北蟲草菌絲發(fā)酵液和子實體抗氧化活性測定

鄭劍玲，齊 賀，黃竹青，吳素琴，張中林，王美惠

(遼寧衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院免疫微生物教研室，遼寧 沈陽 110101)

超氧化物歧化酶(SOD)是廣泛存在于生物體內(nèi)重要的超氧陰離子自由基清除劑，保護(hù)細(xì)胞免受損傷。丙二醛(MDA)是氧自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸后形成的脂質(zhì)過氧化物，含量的高低間接反應(yīng)了機(jī)體受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。二者對機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著重要的作用。目前可利用SOD資源主要為動物血液、組織、高等植物以及微生物發(fā)酵產(chǎn)物［1］。北蟲草是食藥兩用真菌，具有抗氧化、增強(qiáng)免疫能力等作用，有關(guān)蟲草類真菌SOD的報道多集中于菌絲體及子實體中SOD的檢測［2-4］，但未見液體發(fā)酵液培養(yǎng)基中SOD活性和含量的研究。筆者采集野生北蟲草菌種進(jìn)行培育，選擇不同發(fā)酵時間的北蟲草發(fā)酵液培養(yǎng)基檢測SOD及MDA，并比較由不同發(fā)酵時間的發(fā)酵液培育出的子實體SOD酶活性有無差異，觀察不同培養(yǎng)階段的北蟲草發(fā)酵液抗氧化活性，以期為開發(fā)利用發(fā)酵液-培養(yǎng)基中SOD資源打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 采集于棋盤山地區(qū)蠶蛹寄生北蟲草。

1.1.2 實驗儀器和主要試劑 紫外可見分光光度計UV755B，上海精密科學(xué)儀器有限公司;蒸汽滅菌器LDZX-50KB，上海申安醫(yī)療器械廠;離心機(jī)80-2B，上海菲恰爾分析儀器有限公司;水浴振蕩器HZS-H，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司;勻漿器JT-C，漯河市金田試驗設(shè)備研究所;恒溫水浴箱HHW21 Cr600，北京長源實驗設(shè)備廠;SOD測試盒，南京建成生物工程研究所;無水乙醇、冰醋酸，分析純，沈陽第一試劑廠;氯仿，分析純，天津化學(xué)試劑廠。

1.2 方法

1.2.1 野生菌種分離培養(yǎng) 采集新鮮北蟲草子座表面消毒，無菌水沖洗后無菌操作剪下0.1～0.2 cm小段子實體接種于斜面PDA培養(yǎng)基中，22℃恒溫箱培養(yǎng)。待組織塊周圍長滿新菌絲后轉(zhuǎn)管培養(yǎng)。液體振蕩培養(yǎng)，肉湯、沙保羅培養(yǎng)基，160 r/min，20℃培養(yǎng)期間觀察菌絲生長情況。

1.2.2 培育子實體 配制營養(yǎng)液，成分含量:KH2PO43 g，MgSO41.5 g，蛋白胨3g，葡萄糖20 g，VB11片，蒸餾水1000 mL。配制小麥固體培養(yǎng)基，按發(fā)酵液體菌種與營養(yǎng)液1∶5比例接種至固體培養(yǎng)基中，500 mL瓶裝培養(yǎng)，經(jīng)接種、發(fā)菌、轉(zhuǎn)色、出草培養(yǎng)55 d后采收新鮮子實體。

1.2.3 酶液的制備 分別取適量發(fā)酵5、7、15 d的北蟲草發(fā)酵液，對照組為本室保存3.5個月的發(fā)酵液，3000 r/min分別離心10 min，取上清4 mL，加入適量無水乙醇。振混1 min，再加入適量氯仿，振混1 min，3000 r/min離心10 min，上層則為酶粗液。新鮮子實體剪碎勻漿后同法制備酶粗液。

1.2.4 發(fā)酵液-培養(yǎng)基總SOD活力計算 用黃嘌呤氧化酶法測發(fā)酵液SOD活力，發(fā)酵液-培養(yǎng)基取400 μL 時，反應(yīng)體系體積為 1.7 mL，酶的百分抑制率為51%，與酶的活力呈成正比曲線關(guān)系，即選取400 μL作為最佳取樣量。按SOD測試盒說明書操作，用721分光光度計進(jìn)行比色，波長選擇550 nm，測吸光度。以每毫升反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時所對應(yīng)的SOD量為1個SOD活力單位(U)。發(fā)酵液-培養(yǎng)基總SOD活力計算公式:總SOD活力(U/mL)=((對照管吸光度－測定管吸光度)/對照管吸光度)÷50% ×反應(yīng)體系稀釋倍數(shù)×樣本測試前的稀釋倍數(shù)。

1.2.5 發(fā)酵液-培養(yǎng)基丙二醛(MDA)測定 硫代巴比妥酸(TBA)法測定發(fā)酵液-培養(yǎng)基中MDA含量。發(fā)酵液-培養(yǎng)基取400 μL，配制測定管、標(biāo)準(zhǔn)管、及各自空白管溶液，各反應(yīng)體系體積均為4.4 mL，旋渦混合器混勻，95℃水浴40 min，流水冷卻，4000 r/min離心10 min，取上清，532 nm處，1 cm光徑，蒸餾水調(diào)零，測各管OD值。計算公式:MDA含量(nmol/mL)=((測定管OD值－測定空白管OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)管OD值－標(biāo)準(zhǔn)空白管OD值))×標(biāo)準(zhǔn)管濃度×樣本測試前稀釋倍數(shù)。

1.2.6 子實體蛋白濃度的測定 采用考馬斯亮蘭蛋白測定法，子實體稱重，4倍生理鹽水稀釋，制備成20%的組織勻漿，3000 r/min離心15 min，測定管樣品0.05 mL、標(biāo)準(zhǔn)管為同體積的0.563 g/L標(biāo)準(zhǔn)液，蒸餾水為空白管，各管加入考馬斯亮蘭顯色劑3 mL，混勻，靜置10 min，595 nm波長處，1 cm光徑，蒸餾水調(diào)零，測各管OD值。蛋白濃度(g/L)=((測定管OD值－空白管 OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)管 OD值 －空白管 OD值))×標(biāo)準(zhǔn)管濃度(0.563 g/L)。

1.2.7 子實體中總SOD活力計算 測定管取樣品50 μL按說明書加入各試劑后與顯色劑反應(yīng)，用721分光光度計進(jìn)行比色，波長選擇550 nm，測吸光度。以每毫克組織蛋白在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時所對應(yīng)的SOD量為1個SOD活力單位(U)。計算公式:總SOD活力(U/mg)=((對照管吸光度－測定管吸光度)/對照管吸光度)÷50% ×(反應(yīng)液總體積/取樣量)÷待測樣本蛋白濃度。

1.2.8 統(tǒng)計 采用軟件SPSS13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。3組比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD，以P﹤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同時期發(fā)酵液-培養(yǎng)基總SOD活力

表1結(jié)果顯示，不同發(fā)酵時期發(fā)酵液-培養(yǎng)基SOD活力有所不同，各時間段之間進(jìn)行比較，差異皆有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);15 d時的發(fā)酵液-培養(yǎng)基SOD活力最多，3.5個月時的最少。

表1 不同時期發(fā)酵液-培養(yǎng)基總SOD活力比較()Table 1 Fermentation liquid-medium SOD vitality comparison in different period()

表1 不同時期發(fā)酵液-培養(yǎng)基總SOD活力比較()Table 1 Fermentation liquid-medium SOD vitality comparison in different period()

注:5 d與15 d比較，△為差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);與3.5個月的值相比較，*為差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，下表同

時間 例數(shù) 吸光度值 總SOD活力/(U·mL－1)(F=59.747) (F=17.545)5 d 10 0.460 ±2.310△＊ 7.500 ±0.881△＊15 d 10 0.295 ±3.729* 9.205 ±1.176*3.5 個月10 0.244 ±6.233 6.361 ±1.139

2.2 不同時期發(fā)酵液-培養(yǎng)基丙二醛(MDA)測定

表2 不同時期發(fā)酵液-培養(yǎng)基MDA測定)Table 2 Fermentation liquid-medium MDA determination in different period()

表2 不同時期發(fā)酵液-培養(yǎng)基MDA測定)Table 2 Fermentation liquid-medium MDA determination in different period()

時間 例數(shù) 吸光度值 MDA/(nmol·mL－1)(F=19.788) (F=83.965)5 d 10 0.128 ±1.316△ 4.104 ±0.320△＊15 d 10 0.197 ±4.272* 8.184 ±0.923*3.5 個月10 0.134 ±1.031 7.013 ±0.692

15 d時的發(fā)酵液-培養(yǎng)基MDA含量最多，與5 d和保存3.5個月的發(fā)酵液-培養(yǎng)基MDA含量相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，發(fā)酵5 d和保存3.5個月的MDA含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

2.3 子實體中總SOD活力計算

表3 子實體中總SOD活力結(jié)果)Table 3 Result of Fruitbodies SOD vitality)

表3 子實體中總SOD活力結(jié)果)Table 3 Result of Fruitbodies SOD vitality)

時間 例數(shù) 吸光度值 酶活力 蛋白含量 總SOD 活力(F=0.211) /(U·mL－1) /(mg·mL－1) /(U·mg－1)(F=1.070)5 d 10 0.159 ±3.833 1.620 ±2.302 0.654 ±3.342 53.523 ±9.32815 d 10 0.161 ±2.525 1.527 ±2.246 0.639 ±2.427 63.782 ±24.9493.5 個月 10 0.152 ±2.621 1.539 ±2.185 0.563 ±2.794 53.392 ±15.621

結(jié)果顯示，子實體發(fā)酵各時間點(5 d、15 d、3.5個月)的吸光度值、酶活力、蛋白含量、總SOD活力差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

3 討論

機(jī)體內(nèi)自由基產(chǎn)生過多或消除能力降低會導(dǎo)致各種疾病如炎癥、癌癥、衰老等，適量補(bǔ)充外源性抗氧化藥物或給予能促使機(jī)體內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)恢復(fù)到一定水平的藥物越來越受到人們的關(guān)注。北蟲草是食藥兩用真菌，含有的SOD酶可抑制人體內(nèi)過氧化脂質(zhì)的生成和清除衰老產(chǎn)物(氧化自由基)［5］。以往的實驗研究多集中在對菌絲體和子實體的SOD酶活性觀察。

本實驗觀察到不同發(fā)酵時期的菌絲體發(fā)酵液具有SOD活性，且不同發(fā)酵時期其含量有所不同，在液體發(fā)酵的第5天和第15天，隨時間延長SOD、MDA含量皆逐漸增加。導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因可能是隨著受氧自由基損傷程度的增加才促使北蟲草分泌更多的SOD酶。發(fā)酵液-培養(yǎng)基中SOD活性可能是菌絲體分泌至胞外，在一定時間范圍內(nèi)，時間越長分泌至胞外的越多，當(dāng)菌絲體SOD酶分泌殆盡時(3.5個月)，發(fā)酵液-培養(yǎng)基中SOD不再無限量增長，活性反而有所降低。確定人工培育北蟲草發(fā)酵液-培養(yǎng)基SOD活性最強(qiáng)發(fā)酵時間還需取多個時間點進(jìn)行檢測和觀察。

北蟲草子實體中SOD未受液體發(fā)酵時間影響，說明在培育過程中固體培養(yǎng)基的養(yǎng)分對子實體來說更重要，SOD活性由菌絲體隨著對固體小麥培養(yǎng)基的吸收而轉(zhuǎn)化至子實體中。至于同一菌種的菌絲體和子實體中SOD活性的高低比較需要對液體發(fā)酵和固體培養(yǎng)的條件做進(jìn)一步的考察。

本實驗表明北蟲草菌絲體的發(fā)酵液中含有SOD活性，由于液體發(fā)酵培養(yǎng)菌絲簡便，周期短的特點，易于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)，通過液體培養(yǎng)菌絲體的同時也可以在發(fā)酵液中高效地得到SOD，為有效利用蟲草資源提供實驗依據(jù)。

［1］陸玲，潘欣，袁生，等.金針菇液體培養(yǎng)菌絲與子實體SOD特性比較研究［J］.中國食用菌，1999，18(5):25-27.

［2］管代義，陳春華，孫璐瑋，等.北蟲草抗氧化作用的實驗研究［J］.中國藥學(xué)雜志，1993，28(8):473-475.

［3］王琦，薛陽.野生蛹蟲草與培植蛹蟲草SOD酶活力的對比研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36(20):8649，8722.

［4］李華為，趙素云，鐵梅.富硒蛹蟲草抗氧化作用研究［J］.食品科學(xué)，2010，31(23):61-64.

［5］徐錦堂.中國藥用真菌學(xué)［M］.北京:中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)及北京醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1997:394-400.