的酶活均較小且相差不大。與以牛血紅蛋白為底物獲得的毛花獼猴桃(Actinidia eriantha)酶最適pH為3.8有較大差異［14］，其原因一是底物種類和濃度不同引起的，另外則可能與TP來(lái)源于不同的獼猴桃等因素有關(guān)，有待進(jìn)一步探討。

圖2 獼猴桃蛋白酶比活與pH的關(guān)系Fig.2 Relationship between specific activity of TP and pH

2.2.2 溫度 對(duì)40～75℃的酶液酶活(pH 5.5)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可看出，在40～65℃的溫度范圍內(nèi)，其酶活除55℃最高外其余均處于次高且相近的水平，在溫度超過(guò)65℃后的酶比活則急劇地降低至基本喪失(75℃對(duì)應(yīng)的負(fù)值意味酶被高溫完全破壞)。與毛花獼猴桃酶最適溫度43℃不同［14］，是否與酶來(lái)源、底物、激活劑、抑制劑等因素有關(guān)還有待研究。

2.2.3 底物濃度 在pH 5.5和55℃的溫度下測(cè)定不同底物濃度下的酶活，其Lineweaver－Burk曲線與回歸曲線如圖4所示。

圖3 獼猴桃蛋白酶比活與溫度的關(guān)系Fig.3 Relationship between specific activity of TP and temperature

圖4 底物濃度對(duì)酶反應(yīng)速率影響的雙倒數(shù)曲線Fig.4 Effect of the substrate concentration on the enzyme reaction rate

由圖4酪蛋白底物對(duì)酶反應(yīng)速率影響的雙倒數(shù)曲線可求得，獼猴桃?guī)€基蛋白酶的Km為 6.56×10－3mmol，Vmax為163.93mg·mL－1·min－1。此與毛花獼猴桃蛋白酶對(duì)牛血紅蛋白底物的Km值5.56×10－3mmol較接近［14］。

2.3 酶穩(wěn)定性

2.3.1 時(shí)間穩(wěn)定性 在4℃下放置不同時(shí)間酶液恢復(fù)至最佳酶促反應(yīng)條件(55℃和pH 5.5)下的酶活力，酶活變化見(jiàn)圖5。

圖5 獼猴桃蛋白酶比活與時(shí)間的關(guān)系Fig.5 Relationship between specific activity of TP and time

由圖5可看出，隨存放時(shí)間的延長(zhǎng)酶活力呈較快的降低趨勢(shì)，經(jīng)96h后僅保存約50%的酶活性。有可能是高水分環(huán)境增加了酶結(jié)構(gòu)的柔性而致酶緩慢地發(fā)生自身水解和構(gòu)象變化，進(jìn)而使酶的巰基、氨基、色氨酸殘基和組氨酸殘基等也被逐漸暴露致酶失活不斷加深［15－16］。

2.3.2 pH穩(wěn)定性 將調(diào)不同pH的酶液于4℃放置1h后再調(diào)至最佳酶促反應(yīng)條件下進(jìn)行酶活測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 pH對(duì)獼猴桃蛋白酶穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of the stability of TP with different pH

由圖6可看出，在不同pH的溶液中的獼猴桃蛋白酶的活力保存率有較大差異，其中，在pH 3.5左右酶活力保存率最大，約可達(dá)最大酶活的80%，但最適pH條件下的酶活力保存率約為25%?？傊?，較酶反應(yīng)最適pH更低的條件(pH在2.5～4.5之間)有利于TP的活性保持，可能這種條件更利于TP結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定［15－16］。

2.4 外加劑的影響

幾種外加劑對(duì)酶活的影響分別見(jiàn)表1和圖7。

表1 外加劑對(duì)獼猴桃蛋白酶活的影響Table 1 The effect of differente additives to the activity of TP

由表1可看出，L－半胱氨酸、硫代硫酸鈉、2－巰基乙醇、葡萄糖、EDTA對(duì)TP有一定的激活作用，且以EDTA的激活作用最強(qiáng)，AA、碘乙酸和過(guò)氧化氫對(duì)TP有抑制作用，且過(guò)氧化氫的抑制作用最強(qiáng)。其可能原因是硫代硫酸鈉可對(duì)游離的巰基進(jìn)行保護(hù)［16］，2－巰基乙醇能夠?qū)⒚阜肿又械亩蜴I還原成自由巰基，與AA對(duì)菠蘿蛋白酶活沒(méi)有提高相一致［15］，其機(jī)理有待進(jìn)一步探討。

圖7 獼猴桃蛋白酶比活與EDTA濃度的關(guān)系Fig.7 Relationship between specific activity of TP and EDTA concentration

由圖7可看出，不同的EDTA濃度對(duì)酶活的影響不同，酶活在低濃度時(shí)隨EDTA濃度的增大而增大，且在EDTA濃度為0.1mol/L時(shí)達(dá)最大，之后則隨濃度繼續(xù)增大而酶活急劇下降。適量的EDTA并不影響酶分子且還可螯合金屬離子而使其酶活增大，當(dāng)EDTA過(guò)量，則其電荷使酶分子過(guò)分伸展，而不利于其催化作用的發(fā)揮［17］。

3 結(jié)論

海沃特獼猴桃?guī)€基蛋白酶在pH為5.5、溫度為55℃和EDTA濃度為0.1mol/L條件下的酶活最大，以酪蛋白為底物測(cè)得的Km值為6.56×10－3mmol，其Vmax值為163.93mg·mL－1·min－1。

在4℃存放的獼猴桃?guī)€基蛋白酶液，其酶活隨時(shí)間延長(zhǎng)急劇降低，但適宜的酸性環(huán)境利于減緩酶活降低。2－巰基乙醇、L－半胱氨酸、硫代硫酸鈉、葡萄糖、EDTA等對(duì)TP有一定的激活作用，而AA、碘乙酸和過(guò)氧化氫則對(duì)TP有一定的抑制作用。

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Catalytic characteristics and stability of thiol protease from Hayward kiwifruit

ZHANG Qian1，CHEN Yan1，2，*，LIN Xiao－yan1，2，LIN Jin－feng1
(1.School of Material Science and Engineering，Southwest University of Science and Technology，Mianyang 621010，China;
2.Engineering Research Center of Biomass Materials，Ministry of Education，Mianyang 621010，China)

The kinetics of thiol protease(TP)from defective Hayward fruits were investigated，as well as the impact of some additives on the activity and stability of enzyme solution.The results showed that Kmvalue of TP was 6.56× 10－3mmol，casein as substrate，and its Vmaxwas 163.93mg·mL－1·min－1.The optimum conditions of TP reactions were 55℃ and pH 5.5 at 1.0g/L casein concentration.The additives such as L－cysteine，2－mercaptoethanol (2－ME)，sodium thiosulfate，EDTA and glucose had significant promotion effect on TP activity，among which EDTA exhibited the best activation.However，the addition of ascorbic acid(AA)，iodoacetic acid and hydrogen peroxide had inhibitory effect.Under the optimum enzymatic reaction conditions，the activity of protease had a sharp drop when storage time of protease solution increased at 4℃.The drop was least when pH was 3.5，and about 80%of the activity could still be reserved.

kiwifruit;thiol protease;catalysis;inhibitor;activator

TS255.1

A

1002－0306(2012)06－0205－04

2011－06－10 *通訊聯(lián)系人

張倩(1986－)，女，在讀碩士研究生，研究方向:應(yīng)用化學(xué)。

四川省科技廳科技支撐項(xiàng)目(2011NZ0004)。