不同方法提取沙海蜇皮膠原蛋白的對比分析

陶 宇，李志皓，侯 虎，王珊珊，李八方

（中國海洋大學食品科學與工程學院海洋生物活性物質(zhì)實驗室，山東青島 266003)

不同方法提取沙海蜇皮膠原蛋白的對比分析

陶 宇，李志皓，侯 虎，王珊珊，李八方*

（中國海洋大學食品科學與工程學院海洋生物活性物質(zhì)實驗室，山東青島 266003)

以沙海蜇皮為實驗原料，分別用胃蛋白酶提取法、熱水提取法和酸提取法進行了膠原蛋白的提取，得到酶溶性膠原蛋白（PSC)、熱水抽提膠原蛋白（HEG)和酸溶性膠原蛋白（ASC)，并分析了三種膠原蛋白的理化性質(zhì)及功能特性。結(jié)果表明：PSC、HEG和ASC中羥脯氨酸含量分別為5.77%，5.53%和9.20%;平均分子量分別為34、52、38ku。紫外圖譜掃描和紅外掃描光譜表明，三種方法提取的膠原蛋白結(jié)構(gòu)相似，但略有差別。PSC、HEG、ASC乳化指數(shù)依次為：5.07、25.90、3.26m2/g;穩(wěn)定性依次為：24.68、21.89、88.5min。吸濕性和保濕性最好的樣品均為PSC。

沙海蜇，膠原蛋白，提取，性質(zhì)

沙海蜇（Stomolophus meleagris L.Agssiz)屬于刺胞動物門、水母亞門、缽水母綱、根口水母目、口冠水母科、口冠水母屬。近年來，沙海蜇的資源越來越豐富，但由于沙海蜇收獲期短，含水量高，易自溶，加工方法單一，大量的沙海蜇因未及時處理而腐敗，造成資源的浪費和環(huán)境的污染。因此，沙海蜇產(chǎn)業(yè)鏈加工的多樣化以及沙海蜇的高值化利用的研究引起了人們的關(guān)注。除水分以外，蛋白質(zhì)是沙海蜇的主要成分，膠原蛋白作為沙海蜇的主要蛋白成分之一，其功能性質(zhì)和生物活性的研究成為熱點[1-2]。近幾年來，國內(nèi)外對膠原蛋白的提取及純化進行了大量研究。錢曼[3]等對熱力法和酶法提取的魚鱗膠原蛋白性質(zhì)進行研究，結(jié)果表明：酶解法提取的膠原蛋白吸水性和起泡性大于熱力法提取的，但其保水能力、乳化性和乳化穩(wěn)定性小于熱力法提取的。此外，易繼兵[4]等人對獅子魚皮膠原蛋白的提取及理化性質(zhì)進行了研究;張綿松[5]等對海蜇皮水解條件進行了研究。常見的膠原蛋白的提取工藝主要有熱水提取法、酸提取法、堿提取法和酶提取法等，但關(guān)于哪種提取方法更適合沙海蜇膠原蛋白的提取，目前的文獻鮮有報道。熱水提取法是原料經(jīng)過前處理后，在一定條件下用熱水浸提，從而得到水溶性膠原蛋白;酸提取法即是利用特定濃度的酸在一定條件下提取膠原蛋白，常用的酸有鹽酸、檸檬酸、乳酸和醋酸等;堿法提取，一般是將樣品勻漿后，用一定濃度的NaOH溶液提取;酶法提取，即利用某種蛋白酶在一定條件下提取膠原蛋白，通常使用的酶有中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶等。原料經(jīng)過不同的前處理后，加入不同的酶提取得到酶溶性膠原蛋白[6]。以相同原料制備的膠原蛋白可能由于不同的制備方法而具有不同的分子量和理化性質(zhì)，因而適用于不同的應用領(lǐng)域[7]。本研究探求酶法，酸法，熱水法三種不同的方法對沙海蜇皮膠原蛋白進行提取，并對三種膠原蛋白的性質(zhì)進行比較分析，以對其在不同領(lǐng)域的高值化利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鹽漬沙海蜇皮（沙海蜇傘部) 青島利群超市;溴化鉀 光譜純，天津博天勝達科技有限公司;牛血清蛋白、VB12、谷胱甘肽 色譜純，Sigma公司;冰醋酸、氫氧化鈉、氯胺T、SDS、高氯酸 分析純，天津市博迪化工有限公司。

BR4i型冷凍離心機 Jouna公司出品;DS-1型高速組織搗碎機 上海標本模型廠生產(chǎn);Aglient 1100型高效液相色譜 美國安捷倫科技有限公司出品;UV-2102PC型紫外可見分光光度計 尤尼柯上海儀器有限公司出品;Nicolet nexos型傅立葉變換紅外光譜儀 美國Nicolet公司出品。

1.2 實驗方法

1.2.2 酶法提取膠原蛋白[8]將預處理的沙海蜇加入0.5mol/L醋酸勻漿，然后加入海蜇質(zhì)量5‰的胃蛋白酶攪拌均勻，于4℃下攪拌2d，9000r/min離心后取上清液，加入NaCl至濃度為0.9mol/L，靜置過夜后8000r/min離心。棄上清液，將沉淀用少量0.5mol/L醋酸復溶后移入透析袋，用0.02mol/L磷酸氫二鈉透析2d。將透析后的液體8000r/min離心，沉淀用0.5mol/L的醋酸復溶后，用蒸餾水透析3d。收集透析液體凍干得酶溶性膠原蛋白PSC。

1.2.3 熱水法提取膠原蛋白[8]將預處理的沙海蜇勻漿后，于70℃熱水提取4h。冷卻后，8000r/min離心15min，取上清液，凍干得熱水抽提膠原蛋白HEG。

1.2.4 酸法提取膠原蛋白[8]將預處理的沙海蜇加入0.5mol/L醋酸勻漿，料液比（W∶V)為1∶4，于4℃下攪拌2d。9000r/min離心后取上清液，用蒸餾水透析3d，每8h更換一次蒸餾水。將透析后液體收集，凍干得酸溶性膠原蛋白ASC。

1.2.5 羥脯氨酸含量測定[9]

1.2.5.1 標準曲線的制作 配制10μg/mL的羥脯氨酸溶液。取0、0.4、0.8、1.2、1.6、2mL標準溶液于各試管中，用蒸餾水補足到2mL。各試管加入1mL氯胺T，室溫下放置20min。再加入1mL發(fā)色劑充分混合后，將試管置于60℃水浴15min。在流動自來水下冷卻試管3min。測定560nm處吸光值。

1.2.5.2 樣品測定 取適量樣品放入安培瓶中，加入3mL 6mol/L HCl，酒精噴燈封口后于130℃下水解4h。調(diào)節(jié)pH后用蒸餾水定容至100mL。取其中的2mL，此后操作同標準曲線的制作方法。

1.2.6 分子量分布測定 取牛血清蛋白、VB12、谷胱甘肽及膠原蛋白樣品各1mg，分別溶于1mL的純水中，用0.45nm微孔濾膜過濾后進樣。色譜條件：色譜柱：TSK GEL G3000PWXL;流動相：乙腈與0.2%TFA混合溶液，體積比1∶ 1;流速：0.5mL/min;紫外檢測波長：225nm。

水產(chǎn)科技系建立并利用微信、微博、QQ、pu平臺，設(shè)立“水產(chǎn)青年”公眾號、“水產(chǎn)黨員教師”微信群等，及時向師生推送黨章、黨史、國家大政方針、習總書記系列講話、先進事跡和行業(yè)產(chǎn)業(yè)的各類咨詢等。傳播正能量，其中水產(chǎn)青年公眾號推送700篇，累計訪問閱讀量近10萬次。

1.2.7 紫外全光譜掃描 取凍干后樣品各5mg，溶于5mL 0.5mol/L醋酸中，在200～400nm進行紫外全光譜掃描。

1.2.8 傅立葉變換紅外光譜（FTIR)分析 在紅外燈的照射下，將適量的樣品和KBr混合均勻，研磨成粉末狀。取出樣品壓成片，將樣品放進樣品室。用傅立葉變換紅外光譜儀（FTIR)在4000～400cm-1區(qū)間范圍內(nèi)掃描，分辨率設(shè)為2cm-1。

1.2.9 乳化性和乳化穩(wěn)定性[10]濃度10mg/mL的膠原蛋白溶液22.5mL與7.5mL的大豆色拉油混合，然后用高速組織分散機以22000r/min乳化1min，用微量進樣器迅速從底部取50μL乳化液與5mL的0.1%SDS混合均勻，在500nm處測定其吸光值，用0.1%的SDS做空白對照。樣品的乳化性（Emulsifying Activity Index，EAI)與乳化穩(wěn)定性（Emulsifying Stability Index，ESI)計算公式如下：

式中：A0為0min的吸光值;A10為乳化液10min后測定的吸光值;L為比色皿光徑0.01m;N為稀釋倍數(shù) 100;C為乳化液形成前蛋白質(zhì)水溶液中蛋白質(zhì)濃度單位g/m3;Φ是乳化液中油的體積分數(shù)為0. 25;△t為10min。

1.2.10 吸濕性和保濕性[11]

1.2.10.1 吸濕性測定 在相同大小的稱量瓶中，精確稱取0.5g樣品，以甘油作為對照，置于盛有飽和（NH4)2SO4（相對濕度81%)的密閉干燥器中。每隔一定時間取出稱重，記錄其重量的變化并計算吸濕率。

吸濕率（%)=（吸濕后的重量-吸濕前重量)/吸濕前重量×100

1.2.10.2 保濕性測定 在相同大小的稱量瓶中精確稱取0.5g樣品，以甘油作為對照，同時在稱量瓶加入樣品質(zhì)量的10%的蒸餾水，分別置于盛有無水硅膠的密閉干燥器中，每隔一定時間取出稱重，記錄其重量的變化并計算水分殘留率。

水分殘留率（%)=（樣品初始含水量-放置后樣品含水量)/樣品初始含水質(zhì)量×100

2 結(jié)果與討論

2.1 羥脯氨酸含量和平均分子量的比較

表1 膠原蛋白羥脯氨酸含量和平均分子量比較Table 1 The hydroxyproline content and the average molecular weight of collagen

羥脯氨酸是膠原蛋白的特征氨基酸，故一般通過測定羥脯氨酸含量來確定膠原蛋白的含量[12]。從表1中可以看出，PSC和HEG中羥脯氨酸含量較ASC低，因此酸法提取能得到較高純度的膠原蛋白。這可能是由于海蜇皮中含有較多的肌原纖維蛋白和肌漿蛋白，而大多數(shù)肌原纖維蛋白和肌漿蛋白為堿溶性蛋白，在酸性條件下不容易溶出所致。所以，酸法提取的膠原蛋白能得到較高的純度，而酶法和熱水提取由于破壞了膠原蛋白的空間結(jié)構(gòu)，提高了膠原蛋白的得率的同時造成了肌原纖維蛋白和肌漿蛋白的溶出，影響了所提取膠原蛋白的純度。

HEG同ASC和PSC相比，平均分子量較大。這可能是由于蛋白酶和酸溶液的影響，在酶法提取和酸法提取過程中造成了膠原蛋白分子在一定程度上發(fā)生降解。

2.2 紫外全光譜掃描

圖1 紫外全光譜掃描Fig.1 The ultraviolet absorption spectra of collagens from jellyfish

由于膠原蛋白不含色氨酸和苯丙氨酸等芳香族氨基酸，因此在280nm處無明顯吸收峰。而由于膠原蛋白含有脯氨酸和羥脯氨酸，其吸收峰在230nm左右[13]。從圖1可以看出，PSC的最大吸收峰為236.2nm;HEG的最大吸收峰為235.8nm;ASC的最大吸收峰為233.9nm。這符合膠原蛋白的特征吸收，其中PSC、HEG同ASC相比，在240nm到280nm有比較明顯的吸收，這可能是由于PSC中含有其他蛋白雜質(zhì)所致。

2.3 三種提取膠原蛋白方法的紅外光譜掃描

圖2 膠原蛋白紅外掃描圖Fig.2 FTIR spectrogram of collagen from jellyfish

圖2為膠原蛋白的紅外光譜掃描圖。從圖2可知，三種方法提取的膠原蛋白紅外圖譜基本一致。其中N-H伸縮振動產(chǎn)生的酰胺A的吸收通常在3400～3440cm-1，當含有N-H基團的分子肽段參與氫鍵的形成時，N-H的伸縮振動會向低頻率移動，通常在3300cm-1左右。PSC，HEG和ASC的酰胺A吸收峰分別為3319、3306和3315cm-1，符合酰胺A的特征吸收，表明所提取的三種膠原蛋白分子中存在氫鍵。三種膠原蛋白的酰胺B吸收分別在2932、2936和2929cm-1。酰胺Ⅰ帶的特征吸收波數(shù)通常在1625～1690cm-1，是由蛋白質(zhì)多肽骨架的C=O伸縮振動產(chǎn)生，為蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)變化的敏感區(qū)，常被用于蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)分析。三種方法提取的膠原蛋白最強吸收峰在1652cm-1左右，符合酰胺Ⅰ帶的出峰位置。膠原蛋白酰胺Ⅱ帶的吸收在1500～1600cm-1，而三種樣品酰胺Ⅱ帶的吸收頻率為1540cm-1左右。酶法提取膠原蛋白酰胺Ⅲ帶的吸收峰為1238cm-1，而熱水提取和酸法提取所得膠原蛋白的酰胺Ⅲ帶吸收峰分別為1239cm-1和1240cm-1。

2.4 乳化性和乳化穩(wěn)定性

圖3 膠原蛋白乳化指數(shù)和乳化穩(wěn)定性的比較Fig.3 Comparison of emulsifying activity index and emulsion stability index of collagens

經(jīng)測定PSC、HEG、ASC的EAI分別為5.07、25.90、3.26m2/g;ESI分別為24.68、21.89、88.5min。從圖3可以看出，HEG乳化性明顯高于ASC和PSC。這可能是由于HEG的分子量高于PSC和ASC所致。乳化穩(wěn)定性大小依次為：ASC＞PSC＞HEG。

2.5 吸濕性曲線

從圖4能夠看出，三種方法提取的膠原蛋白的吸濕率隨時間變化曲線類似。膠原蛋白的吸濕效果明顯小于甘油的吸濕效果。由于制備方法的差異，PSC、HEG和ASC暴露的親水集團存在差異，造成了膠原蛋白的吸濕性PSC＞HEG＞ASC。

圖4吸濕曲線Fig.4 Moisture-absorption curve注：相對濕度81%。

樣品的保濕性也與樣品的結(jié)構(gòu)和暴露的親水基團有關(guān)。從圖5中看出甘油的保濕效果最好，PSC保濕效果相對優(yōu)于ASC和HEG。

3 結(jié)論

圖5 水分殘留率曲線Fig.5 Moisture retention rate curve注：相對濕度0%。

本研究以沙海蜇為原料，討論了提取膠原蛋白常用的三種方法（酶法提取、熱水提取和酸法提取)所得膠原蛋白的理化性質(zhì)。結(jié)果表明三種方法得到的膠原蛋白結(jié)構(gòu)相似。酸法提取可以得到純度較高的膠原蛋白，其羥脯氨酸含量高于PSC和HEG，并且ASC具有良好的乳化穩(wěn)定性。HEG分子量相對較大，且具有良好的乳化性。其吸濕性由強到弱依次為PSC＞HEG＞ASC，保濕性最好的樣品為PSC。實驗結(jié)果提示，采用酶法提取、熱水提取和酶法提取的海蜇膠原蛋白由于具備不同的理化性質(zhì)而分別適用于不同的應用領(lǐng)域。

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Comparative analysis of collagen prepared from jellyfish by different extraction methods

TAO Yu，LI Zhi-hao，HOU Hu，WANG Shan-shan，LI Ba-fang*
（College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266003，China)

Jellyfish was used as the raw materials in this study.The hot water extraction gelatin（HEG)，pepsinsolubilized collagen（PSC)and acid-soluble collagen（ASC)was isolated from jellyfish by hot water，enzyme hydrolysis extraction methods and acid extraction methods.Physic-chemical and functional properties were investigated and compared.Results showed that the contents of hydroxyproline content of PSC，HEG and ASC were 5.77%，5.53%and 9.2%，respectively.The average molecular weights were 34，52 and 38ku.The ultraviolet absorption spectra and FTIR spectrogram showed that PSC，HEG and PSC had similar structures.The sequence of emulsifying properties of PSC、HEG、ASC were 5.07，25.90，3.26m2/g.The sequence of emulsify stability of PSC、HEG、ASC were 24.68、21.89、88.5min，PSC had better hygroscopicity and moisture retention property.

jellyfish;collagen;extraction;property

TS254.4

B

1002-0306（2012)14-0310-04

2011－12－13 *通訊聯(lián)系人

陶宇（1988-)，女，碩士研究生，研究方向：沙海蜇膠原蛋白護膚活性。

海洋公益專項（201105029)。